Isolamento di batteri Gram-negativi con inserzioni genomiche di trasposoni

Inizia scongelando una coltura congelata della popolazione batterica Gram-negativa del donatore accoppiato e del ricevente su ghiaccio.

Le cellule riceventi trasportano trasposoni, brevi segmenti di DNA che includono un gene di resistenza per l'antibiotico kanamicina. Questi trasposoni sono integrati in modo casuale nel genoma ospite.

Aggiungi la coltura a una piastra di agar ricca di sostanze nutritive contenente kanamicina ma senza nutrienti specifici del donatore.

Aggiungere perline sterili e ruotare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente la coltura.

Rimuovere le perline e incubare. I batteri riceventi utilizzano i nutrienti, ma solo quelli con trasposoni integrati resistono alla kanamicina, portando alla formazione di colonie.

I batteri donatori e riceventi senza trasposoni non riescono a crescere.

Conta le unità formanti colonie per stimare il numero di batteri riceventi con inserzioni uniche di trasposoni.

Aggiungere nuovi terreni e raccogliere la popolazione batterica.

Centrifugare per pellettare i batteri e scartare il surnatante.

Risospendere il pellet in un terreno con crioprotettore per preservare la vitalità batterica.

Scongelare un'aliquota dell'accoppiamento congelato sul ghiaccio. Quindi, utilizzare perle di vetro sterili per distribuire 150 microlitri di diluizione, su ciascuna piastra di agar Luria-Bertani da 30 x 150 millimetri, integrata con kanamicina.

Smaltire la provetta usata contenente l'accoppiamento in eccesso e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 14 ore. Dopo l'incubazione, contare le unità formanti la colonia su ciascuna piastra per stimare il totale dei mutanti nella libreria dei trasposoni. Contare il 20% di almeno tre piastre per determinare la stima del conteggio delle colonie per l'intero gruppo di piastre.

Dopo aver calcolato la resa stimata della colonia, aggiungere da tre a cinque millilitri di LB a ciascuna piastra e raschiare via i batteri utilizzando uno strumento raschiante sterile. Estrarre le sospensioni batteriche da tutte le piastre in provette coniche da 50 millilitri e pellettare le sospensioni centrifugando a 5.000 volte G, per sette minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in cinque millilitri di LB, integrato con il 30% di glicerolo.

Quindi, fare aliquote da un millilitro della libreria dei trasposoni in crioviali e conservarle a meno 80 gradi Celsius.