Valutazione dell'attività batterica di chaperone tramite lo spiegamento termico di una proteina modello

Inizia posizionando una cuvetta in uno spettrofotometro a fluorescenza dotato di un portacuvette a temperatura controllata e un mescolatore.

Aggiungi un tampone preriscaldato a un pH moderatamente acido e imposta la temperatura del supporto per simulare le condizioni di stress.

Nel campione di test, aggiungi un accompagnatore protettivo per acidi derivato da E. coli.

Nel campione di controllo, aggiungi un volume di buffer uguale.

Successivamente, introdurre una proteina del substrato sensibile alla temperatura e all'acido in entrambi i campioni.

Inizia a monitorare la diffusione della luce.

Incubare i campioni in condizioni di stress per indurre lo spiegamento del substrato.

Al pH moderatamente acido, l'accompagnatore diventa attivo e stabilizza la proteina non ripiegata.

Aggiungi una soluzione salina neutralizzante il pH e continua a registrare la diffusione della luce.

Nel campione di controllo, il ritorno al pH neutro fa aggregare la proteina non ripiegata, aumentando la diffusione della luce.

Nel campione di test, lo chaperone favorisce il ripiegamento del substrato, che causa una riduzione della diffusione della luce rispetto al controllo.

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