JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:23 min. • February 26th, 2026
Prendiamo biofilm patogeni derivati da batteri coltivati su agar nutritivo.
Il biofilm non trattato presenta batteri densamente impacchettati all'interno di una matrice extracellulare protettiva.
Il biofilm trattato con inibitore presenta cellule vagamente associate all'interno di una matrice rada.
Dividi in due ogni biofilm, poi esponi una metà al tampone come controllo e l'altra all'etanolo per imporre lo stress antimicrobico.
Nel biofilm non trattato ed esposto all'etanolo, la matrice densa riduce la diffusione dell'etanolo e limita la penetrazione cellulare, con conseguente minore uccisione batterica.
Nel biofilm esposto all'etanolo trattato con inibitori, la matrice rada permette all'etanolo di penetrare più facilmente, portando a una maggiore uccisione batterica.
Centrifuga i tubi e rimuovi il soprantantante. Aggiungi buffer e sonica per disperdere le cellule.
Placca le sospensioni diluite e incuba per permettere la crescita di batteri vitali.
Contare le unità formative di colonie (CFU); meno CFU provenienti dal biofilm esposto all'etanolo e trattato con inibitori confermano che l'integrità della matrice è essenziale per la resistenza all'etanolo.
Prendi una lametta pulita e taglia le colonie di biofilm in due parti uguali con l'aiuto del modello. Sollevare con cura metà della colonia con una spatola pulita e trasferirla in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri, contenente 500 microlitri di PBS.
Prendi la seconda metà della colonia e trasferiscila in un tubo micro-centrifuga contenente 500 microlitri di etanolo al 50%. Questi verranno utilizzati per valutare la resistenza agli agenti sterilizzanti. Successivamente, prendi anche la prima metà della colonia trattata con D-leucina e mettila nel PBS.
Poi, prendi la seconda metà di questa colonia e trasferiscila in etanolo. Incubare tutti i tubi contenenti le due metà del biofilm per 10 minuti a temperatura ambiente. E poi, centrifugarli per cinque minuti a 18.000 volte g.
Con una pipetta, rimuovi con cura il soprantantante. Aggiungi 300 microlitri di PBS, poi sonica le celle a bassa impostazione con un microtip sonicator. Aggiungi altri 700 microlitri di PBS per un volume finale di un millilitro.
Successivamente, eseguire una diluizione seriale da 10 al meno sette in PBS. Prendi 100 microlitri di una delle diluizioni e inocula una piastra di Agar LB all'1,5%. Ripeti questo passaggio per altre due diluizioni per campione.
Distribuisci l'inoculo usando perline di vetro, poi incuba le piastre durante la notte a 30 gradi Celsius. Esamina le placche e conta le unità formative di colonie, o CFU. Dopo aver calcolato il valore della CFU per millilitro, calcola la percentuale di sopravvissuti ai trattamenti PBS rispetto ai trattamenti con etanolo.