JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:38 min. • November 28th, 2025
Inizia posizionando una cuvetta in uno spettrofotometro a fluorescenza dotato di un portacuvette a temperatura controllata e un mescolatore.
Aggiungi un tampone preriscaldato a un pH moderatamente acido e imposta la temperatura del supporto per simulare le condizioni di stress.
Nel campione di test, aggiungi un accompagnatore protettivo per acidi derivato da E. coli.
Nel campione di controllo, aggiungi un volume di buffer uguale.
Successivamente, introdurre una proteina del substrato sensibile alla temperatura e all'acido in entrambi i campioni.
Inizia a monitorare la diffusione della luce.
Incubare i campioni in condizioni di stress per indurre lo spiegamento del substrato.
Al pH moderatamente acido, l'accompagnatore diventa attivo e stabilizza la proteina non ripiegata.
Aggiungi una soluzione salina neutralizzante il pH e continua a registrare la diffusione della luce.
Nel campione di controllo, il ritorno al pH neutro fa aggregare la proteina non ripiegata, aumentando la diffusione della luce.
Nel campione di test, lo chaperone favorisce il ripiegamento del substrato, che causa una riduzione della diffusione della luce rispetto al controllo.
Confronta i segnali di diffusione della luce per valutare l'attività dei chaperoni.
Inserire una cuvetta di quarzo da un millilitro in uno spettrofotometro a fluorescenza dotato di portacampioni e agitatori a temperatura controllata.
Imposta la lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione a 350 nanometri. Aggiungere i volumi appropriati di tampone D preriscaldato ai valori di pH desiderati alla cuvetta. Il volume totale è di 1.000 microlitri.
Imposta la temperatura nel portacuvette a 43 gradi Celsius. Aggiungere 12,5 micromolari HdeB al buffer, seguito dall'aggiunta di 0,5 micromolari MDH. Inizia a monitorare la diffusione della luce.
Incubare la reazione per 360 secondi per consentire un adeguato dispiegamento della MDH. Alza il pH a sette aggiungendo un volume da 0,16 a 0,34 di fosfato dipotassico non tamponato a due molari non tamponati e continua a registrare la diffusione della luce per altri 440 secondi. Analizza i dati come descritto nel protocollo testuale.