Transinfezione batterica in vitro delle cellule T tramite formazione di sinapsi immunologiche

Iniziare con pozzetti contenenti cellule T CD4⁺ che esprimono recettori specifici per il peptide dell'ovoalbumina o OVAp.

Nel pozzetto di controllo negativo, posizionare un inserto di membrana porosa.

In una provetta, prelevare le cellule dendritiche infettate da batteri e caricate con OVAp per la presentazione superficiale.

Aggiungere le cellule dendritiche direttamente nel pozzetto del test e nell'inserto nel pozzetto di controllo negativo.

Aggiungere il terreno ai pozzetti e incubare.

Nel pozzetto del test, le cellule interagiscono per formare una sinapsi immunologica, facilitando il trasferimento batterico dalla cellula dendritica alla cellula T, un processo noto come transinfezione.

Nel pozzetto di controllo negativo, la barriera di membrana impedisce l'interazione cellula-cellula, inibendo così la transinfezione.

Aggiungere l'antibiotico gentamicina ai pozzetti e incubare.

La gentamicina non può penetrare nelle cellule eucariotiche, uccidendo così solo i batteri non internalizzati mentre i batteri internalizzati sopravvivono.

Il campione di prova contenente cellule T infette e il campione di controllo con cellule T non infette sono ora pronti per l'isolamento delle cellule T e la quantificazione della transinfezione.

A una piastra di coltura da 24 pozzetti, aggiungere due milioni di cellule T CD4⁺ in un volume di 0,5 millilitri a ciascuno dei cinque pozzetti.

Successivamente, per controllare il contatto fisico, posizionare barriere trans-well in policarbonato con una dimensione dei pori di tre micrometri nel terzo e quarto pozzetto. Al primo pozzetto, aggiungere 0,1 millilitri di cellule dendritiche sovraccariche infette. Al secondo pozzetto, aggiungere 0,1 millilitri di cellule dendritiche infette non caricate.

Aggiungere 0,1 millilitri di cellule dendritiche sovraccariche infette in un pozzetto e 0,1 millilitri di cellule dendritiche infette non caricate nell'altro pozzetto. Infine, come controllo negativo, infettare direttamente il quinto pozzetto di cellule T CD4⁺ con un MOI di 10. Quindi, portare il volume totale del pozzetto fino a 0,6 millilitri con RPMI.

Incubare la piastra per 30 minuti per consentire la formazione delle sinapsi immunitarie. Dopo l'incubazione, aggiungere 100 microgrammi di gentamicina per millilitro di terreno a ciascun pozzetto e incubare per un'ora. La gentamicina è un antibiotico aminoglicosidico che non è in grado di penetrare nelle cellule eucariotiche.

Pertanto, in questa fase, l'aminoglicoside ucciderà i batteri extracellulari ma non i batteri intracellulari.