Screening degli inibitori della pirofosfatasi legata alla membrana batterica mediante un test colorimetrico

La pirofosfatasi batterica legata alla membrana, o mPPasi, idrolizza il pirofosfato in ortofosfato mentre pompa ioni sodio attraverso la membrana.

Per valutare gli effetti degli inibitori contro le mPPasi, aggiungere concentrazioni crescenti di standard di fosfato alle strisce di provette.

Introdurre i composti di prova, che possono inibire la mPPasi, nelle provette, lasciandone una con l'acqua come controllo.

Aggiungere mPPasi incluse in liposomi derivate dal batterio termofilo Thermotoga maritima a tutte le provette ad eccezione degli standard.

Sigillare e incubare alla temperatura ottimale per attivare l'enzima.

Aggiungere pirofosfato di sodio per avviare la reazione e rilasciare l'ortofosfato.

Trasferire le provette su una piattaforma di raffreddamento per arrestare la reazione e centrifugare per rimuovere la condensa.

Aggiungere il reagente molibdato-ascorbato per reagire con l'ortofosfato e formare acido fosfomolibdico.

Aggiungere la soluzione di arsenito-citrato per ridurre l'acido, formando un complesso blu stabile.

Trasferire il contenuto in una piastra multipozzetto e misurare l'assorbanza.

Un'assorbanza inferiore rispetto al controllo indica l'inibizione della mPPasi, mentre gli s