Protocollo per ricombinante RBD-based Vaccines SARS: Preparazione di proteine, vaccinazione degli animali e la rivelazione di neutralizzazione

In questa procedura viene preparato un vaccino ricombinante che esprime la proteina SARS COV RBD e viene valutata la sua capacità di indurre attività neutralizzante contro uno pseudo virus SARS. Primo. La proteina RBD è espressa nel surnatante purificato dalla coltura di cellule T trasfettate 2, 9, 3. La proteina purificata viene quindi utilizzata per l'immunizzazione.

Topi e sieri vengono raccolti dai topi vaccinati in vari momenti dopo l'immunizzazione per quantificare il potenziale di neutralizzazione dei sieri immunitari. Viene eseguito un test di neutralizzazione dello pseudo virus, viene prodotto lo pseudo virus della SARS prodotto con luciferasi ricombinante e incubato con un sra titolato per bocca. Successivamente, viene valutata la capacità di questi virus neutralizzati di infettare le cellule che esprimono ACE del co-recettore SARS misurando l'attività relativa della luciferasi nelle cellule infette.

È quindi possibile calcolare il titolo di anticorpi neutralizzanti al 50%. Il mio nome è tu. Attualmente sono un postino in laboratorio.

Il vantaggio principale del test di neutralizzazione pseudo virus rispetto alle tecniche esistenti come i test di neutralizzazione basati su virus vivi è che questa tecnica è relativamente sicura. Non richiede un virus SAR infettivo e può essere eseguito in un laboratorio non di sicurezza tre. Il mio nome sta dimostrando che la procedura sarà dovuta e DU è un ricercatore post ricerca nel mio laboratorio che si è concentrato sullo sviluppo di vaccini contro malattie infettive emergenti come la SARS e infl Thaw aliquote di sterili due tampone XHBS pH sette 2,5 molari cloruro di calcio e plasmide RBD a temperatura ambiente.

Una volta scongelate le soluzioni, trasferire due millilitri di due XHBS in una provetta conica da 50 millilitri, in una provetta da 15 millilitri mescolare 200 microlitri di cloruro di calcio con 40 microgrammi di plasmide RBD. Regolare il volume a due millilitri utilizzando acqua distillata sterile a temperatura ambiente utilizzando una pipetta sterile da cinque millilitri. Aggiungere la soluzione plasmidica ai due XHBS in modo goccia mantenendo la miscela sotto un vortice costante ma delicato.

Mantenere questo vortice lento e continuo è fondamentale per ottenere un precipitante di consistenza adeguata per un'elevata efficienza di trasfezione. Conservare per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo questa incubazione, aggiungere la miscela goccia a goccia in un pallone contenente dal 50 al 70% di cellule T confluenti 2 9 3

In un volume di 40 millilitri di terreno di coltura cellulare, è importante distribuire uniformemente la soluzione di trasfezione. Mescolare il terreno subito dopo aver aggiunto la miscela di trasfezione. Posizionare le celle a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica.

Dopo 8-10 ore di incubazione, rimuovere l'intero terreno cellulare e sostituirlo con 50 millilitri di siero fresco free optimum, un terreno per evitare qualsiasi interferenza del siero sulla successiva purificazione delle proteine e quindi riportare le cellule nell'incubatore a 37 gradi Celsius. Due giorni dopo raccogliere il surnatante, che conterrà la proteina RBD espressa e centrifugare a 15 minuti a 6.000 giri/min per rimuovere i detriti cellulari. Una volta che le cellule sono state pellettate, trasferire il supernat in una provetta nuova e aggiungere il cocktail di inibitori della proteasi.

Per prevenire la degradazione delle proteine, utilizzare il super flusso NTA al nichel seguendo le istruzioni del produttore per purificare la proteina ricombinante RBD dal supernat ELUTE RBD raccolto con tampone contenente 250 millimolari di ole. Successivamente, utilizzando le provette Emon Ultra 15, concentrare la proteina purificata contenente OLE mediante centrifugazione a 3000 giri/min e quattro gradi Celsius per circa 15 minuti. Scartare il flusso attraverso.

AGGIUNGERE PBS alle provette di concentrazione RBD e centrifugare nuovamente a 3000 giri/min quattro gradi Celsius per 20 minuti. Ripetere il lavaggio due volte. Per garantire la completa rimozione dell'ole, la proteina purificata si dissolverà ora nella proteina della pipetta PBS in una provetta EOR pulita da 1,5 millilitri.

Infine, calcola la concentrazione della proteina purificata utilizzando un NanoDrop con PBS come bianco e conserva il campione a meno 80 gradi Celsius. Innanzitutto, aggiungere un millilitro di PBS sterile a una fiala del sistema adiuvante Sigma. Preriscaldare a bagnomaria a 40-45 gradi Celsius e agitare accuratamente la fiala per due o tre minuti.

Successivamente, preparare l'emulsione di adiuvante proteico in una provetta da 1,5 millilitri. Mescolare la quantità desiderata di proteina purificata scongelata diluita in PBS con un volume uguale di sistema adiuvante e agitare energicamente per due o tre minuti. Inoltre, preparare le emulsioni di controllo mescolando l'adiuvante con il solo PBS. Sottocute.

Iniettare almeno cinque, da quattro a sei topi BC di età con 200 microlitri ciascuno della miscela di immunizzazione iniziale contenente 20 microgrammi di proteine per dose o con l'emulsione di controllo a 21 giorni dopo l'inoculazione iniziale per via sottocutanea. Iniettare dosi di richiamo contenenti 10 microgrammi di proteine in un volume finale di 200 microlitri ciascuna. Raccogliere campioni di sangue da ciascun topo prima dell'immunizzazione iniziale e 10 giorni dopo ogni vaccinazione e conservare il siero isolato a meno 20 gradi Celsius dopo il calore.

Inattivazione del complemento a 56 gradi Celsius per 30 minuti e 16 ore prima della trasfezione su piastra 2, 9, 3 cellule T in piastre di coltura tissutale da 100 millimetri a una densità di 2 milioni di cellule per piatto. Preparare il reagente di trasfezione come descritto in precedenza e trasfettare le cellule con un plasmide che codifica per la proteina S di SARS cove e un altro che codifica per la luciferasi difettosa ENV che esprime il genoma dell'HIV uno. Da otto a 10 ore dopo la trasfezione.

Sostituito il terreno con 10 millilitri di terreno DMEM fresco contenente il 10% di siero e quindi rimesso le cellule nell'incubatore. Due giorni dopo, raccogli il laccio contenente lo pseudo virus della SARS. Passare il surnatante attraverso un filtro per siringa da 0,45 micron per rimuovere i detriti cellulari aliquote dal virus.

Utilizzare immediatamente o congelare a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro utilizzando una piastra per pipette multicanale. 2 9 3 cellule T che esprimono il recettore SARS COV ACE due nella piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti a una concentrazione di 10.000 cellule per cento microlitri per pozzetto e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 16 ore. Utilizzare una piastra separata da 96 pozzetti per titolare lo pseudo virus SARS che esprime la luciferasi ricombinante e determinare la concentrazione virale appropriata per il test di neutralizzazione nelle righe A e B della prima piastra.

150 microlitri per pozzetto di 10% F-B-S-D-M-E-M. Successivamente, aggiungere 150 microlitri di virus non diluito alle file A uno e B uno ed eseguire una doppia diluizione seriale duplicata trasportando oltre 150 microlitri dai pozzetti della prima fila ai pozzetti della riga successiva e così via fino alla riga 11. Scartare gli ultimi 150 microlitri e non aggiungere virus alla riga 12.

Una volta eseguita la diluizione seriale e incubate le cellule T ACE 2 93 per 16 ore, infettare le cellule trasferendo 100 microlitri da ciascun pozzetto della piastra virale nel pozzetto corrispondente della piastra contenente le cellule. Incubare le cellule per due giorni a 37 gradi Celsius per consentire ai virus di infettare le cellule. Determinare il livello di infezione in ciascun pozzetto leggendo la piastra in un luminometro ultra 3 84.

La quantità di infezione è proporzionale all'intensità dell'attività della luciferasi. Nel saggio di neutralizzazione verrà utilizzata la concentrazione del virus alla quale l'unità relativa di luciferasi è circa mille volte maggiore dell'RLU di fondo delle sole cellule nella colonna 12. Impostare la neutralizzazione in una piastra separata da 96 pozzetti, utilizzando prima una pipetta multicanale a 150 microlitri di 10% F-B-S-D-M-E-M nei pozzetti della prima colonna e 120 microlitri nei pozzetti delle altre colonne.

Quindi, aggiungere tre microlitri di ciascun siero di topo da testare per duplicare i pozzetti nella prima colonna. In questo esempio, i primi due pozzetti hanno 50 volte il siero diluito di un topo immunizzato con RBD. I due successivi hanno il siero di un secondo topo immunizzato con RBD e gli ultimi quattro pozzetti hanno il siero di due animali immunizzati con PBS di controllo utilizzando una pipetta multicanale, eseguono una diluizione seriale quintuplicata del siero trasferendo 30 microlitri da tutti i pozzetti della prima colonna nei pozzetti della seconda colonna e ripetendo questo fino alla colonna 11.

Scartare i restanti 30 microlitri e lasciare i pozzetti nella colonna 12 senza siero. Quindi, aggiungere 120 microlitri per pozzetto di uno pseudo virus SAR diluito a ciascuno. Incubare bene la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire a eventuali anticorpi anti RBD nel siero di topo di legarsi e neutralizzare lo pseudo virus della SARS.

Dopo questa incubazione, trasferire 100 microlitri di virus neutralizzato da ciascun pozzetto nei pozzetti corrispondenti. La piastra a 96 pozzetti contenente ACE due che esprimono 2 9 3 cellule T. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore per consentire l'infezione una volta che le cellule sono state infettate, rimuovere il sate e utilizzare una pipetta multicanale e sostituirlo con 100 microlitri per pozzetto di terreno fresco.

Rimettere la piastra nell'incubatrice dopo 72 ore a 37 gradi Celsius. Ancora una volta, rimuovere la sopra natina A questo punto, qualsiasi pseudo virus che non sia stato neutralizzato dal siero di topo dovrebbe essere stato in grado di infettare le cellule utilizzando una pipetta multicanale. Aggiungere 60 microlitri per pozzetto di un reagente di lisi per colture cellulari luciferasi.

Posizionare la piastra su uno shaker a temperatura ambiente e lasciare che le cellule si lisino per una o due ore. Una volta che le cellule sono state mentite, trasferire 50 microlitri di lisati cellulari in una piastra luminometrica a 96 pozzetti e aggiungere 50 microlitri per pozzetto di substrato di luciferasi. Utilizzare un luminometro ultra 3 84 impostato in luminescenza in modalità piastre a 96 pozzetti per leggere la piastra e valutare l'attività relativa della luciferasi nei diversi pozzetti da cui è possibile derivare la percentuale di virus neutralizzato.

Questi dati mostrano che la percentuale di neutralizzazione del virus raggiunta è proporzionale alla concentrazione di siero di topi immunizzati con RBD. Al contrario, il siero di animali iniettati con PBS non riesce a neutralizzare il virus a nessuna concentrazione da questi dati. L'NT 50 o titolo sierico al quale il 50% del virus viene neutralizzato può essere facilmente derivato.

Mentre si tenta questa procedura è importante ricordare che la fiducia e la pazienza sono essenziali per il successo degli esperimenti. Dopo aver visto questi video, dovresti avere una migliore comprensione di come esprimere il vaccino SARS ricombinante in sub di cellule maman e determinare la capacità di indurre la risposta anticorpale neutralizzata nei modelli murini.