Isolamento di batteri Gram-negativi con inserzioni genomiche di trasposoni

Inizia scongelando una coltura congelata della popolazione batterica Gram-negativa del donatore accoppiato e del ricevente su ghiaccio.

Le cellule riceventi trasportano trasposoni, brevi segmenti di DNA che includono un gene di resistenza per l'antibiotico kanamicina. Questi trasposoni sono integrati in modo casuale nel genoma ospite.

Aggiungi la coltura a una piastra di agar ricca di sostanze nutritive contenente kanamicina ma senza nutrienti specifici del donatore.

Aggiungere perline sterili e ruotare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente la coltura.

Rimuovere le perline e incubare. I batteri riceventi utilizzano i nutrienti, ma solo quelli con trasposoni integrati resistono alla kanamicina, portando alla formazione di colonie.

I batteri donatori e riceventi senza trasposoni non riescono a crescere.

Conta le unità formanti colonie per stimare il numero di batteri riceventi con inserzioni uniche di trasposoni.

Aggiungere nuovi terreni e raccogliere la popolazione batterica.

Centrifugare per pellettare i batteri e scartare il surnatante.

Risospendere il pellet in un terreno con crioprotettore per preservare la vitalità batterica.

Scongelare un'aliquota dell'accoppiamento con