Microscopia microfluidica time-lapse per studiare la persistenza degli antibiotici nei batteri

Inizia con cellule batteriche in crescita esponenziale che esprimono una proteina di fusione legante il DNA marcata in fluorescenza per visualizzare il nucleoide.

Aggiungere le cellule agli ingressi cellulari di una piastra microfluidica pre-preparata.

Quindi, introdurre i terreni contenenti antibiotici e i terreni privi di antibiotici in ingressi di soluzione separati.

Sigillare la piastra, montarla sul tavolino del microscopio e avviare l'imaging time-lapse.

Per prima cosa, caricare le cellule nella camera di coltura.

Quindi, perfondere terreni privi di antibiotici nella camera per supportare la crescita cellulare esponenziale.

Infine, introdurre i terreni contenenti antibiotici.

L'antibiotico induce rotture del DNA a doppio filamento, uccidendo le cellule sensibili. Queste cellule presentano nucleoidi compattati e non replicanti con fluorescenza stabile.

Torna ai terreni privi di antibiotici per favorire il recupero.

Le cellule persister, una piccola sottopopolazione che sopravvive al trattamento antibiotico, riprendono la replicazione del DNA, si allungano e si dividono.

Questo recupero porta a un aumento della fluorescenza nelle cellule persistenti, consentendo loro di essere distinte visivamente dalle cellule sensibili.

Rimuovere la soluzione di conservazione da ogni pozzetto della piastra microfluidica e sostituirla con terreno di coltura fresco. Sigillare la piastra microfluidica con il sistema manifold facendo clic sul pulsante Seal o tramite il software microfluidico.

Successivamente, sull'interfaccia del software microfluidico, eseguire una prima sequenza di priming facendo clic su Esegui sequenza di priming liquido. Incubare la piastra in una cabina termostatica del microscopio a 37 gradi Celsius per un minimo di due ore prima di iniziare l'imaging al microscopio. Quindi avviare una seconda sequenza di adescamento del liquido prima di iniziare l'esperimento.

Sigillare la piastra microfluidica facendo clic su Unseal Plate sull'interfaccia del software microfluidico. Sostituire il terreno nei pozzetti con 200 microlitri di terreno fresco, contenente antibiotici, e un campione di coltura diluito 0,01 OD nel terreno fresco. Dopo aver sigillato la piastra microfluidica come dimostrato in precedenza, posizionare la piastra sull'obiettivo del microscopio all'interno dell'armadietto del microscopio.

Nel software microfluidico, fare clic su Esegui sequenza di caricamento delle celle per consentire il caricamento delle celle nella piastra microfluidica. Impostate una messa a fuoco ottimale utilizzando la modalità a luce trasmessa e selezionate diverse regioni di interesse in cui è possibile osservare un numero di celle appropriato fino a 300 celle per campo. Sul software microfluidico, modificare l'opzione Esegui una sequenza personalizzata per programmare l'iniezione di terreno fresco a 6,9 kilopascal per sei ore nei pozzetti uno e due, seguito dal terreno contenente antibiotico a 6,9 kilopascal per sei ore nel pozzetto tre e infine nel terreno fresco a 6,9 kilopascal per 24 ore nei pozzetti quattro e cinque.

Eseguire l'imaging al microscopio in modalità time-lapse con un fotogramma ogni 15 minuti utilizzando la luce trasmessa e la sorgente di luce di eccitazione per il reporter fluorescente e avviare il programma microfluidico. Aprire il software ImageJ o Fiji sul computer e trascinare le immagini di microscopia time-lapse hyperstack nella barra di caricamento Fiji. Usa Immagine, seguito da Colore, quindi Crea composito per fondere i diversi canali dell'hyperstack.

Utilizzare Immagine, Colore, quindi Disponi canali se i canali non corrispondono al colore desiderato. Apri il plug-in MicrobeJ e rileva le cellule batteriche utilizzando l'interfaccia di modifica manuale. Elimina le celle rilevate automaticamente e delinea manualmente le celle persistenti di interesse fotogramma per fotogramma.

Dopo il rilevamento, utilizzare l'icona Risultato nell'interfaccia di modifica manuale di MicrobeJ per generare una tabella ResultJ. Utilizzare la tabella ResultJ per ottenere informazioni dettagliate sui diversi parametri di interesse dell'analisi a cella singola e salvare il file ResultJ.