Name: Sviluppo di un marcatore negativo selezionabile per Entamoeba histolytica /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-12T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Scopri il sistema di selezione negativa FCU1 per Entamoeba histolytica utilizzando il profarmaco 5-fluorocitosina. Questo metodo consente l'eliminazione selettiva delle cellule transettate e facilita la manipolazione genetica del parassita.

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Vorremmo ringraziare il Dott. Philippe Erbs per averci fornito la sequenza delle FCU1 genica. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere AI 26649.

1. FCU sistema di selezione negativa in Entamoeba histolytica <ol><li> La linea di controllo vettoriale (HM1 / pKT3M) e la linea sperimentale (HM1/pKT3M-FCU1) sono stati generati da 1,2 tecniche descritte in precedenza. Seed le linee oggetto di studio dai tubi magazzino in T-25 palloni e mantenere la selezione con l'aggiunta di antibiotico appropriato (12 mg / mL G418) in TYI-S-33 3 media. I palloni devono essere del 70-80% confluenti dopo 16-18 ore di crescita a 37 ° C. </li><li> Preparare una soluzione fresca magazzino 50mM di 5-fluorocytosine (5-FC, Sigma) nel warm TYI-S-33 di media. Vortex rigorosamente per alcuni minuti per sciogliere 5-FC completamente. Filtro-sterilizzare la soluzione madre facendola passare attraverso un filtro di 0,22 micron. </li><li> Trofozoiti raccolta mettendo i palloni in ghiaccio per 3-5 minuti e raccogliere le cellule per centrifugazione a 200xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in acqua dolce di media TYI e contare le cellule. </li><li> Progettazione di un tipico esperimento utilizza 0,5 x 10 4 cellule per pozzetto di una piastra da 48 pozzetti in un volume finale di 1 ml; e ripete tripla per ogni condizione di test. Inoltre, per facilitare le misurazioni fluorescente, un piatto a parte è usata per ogni ceppo per ogni punto del tempo. </li><li> Semi di 0,5 x 10 4 cellule per pozzetto per ogni prova 5-FC concentrazione, in triplice copia. Mantenere la pressione antibiotica selezione nel medio TYI. Ora aggiungete la quantità necessaria di 5-FC soluzione madre e trofozoiti in ciascun pozzetto. </li><li> Incubare le piastre in un sacchetto anaerobica a 37 ° C. </li></ol> 2. Determinazione della efficienza di selezione <ol><li> Preparare 2 mg / ml soluzione stock di Cell Tracker verde CMFDA (Invitrogen) in DMSO. Per rendere la soluzione di lavoro diluire lo stock di 1000 volte in mezzo privo di siero TYI. </li><li> Rimuovere il supporto completamente da piastre di coltura trofozoite e sostituire con 150 microlitri di siero senza CMFDA TYI contiene. Continua incubazione a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Rimuovere la soluzione colorante da pozzi e leggere la piastra nella spettrofluorimetro Spectramax M2 micropiastre. La lunghezza d'onda di eccitazione deve essere impostata a 492 nm e l'emissione di fluorescenza leggere a 517 nm. </li><li> Confrontare i valori di fluorescenza per le cellule di controllo rispetto al trasfettate prova. </li><li> Continua a leggere le piastre a ogni intervallo di tempo. Usa positiva appropriata (TYI solo) e negativi (25 mg / ml Hygromycin) pozzetti di controllo in ogni piatto. </li></ol> 3. Rappresentante Risultati La E. trasfettate histolytica ha mostrato l'espressione solida di FCU1 codone ottimizzato ricombinante (Figura 1). Quando questo protocollo è seguita correttamente il risultato è l'eliminazione selettiva di E. cellule che esprimono histolytica FCU1 in presenza di 0,5 mM 5-fluorocytosine. Cellule di controllo, al contrario continuano a crescere normalmente fino a 5 mM concentrazione di 5-FC e raggiungere la confluenza tra il 72 e 96 ore (Figura 2-a). Il FCU1 cellule portando a 48 ore sono completamente lisati, quando i pozzi trattati sono visti al microscopio. Questi mostrano anche diminuito fluorescenza quando colorati con il colorante vitale CMFDA, che viene utilizzato negli studi quantitativi che coinvolgono gran numero di campioni (figura 2-b). Il sistema FCU1/5-FC è uno strumento efficace e potente selezione negativa per E. histolytica trofozoiti. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Generazione di E. histolytica HM1 trasfettate che esprimono negativo marcatore (A) FCU1 proteina ricombinante è stato rilevato su un Western Blot con anticorpi anti-c Myc (pannello superiore). Come previsto, una band 42kDa poteva essere individuato (indicato da una freccia) nel lisato totale dal trasfettate FCU, ma non nel vettore solo trasfettate controllo. Il pannello in basso mostra la macchia stessa sondato con l'anticorpo contro l'actina come controllo di caricamento. (B) I risultati della PCR in tempo reale quantitativo mostrando FCU1 espressione di mRNA specifico normalizzato a lgl4 controllo. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Sensibilità ai farmaci in vitro di E. trasfettate histolytica esprimendo negativo marcatore Curve di sopravvivenza di (a) trasfettate controllo e (b) trasfettate FCU1 esprimere coltivate in 48 pozzetti. Le cellule sono state coltivate in presenza di concentrazioni crescenti del profarmaco-5-fluorocytosine; la sopravvivenza delle cellule è stata quantificata colorazione CMFDA ad ogni intervallo di tempo indicato sulla X-asse. L'asse Y rappresenta unità fluorescenza ed è un riflesso diretto della popolazione di cellule sopravvissute. Si prega di notare che la FCU1 trasfettate che esprimono mostrato sensibilità significativa a concentrazione profarmaco 0,5 mm rispetto al controllo. Le cellule non sono stati osservati a punto temporale 120h in questi pozzi come comconfrontato alla crescita confluente visto in pozzetti di controllo corrispondente al microscopio (dati non riportati). Hygro denota 25μg / mL Hygromycin utilizzato come controllo negativo.

<ol><li>Olvera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+Entamoeba+histolytica+trophozoites+by+lipofection%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection.</a> Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).</li>
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<li>Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+selection+using+yeast+cytosine+deaminase%2Furacil+phosphoribosyl+transferase+in+Plasmodium+falciparum+for+targeted+gene+deletion+by+double+crossover+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).</li>
</ol>

La produzione di questo video è stato sponsorizzato da Sigma Aldrich, Inc., che produce alcuni dei reagenti utilizzati in questo articolo.

Anche se ci sono stati progressi sostanziali in Entamoeba strumenti molecolari biologici non esistono metodi attualmente disponibili per eliminare o interrompere geni 4. Knockdown di espressione genica specifici è stato raggiunto con l&#39;uso di RNA a gomito 5, piccoli RNA interferenti 6 e batteri espresso dsRNA 7. Tuttavia questi metodi efficaci, mentre per i geni bersaglio rispettivi, hanno diverse limitazioni compreso l&#39;uso di prodotti chimici costosi, selezione continua contro gli antibiotici e la necessità per la convalida costante a causa della elevata incidenza di ritorno che si verificano nel tempo (Alicia Linford, comunicazione personale) 8. Ogni plasmide può replicare in Entamoeba come non c&#39;è a quanto pare un requisito sequenza rigorosa delle origini di replicazione del DNA 9 e così una volta transfettate, di solito è difficile da curare un plasmide. Questo limita la possibilità di usare i plasmidi intatto negli esperimenti di knockout e ricombinazione genica. Marcatori di selezione negativa sono i componenti chiave del gene targeting metodi possono essere utilizzati per eliminare le sottopopolazioni ricombinante. Abbiamo espresso con successo un codone ottimizzato FCU1 gene in Entamoeba histolytica e testato le sue potenzialità come marcatore negativo selezionabile. Questo gene di fusione è stato utilizzato per la terapia genica suicidio delle cellule tumorali umane e metabolizza il profarmaco 5-FC in tossici prodotti a valle con conseguente inibizione della sintesi del DNA e RNA 10. FCU1 è stato recentemente utilizzato come marcatore negativo selezionabile in Plasmodium, un protozoo parassita. Plasmodium cellule che esprimono berghei FCU1 sono risultati essere quasi 1000 volte più sensibili al pro-farmaco in vitro e in vivo, il trattamento con 5-FC ha ucciso oltre il 99,9% del infettare i parassiti ricombinante nella fase eritrocitaria modello murino della malaria 11. E. cellule che esprimono histolytica FCU1 hanno mostrato solo un 30-volte maggiore sensibilità al profarmaco 5-FC in contrasto con la sensibilità osservata in P. berghei. I motivi possibili di questo potrebbe essere grande piscina di nucleotidi disponibili nel terreno di coltura in competizione con i metaboliti tossici. In entrambi i P. berghei e P. falciparum il marcatore FCU1 è stato utilizzato in rottura genica mirata. studi 11,12. Il nostro obiettivo è di manipolare il genoma Entamoeba utilizzando la ricombinazione omologa. La validazione del sistema FCU1/5-FC selezione negativa è un passo significativo verso questo obiettivo.

<table><tbody><tr><td>Mezzo TYI-S-33</td><td>ATCC</td><td></td><td>Riferimento incluso nel testo</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F7129%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC">5-Fluorocitosina&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7129</td><td></td></tr><tr><td>Tracciante cellulare verde CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre Spectra Max M2</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo di un marcatore negativo selezionabile per entamoeba histolytica</em

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica è l&#39;agente eziologico di amebiasi e infetta fino al 10% della popolazione mondiale. Le tecniche molecolari che hanno permesso l&#39;up-e down-regolazione dell&#39;espressione genica contare sulla trasfezione di plasmidi stabilmente mantenuta. Anche se questi hanno aumentato la nostra comprensione dei fattori di virulenza Entamoeba, la capacità di integrare DNA esogeno nel genoma, che consentirebbe invertire esperimenti di genetica, sarebbe un vantaggio significativo nello studio di questo parassita. Le sfide presentate da questo organismo comprendono incapacità di selezionare, per eventi di ricombinazione omologa e la difficoltà di curare episomiale DNA plasmidico da trofozoiti transfettate. I risultati più avanti in un contesto alto di DNA esogeno, un grave problema per l&#39;identificazione di trofozoiti in cui un evento bona fide integrazione genomica si è verificato. Riportiamo lo sviluppo di un sistema di selezione basato sulla negativo espressione transgenica di una citosina deaminasi lievito e uracile fosforibosil transferasi chimera (FCU1) e selezione con profarmaco 5-fluorocytosine (5-FC). L&#39;enzima converte FCU1 non tossico 5-FC in tossico 5-fluorouracile e 5-fluorouridina-5&#39;-monofosfato. E. Linee che esprimono histolytica FCU1 sono risultati essere 30 volte più sensibile alla profarmaco rispetto al ceppo di controllo.

Riportiamo lo sviluppo di un sistema di selezione negativa<em&gt; E. histolytica</em&gt; Basato sulla espressione transgenica di una proteina chimerica (FCU1) e selezione con il profarmaco 5-fluorocytosine. La proteina FCU1 è una fusione di deaminasi lievito citosina e uracile fosforibosil. Espressione di FCU1 comportato un aumento della<em&gt; E. histolytica</emSensibilità&gt; verso 5-fluorocytosine.

Sviluppo di un marcatore negativo selezionabile per Entamoeba histolytica</em

*Entamoeba histolytica* è l'agente eziologico dell'amebiasi e infetta fino al 10% della popolazione mondiale. Le tecniche molecolari che hanno permesso la ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è validare l'utilizzo del sistema FCU1 a cinque FC come metodo di selezione negativa in Entamoeba histolytica. In piastre a 48 pozzetti, si seminano E. histolytica e linee transfezionate che esprimono il gene FCU1 o un controllo vettoriale appropriato; quindi si trattano le cellule con il profarmaco 5-FC. Nelle cellule che esprimono livelli elevati di FCU1, il 5-FC verrà convertito in quantità efficaci di prodotti finali tossici. La popolazione cellulare sopravvissuta viene colorata con C-M-F-D-A per dimostrare l'eliminazione selettiva delle cellule che esprimono FCU1 in presenza di 5-FC e per confrontare quantitativamente l'efficienza della selezione negativa. Questo sistema di selezione negativa ci permetterà, per la prima volta, di eliminare episomalmente i plasmidi da Entamoeba histolytica transfezionata.Data la difficoltà nell'effettuare manipolazioni genetiche convenzionali, questo metodo potrebbe permetterci di interrompere ed eliminare geni e successivamente testare fattori VIR bersaglio nel nostro programma di scoperta di farmaci. I trofozoiti possono variare per quanto riguarda la vitalità delle colture di riserva in coltura. Un errore iniziale può generare artefatti e pertanto una fase critica iniziale è il controllo di qualità della coltura iniziale.Sezionare le linee inba hisa in esame da provette stock in fiaschi T25 e mantenere la selezione aggiungendo l'antibiotico appropriato in TYIS 33. Incubare i fiaschi a 37 gradi Celsius per 16 ore affinché le colture raggiungano una confluenza di circa l'80%. Per questa procedura, preparare sempre un stock fresco di 50 millimolari di cinque fluorina o FC in TYIS 33 tiepido.Vortexare energicamente il mezzo per diversi minuti per sciogliere completamente i cinque FC e filtrare, sterilizzando la soluzione stock attraverso un filtro da 0,22 micron per raccogliere i trofozoi. Porre le provette sul ghiaccio per tre-cinque minuti e raccogliere le cellule centrifugando a 200 × g per cinque minuti a temperatura ambiente. Ri-sospendere il pellet nel mezzo TYI fresco e contare le cellule per facilitare le successive misurazioni fluorescenti.Eseguire gli esperimenti in triplicato e utilizzare una piastra distinta da 48 pozzetti per ogni ceppo per ogni punto temporale, con 0,5 volte 10 alla quattro cellule per pozzetto in un volume di 0,5 millilitri per ogni test. Concentrazione di 5 FC e mantenere la pressione selettiva antibiotica nel mezzo TYI. Aggiungere ora la quantità richiesta di soluzione madre di 5 FC, seguita da mezzo TYI, fino a un volume finale di un millilitro in ogni pozzetto e incubare le piastre in un sacchetto anaerobico a 37 gradi Celsius.Preparare una soluzione madre di due milligrammi per millilitro di cell tracker green C-M-F-D-A in DMSO. Successivamente, per ottenere la soluzione di lavoro, diluire la soluzione madre di 1000 volte in mezzo TYI senza siero ai punti temporali sperimentali specificati. Rimuovere completamente il mezzo dalle piastre di coltura Tropho Xite e sostituirlo con 150 microlitri di mezzo TYI senza siero contenente C-M-F-D-A.Continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius per un'ora, aspirare la soluzione DI dai pozzetti. Infine, leggere la piastra nel microlettore spettrofluorimetrico Spectra Max M2, utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 492 nanometri e un'emissione fluorescente di 517 nanometri. Confrontare i valori di fluorescenza delle cellule di controllo rispetto al transfect di prova.Continuare la lettura delle piastre a ogni intervallo di tempo. Utilizzare sempre pozzetti di controllo positivo e negativo appropriati in ogni piastra. Le analisi Western BLO dimostrano la corretta generazione del costrutto di trasfezione lya che esprime FCU1, la chimera della citosina deaminasi del lievito e della fosforibosil transferasi dell'uracile.Questi risultati si rispecchiano anche nelle misurazioni di PCR quantitativa. In presenza di cinque fluoruri, le cellule di controllo crescono normalmente fino a una concentrazione di cinque millimolari e raggiungono la confluenza tra 72 e 96 ore. Al contrario, le cellule di E. histolytica che esprimono FCU1 vengono eliminate selettivamente in presenza di 0,5 millimolari del profarmaco, come osservato mediante microscopia a campo chiaro.La risposta selettiva delle cellule di E. histolytica che esprimono FCU al farmaco FC Pro è visibile grazie alla chiara eliminazione delle cellule. In questo caso, le cellule vengono analizzate 72 ore dopo la trasfezione. Durante l'esecuzione di questo esperimento, è importante ricordare di monitorare la crescita a ogni punto temporale.Questo metodo può essere utilizzato nella mutagenesi hit and run, che impiegheremo per rispondere a domande importanti sulla virulenza di Inba Hisa.

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