Preparazione di E. coli Spheroplasts

Prendi una coltura di E. coli .

Diluire la coltura in terreno fresco e incubarla per favorire la divisione batterica.

Successivamente, diluire la coltura in un terreno contenente un inibitore della divisione batterica e incubare.

I batteri continuano a crescere senza dividersi, formando filamenti allungati.

Trasferire la coltura in una provetta nuova, quindi centrifugare per pellettare i filamenti e rimuovere il surnatante.

Lavare il pellet con uno stabilizzatore osmotico per evitare la lisi degli sferoplasti. Rimuovere la soluzione.

Aggiungere tampone, lisozima, DNasi e un agente chelante in sequenza. Incubare.

L'agente chelante destabilizza la membrana esterna del filamento.

Il lisozima degrada lo strato esposto di peptidoglicano, causando la perdita di forma dei filamenti e la formazione di strutture sferiche chiamate sferoplasti.

Inoltre, la DNasi degrada il DNA contaminante rilasciato dai filamenti danneggiati.

Aggiungere nuovamente lo stabilizzatore osmotico, mescolare e incubare.

Trasferire la sospensione in una provetta contenente tampone e centrifuga.

Rimuovere il surnatante in eccesso e risospendere gli sferoplasti in tampone per l'analisi a valle.

Per impostare una coltura notturna,