JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:14 min. • November 28th, 2025
Si inizia con colonie di un batterio patogeno cresciuto su un mezzo agar ricco di nutrienti.
Scegli una singola colonia, che garantisce una popolazione geneticamente omogenea di cellule batteriche e riduce la variabilità durante la genotipizzazione.
Utilizzando un anello di inoculazione sterile, trasferire la colonia selezionata in acqua ultrapura per minimizzare il rischio di introduzione di contaminanti nel campione.
Vortice la sospensione per rompere la colonia e disperdere uniformmente le cellule batteriche.
Successivamente, riscalda la sospensione per disturbare l'involucro cellulare batterico, che consiste nella membrana esterna, nello strato di peptidoglicano e nella membrana interna.
Questo fa sì che le cellule batteriche si lisano e rilasciano contenuti intracellulari, incluso DNA genomico, nell'acqua.
Centrifugare la sospensione ad alta velocità per separare i detriti cellulari dal DNA genomico.
Trasferire il soprandanante su un tubo nuovo per l'applicazione di genotipizzazione a valle.
Per cominciare, utilizza anelli di inoculazione sterili per seminare colture pure di Yersinia ruckeri su qualsiasi tipo di agar adatto su piastre di Petri. Incubare a 22 gradi Celsius per uno o due giorni oppure a 15 gradi Celsius per tre o quattro giorni. Successivamente, utilizzando anelli di inoculazione, si sceglie una singola colonia rappresentativa da ciascuna piastra di Petri e trasferisci in tubi centrifughe da 1,5 millilitri, contenenti 50 microlitri di acqua ultra purificata da risospendere.
Vortice brevemente e incubare per sette minuti su un blocco riscaldante a 100 gradi Celsius. Poi, centrifugare a 16.000 g per tre minuti e utilizzare una pipetta per trasferire con cura il DNA modello soprandanante in tubi centrifughe vuoti da 1,5 millilitri. Procedi al passo successivo o conserva il DNA a meno 20 gradi Celsius.