Protocollo per ricombinante RBD-based Vaccines SARS: Preparazione di proteine, vaccinazione degli animali e la rivelazione di neutralizzazione

In questo procedimento viene preparato un vaccino ricombinante che esprime la proteina RBD di SARS-CoV e viene valutata la sua capacità di indurre un'attività neutralizzante contro un pseudovirus di SARS. Innanzitutto, la proteina RBD viene espressa e purificata dal sopranatante di coltura di cellule 293T transfezionate. La proteina purificata viene quindi utilizzata per immunizzare.

I topi e i sieri vengono raccolti dai topi vaccinati in diversi momenti successivi all'immunizzazione per quantificare il potenziale di neutralizzazione dei sieri immunitari. Viene eseguito un saggio di neutralizzazione con virus pseudotipato: un virus pseudotipato SARS che esprime luciferasi viene prodotto in forma ricombinante e incubato con un siero policlonale titolato. Successivamente, la capacità di questi virus neutralizzati di infettare cellule esprimenti il co-recettore ACE per SARS viene valutata misurando l'attività relativa della luciferasi nelle cellule infette.

Il titolo di anticorpo neutralizzante al 50% può quindi essere calcolato. Il mio nome è tu. Attualmente sono un postdottorando nel laboratorio.

Il principale vantaggio del saggio di neutralizzazione con pseudovirus rispetto alle tecniche esistenti, come i saggi di neutralizzazione basati su virus vivi, è che questa tecnica è relativamente sicura. Non richiede un virus SARS infettivo ed può essere eseguita in un laboratorio che non sia di livello di sicurezza 3. Il nome del dimostratore della procedura sarà Lay e DU è un ricercatore post dottorato nel mio laboratorio che si è concentrato sullo sviluppo di vaccini contro malattie infettive emergenti come SARS e influenza. Scongelare aliquote di tampone sterile 2X HBS pH 7, cloruro di calcio 2,5 M, e plasmide RBD a temperatura ambiente.

Dopo lo scongelamento delle soluzioni, trasferire due millilitri di due XHBS in un tubo conico da 50 millilitri; in un tubo da 15 millilitri, miscelare 200 microlitri di cloruro di calcio con 40 microgrammi di plasmide RBD. Portare il volume a due millilitri aggiungendo acqua distillata sterile a temperatura ambiente mediante una pipetta sterile da cinque millilitri. Aggiungere la soluzione plasmidica al due XHBS in modo goccia a goccia, mantenendo la miscela sotto un vortice costante ma delicato.

Mantenere questo vortice lento e continuo è fondamentale per ottenere un precipitato di consistenza adeguata per un'elevata efficienza di trasfezione. Conservare per 20 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere la miscela goccia a goccia in un matraccio contenente cellule 293T confluenti al 50-70%.

In un volume di 40 millilitri di mezzo di coltura cellulare, è importante distribuire uniformemente la soluzione di trasfezione. Mescolare immediatamente il mezzo dopo l'aggiunta della miscela di trasfezione. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore con anidride carbonica al 5%.

Dopo otto-dieci ore di incubazione, rimuovere il mezzo cellulare completo e sostituirlo con 50 millilitri di mezzo ottimizzato privo di siero, al fine di evitare qualsiasi interferenza del siero sulla successiva purificazione delle proteine, quindi reinserire le cellule nell'incubatore a 37 gradi Celsius. Due giorni dopo, raccogliere il sopranatante, che conterrà la proteina RBD espressa, e centrifugare per 15 minuti a 6.000 giri al minuto per rimuovere i detriti cellulari. Una volta che le cellule sono state pellettizzate, trasferire il sopranatante in un nuovo tubo e aggiungere un cocktail di inibitori della proteasi.

Per prevenire il degrado proteico, utilizzare la resina nickel NTA super flow seguendo le istruzioni del produttore per purificare la proteina ricombinante RBD dal soprannatante raccolto. Eluire la proteina RBD con un buffer contenente 250 millimolar ole. Successivamente, utilizzando le provette Emon Ultra 15, concentrare la proteina purificata contenente OLE mediante centrifugazione a 3000 RPM a quattro gradi Celsius per circa 15 minuti. Scartare il flusso passante.

Aggiungere PBS ai tubi contenenti la concentrazione di RBD e centrifugare nuovamente a 3000 RPM a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Ripetere il lavaggio due volte. Per garantire la completa rimozione dell'ole, la proteina purificata verrà ora disciolta in PBS; trasferire la proteina con una pipetta in un tubo EOR da 1,5 millilitri pulito.

Infine, calcolare la concentrazione della proteina purificata utilizzando un NanoDrop con PBS come bianco e conservare il campione a meno 80 gradi Celsius. Aggiungere prima un millilitro di PBS sterile a una provetta del sistema adiuvante Sigma. Predisporre il riscaldamento in bagno termico a 40-45 gradi Celsius ed eseguire un'accurata vortexazione della provetta per due-tre minuti.

Successivamente, preparare l'emulsione del coadiuvante proteico in una provetta da 1,5 millilitri. Mescolare la quantità desiderata di proteina purificata scongelata diluita in PBS con un volume uguale di sistema coadiuvante e vortexare vigorosamente per due o tre minuti. Inoltre, preparare emulsioni di controllo mescolando il coadiuvante con PBS da solo. Per via sottocutanea.

Iniettare almeno cinque topi BC di quattro-sei settimane di età con 200 microlitri ciascuno della miscela di immunizzazione iniziale contenente 20 microgrammi di proteina per dose oppure con l'emulsione di controllo, 21 giorni dopo l'inoculazione iniziale per via sottocutanea. Iniettare dosi di richiamo contenenti 10 microgrammi di proteina in un volume finale di 200 microlitri ciascuna. Raccogliere campioni di sangue da ciascun topo prima dell'immunizzazione iniziale e 10 giorni dopo ogni vaccinazione e conservare il siero isolato a meno 20 gradi Celsius dopo il trattamento termico.

Inattivazione del complemento a 56 gradi Celsius per 30 minuti, 16 ore prima della trasfezione, piastrare le cellule 293T in piatti da coltura tissutale da 100 millimetri a una densità di 2 milioni di cellule per piatto. Preparare il reagente di trasfezione come descritto in precedenza e cotrasfettare le cellule con un plasmide che codifica per la proteina S del SARS-CoV e un altro che codifica per il genoma di HIV-1 difettivo per ENV e che esprime la luciferasi. Otto-dieci ore dopo la trasfezione.

Sostituire il mezzo con 10 millilitri di mezzo DMEM fresco contenente il 10% di siero, quindi reinserire le cellule nell'incubatore. Due giorni dopo, raccogliere il surnatante contenente il virus pseudo-SARS. Far passare il sopranatante attraverso un filtro siringa da 0,45 micron per rimuovere i detriti cellulari e allestire aliquote del virus.

Utilizzare immediatamente o congelare a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro utilizzando una piastra per pipetta multicanale. Cellule 293T che esprimono il recettore ACE2 di SARS-CoV in una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti a una concentrazione di 10.000 cellule per cento microlitri per pozzetto e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 16 ore. Utilizzare una piastra a 96 pozzetti separata per titolare il virus pseudo-SARS ricombinante che esprime la luciferasi e determinare la concentrazione appropriata di virus per il saggio di neutralizzazione nelle file A e B della prima piastra.

150 microlitri per pozzetto di DMEM con 10% di FBS. Successivamente, aggiungere 150 microlitri di virus non diluito alle righe A1 e B1 ed eseguire una diluizione seriale duplicata a due fold trasferendo 150 microlitri dai pozzetti della riga 1 ai pozzetti della riga successiva e così via fino alla riga 11. Scartare gli ultimi 150 microlitri e non aggiungere virus alla riga 12.

Dopo aver eseguito la diluizione seriale e aver incubato le cellule ACE 2 93 T per 16 ore, infettare le cellule trasferendo 100 microlitri da ciascun pozzetto della piastra virale al pozzetto corrispondente della piastra contenente le cellule. Incubare le cellule per due giorni a 37 gradi Celsius per consentire ai virus di infettare le cellule. Determinare il livello di infezione in ciascun pozzetto leggendo la piastra con un luminometro ultra 3 84.

La quantità di infezione è proporzionale all'intensità dell'attività della luciferasi. La concentrazione virale alla quale l'unità relativa di luciferasi è circa mille volte maggiore rispetto all'RLU di fondo delle cellule da sole nella colonna 12 verrà utilizzata nel saggio di neutralizzazione. Impostare la neutralizzazione in una piastra separata a 96 pozzetti utilizzando innanzitutto una pipetta multicanale, aggiungendo 150 microlitri di 10%F-B-S-D-M-E-M nei pozzetti della colonna uno e 120 microlitri nei pozzetti delle altre colonne.

Successivamente, aggiungere tre microlitri di ciascun siero murino da testare in pozzetti doppi nella colonna uno. In questo esempio, i primi due pozzetti contengono siero diluito 50 volte da un topo immunizzato con RBD. I successivi due contengono siero da un secondo topo immunizzato con RBD e gli ultimi quattro pozzetti contengono siero da due animali di controllo immunizzati con PBS. Utilizzando una pipetta multicanale, eseguire una diluizione seriale cinque volte trasferendo 30 microlitri da tutti i pozzetti della prima colonna nei pozzetti della seconda colonna, ripetendo questa operazione fino alla colonna 11.

Scartare i restanti 30 microlitri e lasciare i pozzetti nella colonna 12 senza siero. Successivamente, aggiungere 120 microlitri per pozzetto di un virus pseudo SAR diluito in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire agli anticorpi anti-RBD presenti nel siero murino di legarsi e neutralizzare il virus pseudo SARS.

Dopo questo periodo di incubazione, trasferire 100 microlitri di virus neutralizzato da ogni pozzetto nei pozzetti corrispondenti della piastra a 96 pozzetti contenente cellule 293T che esprimono ACE2. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore per consentire l'infezione. Una volta infettate le cellule, rimuovere il mezzo e, utilizzando una pipetta multicanale, sostituirlo con 100 microlitri per pozzetto di mezzo fresco.

Rimettere la piastra nell'incubatore dopo 72 ore a 37 gradi Celsius. Ancora una volta, rimuovere il soprannatante. A questo punto, qualsiasi pseudovirus che non è stato neutralizzato dal siero murino dovrebbe essere stato in grado di infettare le cellule utilizzando una pipetta multicanale. Aggiungere 60 microlitri per pozzetto di un reagente di lisi per colture cellulari luciferasi.

Posizionare la piastra su un agitatore a temperatura ambiente e lasciare che le cellule lisino per uno o due ore. Una volta che le cellule sono state lisate, trasferire 50 microlitri dei lisati cellulari in una piastra da 96 pozzetti per luminometro e aggiungere 50 microlitri per pozzetto di substrato per luciferasi. Utilizzare un luminometro Ultra 3 84 impostato in modalità luminescenza per piastre da 96 pozzetti per leggere la piastra e valutare relativamente l'attività della luciferasi nei diversi pozzetti, a partire dalla quale può essere ricavata la percentuale di virus neutralizzato.

Questi dati mostrano che la percentuale di neutralizzazione del virus raggiunta è proporzionale alla concentrazione di siero proveniente da topi immunizzati con RBD. Al contrario, il siero di animali inoculati con PBS non riesce a neutralizzare il virus a nessuna concentrazione, come evidenziato da questi dati. L'NT 50 o il titolo del siero a cui il 50% del virus viene neutralizzato può essere facilmente determinato.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la sicurezza e la pazienza sono essenziali per il successo degli esperimenti. Dopo aver visionato questi video, si dovrebbe avere una comprensione migliore di come esprimere un vaccino ricombinante contro il SARS in linee cellulari di mammifero e di come determinare la capacità di indurre una risposta anticorpale neutralizzante in modelli murini.