Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico
30 marzo 2011
Questo protocollo descrive una procedura per studiare la respirazione dei mitocondri isolati da muscolo scheletrico. Questo metodo è stato adattato da Scorrano Et al. (2007). La procedura di isolamento dei mitocondri richiede circa 2 ore. La respirazione mitocondriale può essere completata in circa 1 ora.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i mitocondri ed eseguire la respirazione mitocondriale. Ciò si ottiene isolando prima il muscolo scheletrico dai ratti spray. Successivamente, il muscolo viene omogeneizzato e i mitocondri vengono isolati mediante centrifugazione.
La concentrazione proteica viene quindi determinata utilizzando il saggio di Bradford. Infine, la respirazione mitocondriale viene misurata mediante poligrafia. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano il consumo di ossigeno attraverso i diversi stati di respirazione mitocondriale.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del muscolo scheletrico, come l'effetto di diversi interventi sulla funzione mitocondriale. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul metabolismo del muscolo scheletrico, può essere applicato anche ad altri organi come fegato, cervello, reni o quasi tutti i tessuti prima di iniziare la procedura. Per isolare il muscolo scheletrico, preparare le seguenti soluzioni, P-B-S-P-B-S più 10 millimolare EDTA, otto volte il tampone di isolamento del tampone mitocondriale uno o IB uno, il tampone di isolamento due o IB due e il tampone sperimentale o eb.
Per istruzioni, vedere il protocollo scritto allegato. Quindi, accendi la centrifuga e impostala a quattro gradi Celsius. Accendi un bagnomaria e impostalo a 37 gradi Celsius.
In un bel secchio, metti tre becher da 10 millilitri, un gomito da vasaio, smerigliatrici per tessuti gemma, piccole forbici chirurgiche e 10 provette per microcentrifuga sul ghiaccio. Tutto deve rimanere ghiacciato per tutta la durata dell'esperimento. Posizionare IB uno e IB due su ICE ed EB in un bagno di acqua calda.
Quindi aggiungere le seguenti soluzioni ai tre becher su becher di ghiaccio, un becher da 10 millilitri di PBS, due becher da 10 millilitri di becher P-B-S-E-D-T-A. Tre. Tre millilitri di ib. Si sopprime un ratto secondo le procedure approvate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e i succhi.
Quindi isolare rapidamente da 250 a 500 milligrammi di muscolo scheletrico con una pinza e forbici. Sciacquatela nella besciamella uno, poi trasferitela nella besca due, per omogeneizzare il muscolo. Per prima cosa, trasferiscilo nel bicchiere tre e infine tritalo con le forbici.
Trasferire la soluzione nell'omogeneizzatore di gemme Potter Elva, omogeneizzare il muscolo utilizzando un pestello motorizzato 10 volte, mantenendo il tubo sempre nel ghiaccio. Quindi, trasferire l'omogeneizzato in una microcentrifuga da due millilitri pre-raffreddata, in provette e centrifugare a 700 Gs per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante S in una nuova provetta per microcentrifuga pre-depositata e scartare la centrifuga a pellet.
Il surnatante S a 10, 500 Gs per 10 minuti A quattro gradi Celsius, trasferire lo SNAT in una nuova provetta da microcentrifuga preriempita ed etichettarla con SN one e tipo muscolare Reese. Sospendere il pellet in 500 microlitri di IB due, quindi centrifugare a 10, 500 Gs per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il supinato in una nuova provetta da microcentrifuga preriempita ed etichettarla con SN due e tipo muscolare.
Sospendere il pellet mitocondriale finale in 100 microlitri di IB due. Giralo in un mini fuge per alcuni secondi. Se è presente un pellet, trasferire il supinato in una nuova provetta da microcentrifuga preriempita e scartare il pellet La calibrazione dell'elettrodo di ossigeno è un passaggio fondamentale in questo protocollo e deve essere eseguita quotidianamente.
La calibrazione dell'elettrodo può essere completata durante l'isolamento mitocondriale. Per iniziare, aggiungere energicamente 100 millilitri di acqua distillata a una fiaschetta da 250 millilitri per 20 minuti. Per equilibrare l'acqua con il gas atmosferico, coprire l'elettrodo GRAT con alcune gocce di cloruro di potassio al 50%.
Quindi posiziona un piccolo pezzo di cartina rizla blu sopra l'elettrodo. Quindi un pezzo di membrana in PTFE. Sopra la cartina.
Applicare l'anello interno utilizzando l'applicatore ad anello, quindi posizionare l'anello esterno nella scanalatura dell'elettrodo. Collegare gli elettrodi e assemblare la base dell'anello di plastica più grande, la camera mitocondriale e i tubi dell'acqua. Accendi le caselle GRAT e avvia il software GRAS.
Aggiungere l'acqua equilibrata nella camera mitocondriale. Quindi aggiungere una barra di agitazione per accendere la barra di agitazione. Fare clic su hardware.
Quindi mescolare a velocità. Regola la velocità a 60 e fai clic su. Quindi, inizia un nuovo esperimento.
Fare clic su calibra e quindi su calibrazione della fase liquida. Per la casella uno, modificare la temperatura a 37 gradi Celsius e fare clic su OK due volte. Quando l'override cambia in, ok, fai clic su di esso e apri il serbatoio dell'azoto.
Posizionare la punta collegata al serbatoio dell'azoto nella camera e stabilire zero ossigeno. Fare clic su OK quando si passa dall'opzione Sostituisci. Aspirare l'acqua e aggiungere 500 microlitri di EB alle camere mitocondriali.
Sigillare la camera con uno stantuffo. Se si utilizzano più scatole, ripetere la procedura dal passaggio di calibrazione per ciascuna casella. Avvia un nuovo esperimento e lascialo in esecuzione per circa un minuto.
Per stabilizzare il segnale, aggiungere il volume necessario della sospensione mitocondriale per arrivare a 150 microgrammi in ciascuna camera. Contrassegna l'evento e lascialo in esecuzione. Per un minuto, aggiungere 10 microlitri di glutammato caldo da 250 millimolari, 125 millimolare di malato per una concentrazione finale di cinque millimolari di glutammato, 2,5 millimolari di malato e lasciare agire per un minuto.
Questo è definito come stato due. Successivamente, aggiungere 7,5 microlitri di 10 millimolari a DP per una concentrazione finale di 150 micromolari. Quindi segnare e lasciarlo funzionare per 30 secondi.
Questo è definito come lo stato tre. Aggiungere altri 7,5 microlitri di 10 millimolari a DP mark e lasciare agire per 1,5 minuti. Aggiungere 0,5 microlitri di oligomicina fredda da 10 millimolari per una concentrazione finale di un segno micromolare e lasciarlo scorrere per tre minuti.
Questo è definito come lo stato quattro. Aggiungere un microlitro di FCCP freddo da 0,1 millimolari per una concentrazione finale di 0,2 micromolari e lasciare RUM per tre minuti. Questo è definito come lo stato cinque.
Al termine, termina l'esperimento e salvalo. Acquisisci la frequenza respiratoria utilizzando il software della zattera. Immettere il fattore di normalizzazione.
Se si aggiungono 150 microgrammi di proteina mitocondriale, il fattore di normalizzazione sarà 0,15. Calcola le frequenze respiratorie normalizzate per i diversi stati respiratori. Calcola il rapporto di controllo respiratorio o RCR dividendo lo stato tre per lo stato quattro.
Questa figura mostra un tracciato rappresentativo del consumo di ossigeno da parte del muscolo scheletrico. Mitocondri. Dopo che il segnale dell'elettrodo è stato stabilizzato, il campione di mitocondri viene aggiunto alla camera GAT. Secondo stato, la respirazione inizia con l'aggiunta di glutammato e malato.
L'aggiunta di A DP aumenta il consumo di ossigeno. Definizione dello stato tre. Respirazione: una sintasi TP viene bloccata dall'aggiunta di una micina liga per ottenere la respirazione di stato quattro.
Infine, la FCCP viene aggiunta per disaccoppiare la respirazione mitocondriale. Questo diagramma mostra i tassi di consumo di ossigeno rappresentativi per gli stati 2, 3, 4 e cinque. Per ogni esperimento viene calcolato il rapporto di controllo respiratorio o RCR.
Un RCR superiore a quattro è considerato la prova di una preparazione mitocondriale praticabile durante il tentativo di questa procedura. È importante conservare sempre i campioni mitocondriali nel ghiaccio. Seguendo questa procedura.
Altri metodi come i Western blot possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come il contenuto di proteine mitocondriali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare il muscolo mitocondriale dal muscolo scheletrico e la respirazione mitocondriale.
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Panoramica
Questo protocollo descrive una procedura per isolare i mitocondri dai muscoli scheletrici e misurarne la respirazione. Il metodo permette la valutazione della funzione mitocondriale attraverso l'analisi del consumo di ossigeno.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Metabolismo
Sfondo
- I mitocondri svolgono un ruolo cruciale nella produzione di energia.
- Comprendere la respirazione mitocondriale è essenziale per studiare i disturbi metabolici.
- Questo protocollo è adattato da metodologie consolidate.
- L'isolamento dei mitocondri è critico per una misurazione accurata della loro funzione.
Obiettivo dello studio
- Isolare i mitocondri dal tessuto muscolare scheletrico.
- Misurare i tassi di respirazione mitocondriale.
- Analizzare il consumo di ossigeno in diversi stati di respirazione mitocondriale.
Metodi utilizzati
- Isolamento del muscolo scheletrico da ratti spray-dry.
- Omogenizzazione del tessuto muscolare.
- Centrifugazione per isolare i mitocondri.
- Determinazione della concentrazione proteica utilizzando l'assay di Bradford.
- Misura della respirazione mitocondriale mediante poligrafia.
Principali risultati
- Isolamento con successo dei mitocondri dal muscolo scheletrico.
- Valutazione quantitativa della respirazione mitocondriale.
- I risultati indicano un consumo di ossigeno variabile tra diversi stati di respirazione.
Conclusioni
- Il protocollo isola efficacemente i mitocondri per gli studi sulla respirazione.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della funzione mitocondriale nei processi metabolici.
- Questo metodo può essere applicato a ulteriori ricerche sul metabolismo muscolare.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Isolating functional mitochondria from skeletal muscle enables mechanistic de-risking of metabolic targets in preclinical discovery. Quantitative respiration readouts provide predictive confidence for target validation and pathway interrogation. This method supports early go/no-go decisions by establishing mitochondrial viability thresholds before compound screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking mitochondrial function to skeletal muscle metabolism and energy homeostasis.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized isolation of viable mitochondria with RCR ≥4 as a functional benchmark.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying respiratory control ratios that reflect mitochondrial integrity and coupling efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated mitochondrial systems for downstream biochemical and functional assays including enzyme activity and proteomics.
- Operational Value: Ensures assay standardization via daily oxygen electrode calibration and consistent protein normalization using Bradford assay.
- Scalability Value: Enables reliable compound evaluation through reproducible state 2-5 respiration measurements under controlled substrate and inhibitor conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by studying mitochondrial respiration in skeletal muscle, a key tissue in metabolic disorders.
- Operational Value: Provides translational continuity from discovery through preclinical validation via quantitative oxygen consumption across respiration states.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions by measuring uncoupled (state 5) and ATP-linked (state 3) respiration to assess bioenergetic health.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, supporting mitochondrial-targeted programs in metabolic disease.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating mitochondria to clarify pathways involved in ATP synthesis and metabolic signaling.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible respiration measurements that enable comparison of compound effects on oxygen consumption.
- Analytics: Generates quantitative readouts (state 2-5 respiration, RCR) that help teams compare conditions and assess mitochondrial function.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing functional mitochondrial data relevant to muscle metabolism and energy expenditure models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation and respiration platform applicable across skeletal muscle types and adaptable to other tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in mitochondrial viability, reduction of mechanistic ambiguity in energy metabolism studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of mitochondrial isolation and respiration assays.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in metabolic target programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on respiratory control ratios and substrate-specific respiration profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial isolation techniques, centrifugation, and respiration measurement.
- Dependent on instrumentation including homogenizers, centrifuges kept at 4°C, water baths at 37°C, and polarographic oxygen electrode systems.
- Necessitates cross-team standardization of buffer preparation, daily electrode calibration, and strict ice-cold sample handling.
- Adaptation considerations include adjusting muscle input (250-500 mg) and mitochondrial protein load (150 µg) across different skeletal muscle types.
- Practical limitations include the need for fresh reagents, short functional study window (~1 hr post-isolation), and daily calibration of oxygen electrodes.
