Name: La combinazione di coloranti lipofili, In situ Ibridazione, Immunoistochimica e Istologia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Impara a combinare coloranti lipofili, ibridazione in situ, immunoistochimica e istologia per analizzare tessuti murini. Questo metodo integrato massimizza le informazioni da un singolo campione, correlando mutazioni genetiche con profili morfologici ed espressione genica.

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Confocale immagini sono state ottenute presso la University of Iowa Carver Center for Imaging. Il finanziamento è stato fornito da una sovvenzione SBIR (MH079805) a sostegno BF aggiuntivo per l&#39;allevamento dei topi per questo progetto è stato fornito dal dell&#39;NIDCD (5R01DC00559007) a BF

<ol><li>Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+three-color+neuronal+tracing+in+fixed+tissue+using+NeuroVue+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes.</a> Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).</li>
<li>Tonniges, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-+and+bio-physical+characterization+of+novel+violet+and+near-infrared+lipophilic+fluorophores+for+neuronal+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing.</a> Journal of Microscopy. , (2010).</li>
<li>Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+tracing+with+DiI%3A+decalcification%2C+cryosectioning%2C+and+photoconversion+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis.</a> J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).</li>
<li>Gurung, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+embryonic+midbrain+thalamic+and+thalamic+auditory+connection+development+in+mice+as+revealed+by+carbocyannine+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection.</a> J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).</li>
<li>Fritzsch, B., Nichols, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+reveals+a+prenatal+arrival+of+efferents+at+the+differentiating+otocyst+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice.</a> Hear Res. 65, 51-60 (1993).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+suppresses+hair+cell+differentiation+in+ear+ganglia+and+regulates+hair+cell+subtype+development+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea.</a> PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).</li>
</ol>

Tessuto del mouse sono stati raccolti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dall&#39;Università di Animal Care Iowa e del Comitato Istituzionale Usa (ACURF 0804066).

In questo video, dimostriamo un metodo per combinare quattro tecniche al fine di massimizzare la raccolta di dati e la coesione, correlando i dati all&#39;interno di un determinato animale (figura 3). Questa soluzione consente di ridurre la quantità di allevamento e quindi il tempo necessario per ottenere i dati pubblicabili migliorando al tempo stesso informazioni sui co-localizzazione e gli effetti correlativo di mutanti. Anche se sono stati utilizzati topi embrionale in questo mouse video, adulti, nonché gli altri animali come il pollo, Xenopus, zebrafish e possono essere analizzati utilizzando queste tecniche pure. Quando si utilizzano altre specie proteinasi k digestione aver bisogno di essere modificato. Qui usiamo diversi coloranti fluorescenti NeuroVue di etichettare in particolare fino a tre popolazioni neuronali di interesse. Il vantaggio di questi coloranti è che possono essere utilizzati in topi mutanti, che può essere problematico quando si può contare solo sulla immunoistochimica che possono o non possono essere influenzate dalle mutazioni da analizzare, e che etichetta i neuroni retrogrado e anterogradely 5. Un recente studio ha anche aumentato il numero delle popolazioni di neuroni che possono essere etichettati contemporaneamente a sei 2. Dopo, il colorante lipofile tracciamento dello stesso tessuto di interesse possono poi essere analizzati mediante ibridazione in situ, per l&#39;analisi della trascrizione genica e possono essere successivamente analizzati mediante immunoistochimica per la distribuzione delle proteine. Quest&#39;ultima analisi può essere completata da esame istologico dettagliato che può aggiungere alla caratterizzazione fenotipo 6. Questa analisi multifattoriale ha il potenziale per acquisire nuove conoscenze attraverso l&#39;analisi correlativa entro lo stesso animale che potrebbero altrimenti essere improbabile o per lo meno hanno bisogno di protocolli più ampi e l&#39;allevamento del mouse.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; Ibridizzazione:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Set di tampone per lavaggio e blocco PC DIG</td><td>Gruppo Roche</td><td>1585762</td><td></td></tr><tr><td>Tampone SSC 20x premiscelato</td><td>Gruppo Roche</td><td>1666681</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pirocarbonato (DEPC) </td><td>Research Products International Corp.</td><td>D43060</td><td></td></tr><tr><td>Formammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Destrano solfato</td><td>Research Products International Corp.</td><td>D20020</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple </td><td>Roche Group</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Frammenti Fab anti-Dig-AP</td><td>Gruppo Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Enzima RNase A 10 mg/ml</td><td>Fermentas</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Research Products International Corp.</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>DNA di sperma di salmone 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Filter Unit 0,22&amp;mu;m; 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Dischi filtranti 0,2&amp;mu;m; 25 mm</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Sacchetti di soluzione salina tamponata al fosfato pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Immunohistochimica&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst Colorante</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>9460</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Istologia:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly/Bed 812 Mezzo di inclusione/DMP-30 Kit </td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08792-1</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di propilene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110205</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di glutaraldeide al 50%</td><td>Fisher Scientific</td><td>G151</td><td></td></tr><tr><td>DPX come mezzo di montaggio</td><td>Fluka</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>MidSci</td><td>55D1114</td><td></td></tr><tr><td>Blocco riscaldante</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-715-125D</td><td></td></tr><tr><td>Rotatore</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice impostata a 60&amp;#x00B0;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Tracciamento con colorante&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforbici</td><td>Geuder</td><td>G-19775</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette fini</td><td>E.M.S.</td><td>72680-F</td><td></td></tr><tr><td>NeuroVue colorante: Marrone, Rosso, Giada</td><td>MTTI</td><td>FS-100(1,2,6)</td><td></td></tr><tr><td>1X soluzione salina fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>Ambito di analisi</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice impostata a 36&amp;#x00B0;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-506DQ</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica Microsystems</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td>Surgipath</td><td>00240</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Surgipath</td><td>00106</td><td></td></tr><tr><td>RPI</td><td>Glicerolo</td><td>G22025-0,5</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (4% e 0,4%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr></tbody></table>

la combinazione di coloranti lipofili, in situ ibridazione, immunoistochimica e istologia

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Andando oltre la funzione del gene singolo a tagliare più in profondità reti gene regolatore richiede mutazioni multiple combinate in un singolo animale. Tale analisi di due o più geni devono essere integrate con ibridazione in situ di altri geni, o immunoistochimica delle loro proteine, sia in interi organi o parti montate sviluppo per la risoluzione dettagliata delle alterazioni dell&#39;espressione cellulare e dei tessuti. La combinazione di alterazioni del gene più richiede l&#39;uso di cre o flipase per eliminare in modo condizionale evitare geni e letalità embrionale. Sistemi di allevamento richiesto aumentare drammaticamente sforzo e costo proporzionale al numero di geni mutati, con un risultato di animali molto pochi, con il repertorio completo di modificazioni genetiche desiderato. Ammortizzare la grande quantità di sforzo e tempo per ottenere questi pochi esemplari preziosi che sono portatori di mutazioni multiple richiede l&#39;ottimizzazione dei tessuti. Inoltre, indagando su un singolo animale con tecniche diverse rende più facile mettere in relazione i difetti delezione del gene con profili di espressione. Abbiamo sviluppato una tecnica per ottenere un&#39;analisi più approfondita di un determinato animale, con la capacità di analizzare diversi diverse strutture istologicamente riconoscibile come espressione dei geni e delle proteine ​​tutti dal campione stesso in entrambi gli organi tutto montato e sezioni. Anche se i topi sono stati utilizzati per dimostrare l&#39;efficacia di questa tecnica può essere applicata a una vasta gamma di animali. Per fare questo abbiamo combinare lipofile colorante tracciamento, montare tutto ibridazione in situ, immunoistochimica, istologia e per estrarre la massima quantità possibile di dati.

Una combinazione di tecniche differenti per massimizzare la raccolta dati dal tessuto del mouse è presentato.

La combinazione di coloranti lipofili, In situ Ibridazione, Immunoistochimica e Istologia

Per andare oltre la funzione del singolo gene e approfondire lo studio delle reti di regolazione genica, è necessario combinare più mutazioni in un unico animale. Tale analisi di...

Oltrepassare la singola funzione genica e analizzare le reti di regolazione genica richiede multipli mutazioni in un singolo animale. In questo sistema, ottimizziamo la quantità di dati ottenuti da un singolo tessuto per correlare mutazioni genetiche con profili morfologici ed espressivi. Questo viene ottenuto innanzitutto iniettando un colorante lipofilico per visualizzare diverse popolazioni neuronali distinte.L'ibridazione molecolare in situ viene eseguita per visualizzare il modello spazio-temporale dei trascritti genici. Mentre l'immunoistochimica riflette modelli specifici di espressione proteica, la dimensione aggiuntiva del sezionamento istologico contribuisce alla caratterizzazione del fenotipo. Questo sistema sperimentale consente di analizzare diverse strutture istologicamente riconoscibili, nonché l'espressione genica e proteica, tutte a partire dallo stesso campione, sia in preparati interi montati che in sezioni. Descriviamo un sistema che combina il tracciamento con coloranti lipofili e l'ibridazione molecolare in situ, l'immunoistochimica e l'istologia.Questa tecnica massimizza l'informazione ottenuta da un singolo campione, correlando la morfologia con l'espressione genica e proteica. Per tutte le dissezioni e manipolazioni dei tessuti, fissare gli animali in paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M mediante perfusione transcardiale utilizzando pompe peristaltiche con aghi di dimensioni adeguate. Poiché i coloranti DY sono fotosensibili, conservarli in un compartimento chiuso al buio e, per evitare contaminazioni incrociate, destinare un set separato di strumenti per la manipolazione di ciascun colorante al microscopio stereoscopico.Determinare un sito di applicazione del colorante per etichettare in modo selettivo la popolazione neuronale in esame, evitando altre strutture estranee. Rimuovere i tessuti estranei al fine di confermare visivamente il sito scelto e garantire l'accesso per il posizionamento del colorante. A questo punto, tagliare le strisce di filtro del colorante neuro view precaricate in pezzi triangolari delle dimensioni appropriate utilizzando forbici microchirurgiche.Assicurarsi di tagliare un pezzo il più piccolo possibile per evitare l'etichettatura di altre strutture durante l'inserimento nei tessuti molli, come il cervello direttamente. Inserire il filtro utilizzando un angolo del triangolo del filtro per forare il tessuto. Per tessuti più rigidi, praticare un'incisione per consentire un inserimento più agevole del D. Non utilizzare un ago da dissezione per spingere il filtro all'interno del tessuto.Posizionare i campioni in una provetta chiusa ermeticamente contenente paraformaldeide al 4% e incubare a 36 gradi Celsius al buio per due fino a quattordici giorni, a seconda dell'età e della distanza di diffusione da coprire. Utilizzando un microscopio stereoscopico con illuminazione epi-fluorescente, verificare che il colorante si sia diffuso nella posizione desiderata ed espiantare il tessuto di interesse. Montare e fissare il campione su un vetrino con glicerolo per l'acquisizione delle immagini mediante microscopio confocale.Dopo l'acquisizione delle immagini di occhi lipofili, trasferire i campioni in una provetta eppendorf da due millilitri priva di RNAsi e aggiungere PBS privo di RNAsi per rimuovere sistematicamente la glicerolo. Procedere con i campioni attraverso una serie di disidratazione e riidratazione con metanolo in gradiente a quattro gradi Celsius. Iniziare con un'incubazione in metanolo al 100% per almeno un'ora e procedere riducendo fino al 25% di metanolo per 15 minuti.Lavare tre volte in PBS 1x per cinque minuti ciascuna. Digestire il tessuto con due microlitri di proteinasi K stock a 20 milligrammi per millilitro in due millilitri di PBS fresco. Monitorare la reazione di digestione attraverso il cambiamento dell'opacità del tessuto, da opaco a quasi trasparente.Per arrestare la digestione enzimatica, incubare i campioni in paraformaldeide al 4% per cinque minuti. Quindi lavare una volta con PBS per un minuto, seguito da tre lavaggi di cinque minuti ciascuno. Scartare l'ultimo lavaggio con PBS prestando particolare attenzione a eliminare il più possibile il liquido come passaggio preliminare all'ibridazione.Incubare i campioni in 1,8 millilitri di ibridazione. Mescolare per un'ora a 60 gradi Celsius su un inverter, denaturare il DNA di sperma di salmone mediante incubazione a 85 gradi Celsius per 10 minuti e porre sul ghiaccio, aggiungere 200 microlitri di DNA denaturato a singolo filamento e circa 100 nanogrammi di riba marcati con DIG. Aggiungere la sonda a ciascun campione e ibridare tutta la notte a 60 gradi Celsius in un forno di ibridazione.Processare i campioni con tre lavaggi di 10 minuti ciascuno con SSC 2x a 60 gradi Celsius nel forno di ibridazione. In modo importante, rimuovere qualsiasi attività di fosfatasi alcalina endogena mediante un lavaggio con SSC 2x per 60 minuti a 70 gradi Celsius in un blocco termico ISO. Lavare i campioni con PBS per cinque minuti.Ora sostituire il PBS e aggiungere un microlitro di 10 milligrammi per millilitro. RNAs A e incubare per 60 minuti a 37 gradi Celsius in un blocco termoregolato ISO. Scartare il PBS contenente RNAs A e lavare tre volte con la soluzione di lavaggio per 10 minuti ciascuna.Infine, riscaldare e attivare qualsiasi RNA rimanente mediante incubazione per 60 minuti a 70 gradi Celsius in un blocco termico ISO. L'ultimo passaggio consiste nella visualizzazione della sonda ribosomiale. Incubare i campioni in un volume di buffer di blocco per un'ora.Scartare il buffer di bloccaggio e aggiungere due millilitri di buffer di bloccaggio contenente un microlitro di anticorpo anti-ditch a ciascun campione. Incubare tutta la notte, quindi lavare più volte con buffer di lavaggio 1x come indicato. Successivamente, incubare i campioni in buffer di lavaggio 1x per tutta la notte.Risciacquare i campioni con un volume di buffer di rilevamento per 10 minuti e trasferire i campioni in una piastra a pozzetti. Scartare il buffer e sviluppare il colore con BM purple poiché BM.Purple è sensibile alla luce. Coprire con stagnola o una scatola quando si raggiunge l'intensità del segnale desiderata.Lavare i campioni con un volume di buffer di rilevamento nelle pozzette per cinque minuti. Acquisire le immagini dei campioni mediante microscopia a trasmissione oppure conservarli in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius. Rimuovere i coloranti lipofili dal tessuto mediante una serie di etanolo a concentrazione crescente, se necessario.Quindi reidratare il tessuto aggiungendo progressivamente PBS nell'arco di cinque-dieci minuti. Bloccare ora il tessuto per un'ora a 2,5% di siero normale di capra e 0,5% di Triton X-100 a temperatura ambiente su un agitatore, incubare con l'anticorpo primario diluito nella soluzione di blocco per 48 ore a quattro gradi Celsius su un agitatore, lavare tre volte con PBS per un'ora ciascuno, bloccare nuovamente i campioni, quindi incubare con l'anticorpo secondario coniugato con fluorocromo, diluito nella soluzione di blocco, per 12-24 ore a quattro gradi Celsius su un agitatore. Da questo momento in poi, è necessario proteggere i campioni dalla luce, poiché gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce.Di nuovo, lavare i campioni tre volte con PBS per un'ora ciascuna. Infine, analizzare i campioni mediante imaging con microscopia epifluorescente e a scansione laser confocale. Per l'inclusione in resina epossidica e il sezionamento, è necessario fissare il tessuto in 2,5% glutaraldeide e 1% PFA in tampone fosfato 0,1 M, generalmente per tutta la notte in un vial di vetro, disidratare il tessuto mediante incubazioni in etanolo a concentrazioni crescenti, quindi passare ai solventi con un'incubazione 1:1 di etanolo assoluto in ossido di propilene per cinque minuti, seguita da cinque lavaggi di dieci minuti ciascuno in ossido di propilene. Infiltrare il campione con resina mediante una semplice incubazione 1:1 di ossido di propilene in resina per tutta la notte su un agitatore.Versare la soluzione con il campione in uno stampo piatto per inclusione e lasciare in evaporazione sull'banco per quattro-sei ore per far evaporare l'ossido di propilene. Trasferire i campioni in resina al 100% per quattro ore nello stampo finale. Includere i campioni in resina e apporre un'etichetta.Lasciare polimerizzare la resina incubando a 60 gradi Celsius per 24-48 ore. Per ridurre al minimo la resina estranea, modellare il blocco di resina con una lametta da rasoio secondo necessità. Su un ultramicrotomo.Tagliare sezioni seriali di uno-due micron, montarle e acquisire le immagini dei campioni mediante microscopia a trasmissione e microscopia fluorescente in epifluorescenza. Diversi coloranti lipofili a diverse lunghezze d'onda possono facilitare la visualizzazione delle proiezioni centrali di tre diversi nervi cranici. Qui il colorante lipofilo viene applicato nelle porzioni periferiche dei nervi trigemino, glossofaringeo e vago.Dopo l'incubazione per la diffusione del colorante, i processi centrali del nervo verso il bulbo sono visualizzati mediante microscopia in campo chiaro. Quando il cervelletto viene dissezionato e montato in forma piatta, alcune etichettature dei processi centrali dei tre nervi marcati sono chiaramente evidenti. Mediante microscopia in campo chiaro, il microscopio confocale permette una visualizzazione tridimensionale in cui vengono illuminati specifici elementi, e l'uso di tre coloranti diversi consente la valutazione della distribuzione di ciascuna popolazione.Rispetto agli altri, qui i neuroni afferenti dell'orecchio interno sono tracciati in un topo neonato mediante neuro view. In rosso in C, ibridazione in situ per Prox1 e una combinazione di immunoreattività anti-tubulina e anti-Prox1 per visualizzare i neuroni afferenti.Inoltre, una sezione di resina epossidica spessa due micron visualizza il coclea in sezione trasversale. Quando si esegue questa procedura, è fondamentale scegliere con attenzione la posizione del colorante lipofilico. Una buona conoscenza della neuroanatomia sarà utile in questo processo; prestare inoltre attenzione a tutti i passaggi sensibili alla luce.Questa procedura ridurrà la quantità di accoppiamenti e il tempo necessario per ottenere dati pubblicabili, migliorando al contempo le informazioni sulla codistribuzione e sugli effetti collaterali nei mutanti.

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Studio dei circuiti retinici e della localizzazione molecolare mediante microscopia immunoelettronica pre-incorporata

Impara a combinare coloranti lipofili, ibridazione in situ, immunoistochimica e istologia per analizzare tessuti murini. Questo metodo integrato massimizza le informazioni da un singolo campione, correlando mutazioni genetiche con profili morfologici ed espressione genica.

La combinazione di coloranti lipofili, In situ Ibridazione, Immunoistochimica e Istologia

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