JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
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Inizia con una coltura di Actinomyces infettata da Saccharibatteri.
I saccharibatteri, un batterio parassita ultrapiccolo, e il suo ospite formano una coltura binaria.
Aggiungere un'aliquota della coltura infetta a un tubo PCR contenente reagenti di amplificazione con colorante per il tracciamento dell'elettroforesi e primer specifici per Saccharibacteria.
Metti il tubo in un termociclatore con condizioni PCR prestabilite.
Durante la denaturazione iniziale, il calore lisa Saccharibacteria, rilasciando DNA genomico. Gli Actinomyces rimangono intatti a causa delle pareti cellulari rigide, limitando il rilascio del DNA dell'ospite.
Il calore quindi denatura i filamenti di DNA dei saccharibatteri e attiva la polimerasi Taq.
Durante l'annealing, i primer si legano a sequenze complementari nel genoma di Saccharibacteria.
In estensione, la polimerasi Taq aggiunge dNTP ai primer, sintetizzando nuovi filamenti di DNA.
Carica il prodotto PCR amplificato su un gel di agarosio pre-colorato con un colorante che si lega ai frammenti di DNA.
Esegui l'elettroforesi e visualizza il gel sotto luce UV.
Una banda amplicone specifica per Saccharibacteria conferma l'interazione ospite-parassita nella coltura binaria.
24 microlitri di miscelazione PCR master in un tubo PCR da 0,2 millilitri. A un microlitro di coltura infettata da saccharibatteri, e inserire il tubo in un termociclatore.
Imposta il programma PCR come descritto nel manoscritto del testo. Carica e fai girare i prodotti PCR su un gel Agros all'1%. Una banda di circa 600 basi conferma la presenza di saccharibatteri.