Iniezione di cellule progenitrici neurali fluorescenti in organoidi cerebrali umani per la modellazione dei trapianti
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:40 min • August 29th, 2025
Inizia con cellule progenitrici neurali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte o NPC marcate in fluorescenza.
Risospendere le cellule in un idrogel di matrice extracellulare per creare una miscela uniforme cellula-matrice.
Incubare la miscela con ghiaccio.
Quindi, trasferisci un organoide cerebrale umano in un piatto.
Rimuovere il terreno in eccesso e posizionare la piastra al microscopio per la procedura di iniezione.
Erogare la miscela di matrice cellulare su un vetrino sterile pre-raffreddato e aspirarla utilizzando una siringa pre-raffreddata.
Iniettare lentamente la miscela sulla superficie dell'organoide per ridurre al minimo la rottura dei tessuti.
Lasciare riposare brevemente l'organoide, quindi aggiungere il terreno, trasferire l'organoide in una piastra a più pozzetti e incubare.
L'idrogel si solidifica, ancorando gli NPC nel sito di iniezione. Traccia gli NPC usando la microscopia a fluorescenza.
Nel corso del tempo, le NPC proliferano e migrano in regioni distanti dell'organoide, dove si differenziano in neuroni immaturi e maturi.
Ciò consente un trapianto di cellule affidabile con una minima interruzione degli organoidi, adatto per la terapia con cellule neurali.
Inizia rimuovendo dal ghiaccio la sospensione di singole cellule staminali pluripotenti indotte o cellule progenitrici neurali derivate da iPSC, o NPC, e centrifugandole a 300 g per cinque minuti a 4 gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 milligrammi per millilitro di matrice di membrana basale solubilizzata per ottenere un volume finale di due microlitri per iniezione. Riposizionare immediatamente la sospensione sul ghiaccio fino all'uso. Trasferisci la siringa pre-raffreddata dal congelatore a 20 gradi Celsius in un secchiello per il ghiaccio per un ulteriore utilizzo.
Quindi, rimuovere la piastra dell'organoide cerebrale dall'incubatore e trasferire l'organoide in un piatto da 35 millimetri utilizzando una punta a foro largo. Per stabilizzare gli organoidi e facilitare l'iniezione, rimuovere il più possibile il terreno senza danneggiare l'organoide. Posizionare la piastra da 35 millimetri contenente l'organoide sotto un microscopio da dissezione per facilitare l'iniezione.
Una volta che gli organoidi sono pronti per l'iniezione, risospendere delicatamente le cellule NPC marcate con EGFP utilizzando un puntale per pipetta P20 raffreddato e spostare due microlitri di queste cellule su un vetrino di vetro sterile pre-raffreddato. Prelevare una siringa da insulina preriempita dal ghiaccio e aspirare lentamente i 2 microlitri di sospensione cellulare con lo smusso dell'ago rivolto verso il basso. Aprire il coperchio del piatto contenente l'organoide prima di mettere a fuoco il microscopio su di esso.
Tenere il piatto con una mano, posizionare lo smusso dell'ago verso l'alto. E con l'altra mano, iniettare lentamente la cellula nella superficie dell'organoide. Dopo aver iniettato le cellule, rimettere il coperchio nel piatto e incubare l'organoide iniettato per uno o due minuti.
Quindi, aggiungere delicatamente 500 microlitri di terreno organoide alla piastra prima di trasferire l'organoide in una piastra a 24 pozzetti con una punta a foro largo. Incubare l'organoide a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica con un cambio completo del terreno ogni due giorni.
Panoramica
In questo articolo viene descritto un metodo per l'iniezione di cellule progenitrici neurali (NPC) derivate da cellule staminali pluripotenti indotte, marcate con fluorescenza, in organoidi cerebrali umani. La tecnica minimizza il danno al tessuto e consente un efficace trapianto cellulare, fondamentale per la terapia cellulare neuronale.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia delle cellule staminali
- Terapia cellulare
Sfondo
- Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) possono differenziarsi in vari tipi cellulari.
- Le cellule progenitrici neurali (NPCs) sono essenziali per lo sviluppo e il riparo del cervello.
- Gli organoidi cerebrali umani fungono da modelli per lo studio dello sviluppo cerebrale.
- Sono necessarie tecniche efficaci di trapianto cellulare per applicazioni terapeutiche.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per iniettare NPC negli organoidi cerebrali.
- Monitorare il comportamento dei NPC dopo l'iniezione mediante microscopia a fluorescenza.
- Valutare la vitalità e l'integrazione dei NPC all'interno dell'organoide.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di NPC da iPSC e risospensione in un idrogel.
- Iniezione della miscela cellula-matrice nell'organosoide mediante siringa preraffreddata.
- Monitoraggio della proliferazione e migrazione dei NPC all'interno dell'organosoide.
- Incubazione dell'organosoide in condizioni controllate dopo l'iniezione.
Risultati principali
- Gli NPC si sono integrati con successo nell'organooide con minimo disturbo.
- La microscopia a fluorescenza ha confermato la proliferazione e la migrazione degli NPC.
- Gli NPC iniettati si sono differenziati in neuroni immaturi e maturi nel tempo.
- Il metodo ha dimostrato potenzialità per applicazioni in terapia cellulare neurale.
Conclusioni
- La tecnica di iniezione sviluppata è efficace per il trapianto di NPC.
- Questo metodo può potenziare la ricerca sullo sviluppo e il riparo del cervello.
- Studi futuri potrebbero esplorare applicazioni terapeutiche nelle malattie neurodegenerative.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La modellizzazione del trapianto di cellule progenitrici neurali in organoidi cerebrali umani fornisce una piattaforma riproducibile e priva di utilizzo di animali per valutare l'integrazione e la differenziazione cellulare in contesti di malattie del sistema nervoso centrale. Questo approccio consente una valutazione predittiva delle strategie di terapia cellulare neurale nella fase preclinica di scoperta, sostenendo la riduzione dei rischi meccanicistici e la continuità traslazionale per i portafogli di neuro-rigenerazione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi del comportamento delle cellule progenitrici neurali in un modello cerebrale tridimensionale rilevante per l'uomo.
- Consente la riduzione del rischio meccanicistica monitorando la proliferazione, la migrazione e la differenziazione cellulare dopo il trapianto.
- Facilita la validazione funzionale di bersagli terapeutici per candidati alla terapia cellulare del sistema nervoso centrale.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato e riproducibile per l'iniezione e il tracciamento di cellule neurali negli organoidi.
- Fornisce output quantitativi mediante microscopia a fluorescenza per l'analisi del destino cellulare e dell'integrazione.
- Prepara sistemi di organoidi validati per analisi successive con composti chimici o screening genetici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alla modellizzazione pertinente alle malattie nei disturbi del sistema nervoso centrale utilizzando organoidi derivati da cellule umane.
- Consente una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di approcci di terapia cellulare.
- Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, modellizzando l'integrazione neurale umana ex vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta e sviluppo preclinico per la terapia cellulare del sistema nervoso centrale, costituendo un ponte tra studi meccanicistici iniziali e modellizzazione traslazionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sull'innesto e la differenziazione delle cellule neurali in un contesto umano.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili per il destino cellulare e la migrazione.
- Analisi: Permette il confronto statistico degli esiti del trapianto in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Offre una piattaforma per valutare il comportamento di cellule terapeutiche in organoidi pertinenti alle malattie.
- Riutilizzo aziendale: Offre un sistema scalabile, privo di animali, adattabile a diversi programmi di terapia cellulare del sistema nervoso centrale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nei meccanismi e nell'integrazione della terapia cellulare neurale.
- Valore operativo: Standardizza la modellizzazione del trapianto con minimo disturbo del tessuto e alta riproducibilità.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione per i candidati alla terapia cellulare del sistema nervoso centrale fornendo dati rilevanti per l'uomo in fase precoce.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione basata sul rischio delle risorse terapeutiche cellulari destinate ai disturbi del sistema nervoso centrale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali, nella manipolazione di organoidi e nelle tecniche di microiniezione.
- Necessita di accesso a microscopia a fluorescenza e a infrastrutture di incubazione controllata.
- Richiede standardizzazione tra team diversi per protocolli riproducibili di preparazione cellulare e di iniezione.
- Adattabile a diverse fonti di cellule progenitrici neurali e modelli di organoidi.
- Limitato alla modellizzazione ex vivo; la traduzione in vivo richiede ulteriore validazione.
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Ultimo aggiornamento: 29 agosto 2026