Sviluppo metodi per il trasporto dei macrofagi del sangue Borne Nanoformulated farmaci antiretrovirali

Lo scopo di questa procedura è quello di produrre e testare l'assorbimento cellulare, la secrezione e le proprietà antiretrovirali delle nanoparticelle antiretrovirali cristalline, che chiamiamo nano arte. Ciò si ottiene elaborando prima i farmaci antiretrovirali mediante omogeneizzazione sonica o macinazione a umido. La seconda fase della procedura consiste nel caratterizzare le proprietà fisiche delle particelle di nano arte dopo che i monociti primari sono stati isolati mediante centrifugazione in controcorrente.

Vengono coltivati per sette giorni in DMEM contenente fattore stimolante le colonie di macrofagi, o MCSF, che induce la loro differenziazione in macrofagi derivati da monociti. Il terzo passo consiste nel testare l'assorbimento, la ritenzione e il rilascio della nano arte nei macrofagi derivati dai monociti umani. La fase finale della procedura consiste nel testare l'efficacia antiretrovirale in vitro della nano art nei macrofagi derivati dai monociti.

In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano l'assorbimento facilitato e il lento rilascio di nano arte dalle cellule e una robusta efficacia antiretrovirale. Questi sono determinati mediante misurazioni dei livelli di farmaci, cromatografia liquida ad alte prestazioni o HPLC e test su materiali di coltura supinati infetti mediante misurazione dell'attività della trascrittasi inversa. Ciao, sono Hanta Aldi e sono un ricercatore post-dottorato nel laboratorio del Dr.Howard Gelman presso l'University of Nebraska Medical Center.

I metodi che presentiamo possono aiutare a rispondere a domande chiave in nanomedicina che includono il modo in cui i sistemi di somministrazione di farmaci basati su cellule possono essere utilizzati per sviluppare attività di ricerca traslazionale. Ciò può essere ottenuto utilizzando una terapia antiretrovirale nano formulata con mezze mogliette prolungate. I nostri studi supportano il potenziale utilizzo della nano arte per uso clinico.

Ciao, mi chiamo Ari Noche e sono uno studente di dottorato in medicina che lavora nel Carol Schwartz Emerging Neuroscience Laboratory. Sotto la guida del Dr. Gendelman, le implicazioni delle tecniche che vi mostriamo qui si estendono alla terapia antiretrovirale perché i composti nanoformulati possono migliorare contemporaneamente la biodisponibilità e la farmacocinetica, riducendo al contempo gli effetti collaterali correlati ai farmaci. Assumendo farmaci antiretrovirali clinicamente disponibili e riconfezionandoli in nanoparticelle, potremmo essere in grado di migliorare la compliance e anche influenzare positivamente gli esiti della malattia.

Ciao, sono il dottor Howard Gendelman. Sono uno scienziato clinico, professore e presidente del Dipartimento di Farmacologia e Neuroscienze Sperimentali qui presso l'Università del Nebraska Medical Center. Il nostro obiettivo generale è quello di semplificare i farmaci antiretrovirali per renderli facilmente disponibili e migliorare la biodistribuzione e la farmacocinetica.

Ora vi passo la parola ad Ari e Sean che vi porteranno nel laboratorio di ricerca e vi mostreranno come avviene la produzione e lo sviluppo di queste nanoparticelle. Utilità clinica e sviluppo qui presso l'Università del Nebraska Medical Center Per produrre nano arte tramite fresatura a umido. Per prima cosa pesare i cristalli del farmaco e i vari tensioattivi che verranno utilizzati per realizzare le nano formulazioni e mescolarli con un tampone heis da 10 millimolari pH 7,8 Utilizzando un miscelatore T 18 ultra Turx fino a completa dispersione, la percentuale del farmaco nella formulazione dovrebbe essere compresa tra l'uno e il 2% per la macinazione continua.

Assicurarsi che il refrigeratore e il compressore siano accesi e che la pressione di previsione sia di circa 100 PSI, ora impostata in modo che il mezzo di macinazione possa essere caricato nel serbatoio e aggiungere 50 millilitri di perline alla camera di macinazione. Utilizzando un imbuto, assicurarsi che non vi siano perline nelle filettature o in qualsiasi punto al di fuori della camera di macinazione per evitare perdite nella tenuta meccanica. Ora, assicurati che l'O-ring sia al suo posto sulla camera di macinazione.

Quindi selezionare una dimensione della maglia dello schermo appropriata e fissare i coperchi serrando i dadi. La dimensione delle maglie dello schermo deve essere almeno la metà della dimensione delle perline. Utilizzare una maglia dello schermo di grandi dimensioni per evitare che il prodotto ostruisca il filtro durante la macinazione continua.

Dopo aver abbassato la camera di macinazione, aggiungere la sospensione del farmaco con varie quantità di tensioattivi all'ingresso del prodotto. Il volume minimo della sospensione dovrebbe essere di 100 millilitri. In questo modo si evita il surriscaldamento della camera di macinazione e si evita la contaminazione del cordone a causa della minore usura delle parti.

Quindi, avviare la pompa. Per la formulazione è necessario utilizzare l'unità di controllo, variare la portata. Quindi accendere l'agitatore e regolare la velocità sull'unità di controllo.

La velocità può essere aumentata da 600 rotazioni al minuto a 4.320 rotazioni al minuto. Su un micro sur, monitorare la temperatura utilizzando l'indicatore di temperatura fissato sulla parte superiore della camera di macinazione per assicurarsi che non vi sia surriscaldamento. Ora macinare il campione a varie velocità e portate ed estrarre piccole aliquote di circa un millilitro della formulazione per misure di dimensioni e carica utilizzando un misuratore di malvern zeta a diffusione di luce di diffrazione.

Dopo aver ottenuto la pezzatura desiderata, arrestare la macinazione tramite la centralina e con la pompa ancora accesa raccogliere il campione in un pallone, lasciando defluire completamente il farmaco. Ricordarsi di spegnere la pompa al termine e di rimuovere e pulire le perline. Ora trasferisci la sospensione del mulino in provette da centrifuga da 50 millilitri e imposta la centrifuga a 10.000 rotazioni al minuto per 30 minuti.

Al termine del ciclo di centrifugazione, misurare la quantità di sate e sostituirla con la stessa quantità di soluzione di tensioattivo fresco. Una volta completata la sospensione Resus, trasferire la sospensione nella camera di macinazione e macinare per 10 minuti. Prelevare un'aliquota di circa un millilitro e misurare nuovamente la dimensione e la carica del campione utilizzando il calibratore Zeta.

Infine, misurare la concentrazione delle formulazioni di nano arte utilizzando HBLC per produrre nano arte tramite omogeneizzazione. Utilizzando Avastin Emulex C five, preparare i cristalli del farmaco e i vari tensioattivi come descritto in precedenza, quindi trasferire la sospensione nel recipiente omogeneizzante e iniziare il ricircolo. Assicurarsi che il refrigeratore sia acceso prima di iniziare a omogeneizzare il campione.

Aumentare gradualmente la pressione fino a quando lo strumento non legge 20.000 più o meno 2000 PSI e continuare a omogeneizzare fino a raggiungere la dimensione delle particelle target. Questo di solito richiede tra i 45 e i 60 minuti. Prelevare periodicamente un Eloqua di circa un millilitro e misurare la dimensione e la carica del campione utilizzando una centrifuga zeta sizer, la sospensione omogeneizzata come descritto in precedenza.

Quindi, dopo la sospensione Resus, trasferire la sospensione nell'omogeneizzatore C five. Riavviare la circolazione e riportare la pressione di omogeneizzazione a 20.000 più o meno 2000 PSI e omogeneizzare per 30 minuti per produrre tramite sonicazione utilizzando il processore a ultrasuoni Palmer a freddo. Versare il clorometano PLGA e la soluzione farmacologica in una soluzione di tensioattivo PVA all'1% e metterlo in un bagno di ghiaccio nell'ultrasuono.

Avviare la sonicazione al 50% di ampiezza, anche se l'ampiezza del sonicato può essere ridotta a circa il 30% di ampiezza per lotti più piccoli di campioni, sonicare il campione per 10 minuti. Estrarre una piccola aliquota per l'analisi granulometrica. Se la dimensione delle particelle è superiore a 1,5 micron, sonicare i campioni a intervalli di due minuti fino a un massimo di 16 minuti totali.

Osservare i campioni al microscopio con un ingrandimento di 20 volte e documentare le osservazioni. Utilizzare una piastra di agitazione per creare un vortice adeguato per la sospensione e continuare a mescolare per una notte a temperatura ambiente. Raccogliere la sospensione dopo 24 ore e versarla in provette da centrifuga da 50 millilitri.

Centrifugare i campioni a una velocità di 8.000 rotazioni al minuto per 20 minuti a cinque gradi SIU, decantare il supinato e risospendere metà del campione in 75 millilitri di acqua di osmosi filtrata e l'altra metà in 75 millilitri di tensioattivo al bromuro di trimetilammonio allo 0,5%. Centrifugare nuovamente i campioni a una velocità di 8.000 rotazioni al minuto per 20 minuti a cinque gradi Celsius e risospendere ciascuno dei pellet con un totale di 20 millilitri di soluzione di mannitolo. Infine, per le particelle prodotte tramite omogeneizzazione o sonicazione, misurare la dimensione delle particelle utilizzando il misuratore zeta e misurare la concentrazione dei campioni utilizzando l'HPLC.

Per prepararsi alla visualizzazione con la microscopia, prendere le sospensioni di nano arte preparate e sonicarle per 10 secondi. Con una sonda di sonicazione al 20% di ampiezza, prelevare un vetrino coprivetrino per microscopio e posizionarlo su un microscopio invertito. Sul vetrino di presentazione.

Mescolare 15 microlitri della sospensione nano art con 100 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato e miscelare pipettando su e giù più volte. Quindi visualizza le nanoparticelle utilizzando un obiettivo 20 volte per visualizzare la morfologia. I campioni possono anche essere preparati per la visualizzazione con la microscopia elettronica a scansione.

Qui vediamo le immagini ottenute dal microscopio elettronico a scansione a scansione a emissione di campo a bassa tensione A-J-E-O-L 6 3 0 0 F dopo l'isolamento di monociti trasportati dal sangue mediante centrifugazione a monociti purificati a una concentrazione di una volta 10 per sei cellule per millilitro a DMEM integrato con i seguenti additivi. Quindi piastra due volte 10, le sei cellule per pozzetto in piastre a sei pozzetti all'interno di un'atmosfera umidificata, integrata con il 5% di anidride carbonica e una coltura per sette giorni al fine di consentire ai monociti di differenziarsi in macrofagi per analizzare l'assorbimento e la raccolta cellulare. Mescolare la nano arte con i terreni di coltura fino a una concentrazione finale di 100 micromolari e aggiungere un millilitro di terreno di trattamento a ciascun pozzetto nel momento desiderato o quando le cellule sono completamente cariche di nano arte.

Rimuovere tutto il terreno di trattamento e lavare le cellule tre volte con un millilitro di PBS per rimuovere eventuali particelle che non sono state assorbite dalle cellule in un millilitro di PBS. Rimuovere le cellule di aderenza dal fondo del pozzetto utilizzando un sollevatore di cellule e posizionarle in una provetta da microcentrifuga da 1,7 millilitri. Ora centrifugare le celle a 1000 RCF a quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Rimuovere il supinato e aggiungere 200 microlitri di metanolo al 100%, posizionare le cellule e sciogliere la nano arte sonicando brevemente il pellet con una sonda sonica al 20% di ampiezza per due o cinque secondi. Conservare i campioni a una temperatura di meno 80 gradi Celsius fino al momento di analizzare il contenuto del farmaco. La ritenzione intracellulare della nano arte può anche essere visualizzata utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione dopo che le sezioni sono state preparate da un microtomo, come si vede qui.

Vedere il testo di accompagnamento a questo articolo per i dettagli sull'analisi delle cellule di trattamento a rilascio di nano arch, come descritto in precedenza, per l'analisi dell'assorbimento e della raccolta cellulare. Tuttavia, invece di raccogliere le cellule dopo il lavaggio, sostituire il PBS con due millilitri di terreno di coltura cellulare senza MCSF e senza nano art nei giorni indicati o come indicato dal terreno che diventa giallo, scambiare metà del terreno nel giorno desiderato. Raccogliere un millilitro di terreno cellulare insieme alle cellule replicate e al processo per l'analisi dei farmaci.

Per visualizzare l'assorbimento in tempo reale della microscopia bifocale nano art, prendere prima un DRE come vibrant e aggiungerlo al terreno Seguendo le istruzioni del produttore, aggiungere il colorante contenente terreno ai macrofagi derivati da monociti maturi, quindi risciacquare le cellule tre volte utilizzando un millilitro di terreno di coltura per rimuovere il colorante in eccesso. Ora mescola la nano arte con il terreno di coltura utilizzando la nano arte etichettata in modo fluorescente e aggiungi il mezzo di trattamento con la nano arte etichettata. Immediatamente prima dell'imaging con un microscopio confocale, acquisire un'immagine ogni 30 secondi per quattro ore utilizzando un obiettivo 60x.

Infine, è possibile eseguire test di infezione da HIV one e infettività. Innanzitutto, trattare le cellule come descritto per visualizzare il rilascio dell'arte. Quindi, nei giorni desiderati, rimuovere tutto il terreno e sostituirlo con un terreno senza MCSF contenente HIV uno ad A con una molteplicità di infezione di 0,01 particelle virali per cellula e incubare per 24 ore.

Quindi rimuovere il terreno virale e sostituirlo con virus fresco, cellule di coltura libere per 10 giorni, sostituendo metà del terreno a giorni alterni o secondo necessità per mantenere in vita le cellule 10 giorni dopo l'infezione. Raccogliere 10 microlitri di terreno da ciascun pozzetto posto in una piastra da 96 pozzetti e conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento di eseguire l'analisi della trascrittasi inversa. Possono essere eseguiti anche successivi rilevamenti di HIV uno P 24.

Qui possiamo facilmente vedere la morfologia delle cellule esposte al virus ad un'infezione moltiplicativa di 0,011 giorni dopo il trattamento con nano arte. In questi macrofagi derivati dai monociti, non vi è evidenza di infezione virale e le nanoparticelle sono facilmente visibili all'interno del citoplasma cellulare. Qui, le cellule sono state esposte al virus 10 giorni dopo il trattamento con nano arte.

Alcune di queste cellule sono state infettate come indicato dalla colorazione con P 24 e dalla formazione di cellule giganti multinucleate, ma c'era ancora una protezione significativa rispetto alle cellule non trattate. Si noti che le nanoparticelle sono ancora visibili all'interno del citoplasma delle cellule in B, ma non tanto quanto si è visto in a, queste strutture non sono presenti nelle cellule che non sono state trattate con la nano arte. In questi video confocali su cellule vive, vediamo macrofagi etichettati in verde e nano art etichettati in rosso.

Qui possiamo vedere che le cellule accumulano pochissime nanoparticelle. Qui accumulano rapidamente particelle, come indicato dall'aumento della fluorescenza rossa. Queste differenze sono parallele ai risultati che si osservano quando si analizza l'assorbimento dei farmaci Utilizzando l'HPLC, inoltre, possiamo vedere che le cellule assorbono attivamente le particelle.

La differenza tra i tassi di accumulo di nano arte cellulare riflette gli effetti di caratteristiche fisiche come dimensioni, forma e carica sulle capacità dei macrofagi di assorbire e conservare la nano arte. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre nano arte utilizzando tecniche di omogeneizzazione e sonicazione della macinazione a umido. Questi sono metodi efficaci per produrre nanoparticelle antiretrovirali.

La macinazione a umido e l'omogeneizzazione servono a frazionare le particelle di cristallo di farmaco più grandi in nanoparticelle più piccole all'interno dei tensioattivi lipidici e una tecnica di sonicazione produce singole goccioline di farmaco di dimensioni nanometriche all'interno di un polimero. Qui abbiamo anche dimostrato come utilizzare i macrofagi derivati dai monociti umani come piattaforma di test per valutare il trasporto di nano arte. Il nostro metodo di analisi consente uno screening molto semplice della capacità di una particella di essere assorbita, trattenuta e rilasciata dalle cellule, nonché della loro capacità di inibire la replicazione virale.

Ciò consente al ricercatore di identificare la nano arte che potrebbe avere le migliori possibilità di successo in vivo e, in ultima analisi, per l'uso negli esseri umani infetti. I risultati completi di questi esperimenti sono pubblicati nel nostro articolo Online Nano. L'articolo si intitola Nano Formulation Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics nel Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010.

Mille Grazie.