Una schermata di High Throughput per Biomining attività Cellulase da librerie metagenomiche

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare cloni che esprimono cellulasi da una libreria metagenomica. Ciò si ottiene replicando prima una libreria metagenomica precedentemente realizzata utilizzando un robot dopo l'incubazione della libreria replicata a 37 gradi Celsius per 24 ore. Viene misurata la crescita dei cloni di E coli, viene quindi aggiunta la lisi, il tampone e il substrato alla libreria replicata.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'attività della cellulasi attraverso misurazioni colorimetriche dell'assorbanza utilizzando un lettore di piastre. Ciao, sono Keith del laboratorio di Steven Hallam presso il Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università della British Columbia. Oggi vi mostreremo una procedura per lo screening funzionale ad alto rendimento di librerie metagenomiche.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'attività della biomina cellulasi dalle librerie metagenomiche. Quindi iniziamo. Prima di iniziare questo protocollo, preparare una libreria metagenomica conservata in un formato di piastra a 384 pozzetti.

Questo studio ha utilizzato il vettore SMID PCC a una copia di controllo in combinazione con Farge T a un TRANSFECT max EPI 300 T resistente a una cellula e coli resistente come ospite della libreria per avviare questa procedura, rimuovere le piastre contenenti la libreria da meno 80 gradi Celsius e scongelarle a 37 gradi Celsius per circa 20 minuti. Nel frattempo, utilizzare la funzione di sterilizzazione a luce UV sul QIX two per sterilizzare il robot per 15 minuti. Impostare il Q fill tre secondo le istruzioni del produttore con il flacone del terreno collegato al collettore tramite il programma di tubi sterili.

Il Q ne riempie tre per la quantità appropriata di supporto e lo imposta per riempire un volume di 45 microlitri. In ciascuno, spurgare bene l'aria dal tubo e dal collettore utilizzando la funzione di spurgo del robot fino a quando il fluido non è visibile. Su ciascun pin del collettore, riempire il numero desiderato di piastre con il fluido LB utilizzando il Q fill tre.

Ogni piatto impiega circa 20 secondi per riempirsi. Quindi, caricare le piastre della libreria e le piastre fresche nelle aree appropriate dei plettri Q. Per robotizzare riempire i bagni di pulizia con i reagenti appropriati.

2% micro 90 nel bagno posteriore, acqua distillata in autoclave nel bagno centrale e 80% etanolo nel bagno anteriore. Utilizzando il programma di replica del qix two, selezionare la testina appropriata, nonché il numero e i tipi di piastre di origine e di destinazione. Impostare anche la testina per la pulizia tra le repliche.

Di solito sono sufficienti sei cicli in ogni bagno. La capacità della macchina è di 10 piastre alla volta. Impostare la macchina in modo che funzioni.

Ci vorranno circa 15 minuti per replicarlo. Piena capacità con una testa a 384 pin. Una volta replicate le piastre, fai crescere le piastre a 37 gradi Celsius per 24 ore in una scatola per l'umidità.

Il lungo tempo di incubazione è necessario poiché con l'aggiunta di arabinosio viene indotto un elevato numero di copie di smid. Nel frattempo, pulire il robot Q fill three come descritto nel protocollo scritto. Dopo l'incubazione, rimuovere le piastre dall'incubatrice a 37 gradi Celsius.

Mettere da parte i coperchi e posizionare le piastre sulla piattaforma di caricamento del caricatore fornita con la pila rapida. Assicurati di tenere traccia dell'ordine delle piastre poiché il software non lo fa. Verranno lette le targhe in fondo alla pila.

Per prima cosa, rimuovi un caricatore dalla pila rapida. Assicurati che sia vuoto e spingilo sulla pila di lastre per essere letto. Afferrare il caricatore per l'impugnatura e la piastra dovrebbe caricarsi nel caricatore.

Caricare il caricatore nella pila rapida con l'orientamento corretto. Aprire il programma di scansione sul computer collegato. Seleziona la nuova sessione e assegnale un nome appropriato.

Scegliere la piastra a fondo piatto 384 pozzetti come piastra. Digitare nell'area di layout della targa. Seleziona il pulsante della procedura guidata e sceglilo per aggiungere 384 incognite alla targa.

Nell'area del protocollo, selezionare l'opzione del circuito dei pozzetti e immettere per 384 pozzetti. Un'icona a forma di pozzetto apparirà nell'albero del flusso sul lato sinistro dello schermo. Seleziona l'icona e fai clic per aggiungere la misurazione fotometrica.

Impostalo per leggere a 600 nanometri. Salva il protocollo con un nome univoco e chiudi la scansione del suo riprogramma. Quindi aprire il programma polara RS.

Nella pagina principale c'è una tabella che elenca gli strumenti collegati al dispositivo rapid stack sotto l'intestazione di scansione VARI, fare clic sull'opzione di esecuzione della sessione. La finestra del saggio dovrebbe quindi apparire con un diagramma di flusso al centro. Selezionare l'elemento Esegui sessione, quindi trovare il nome della scansione salvata.

Viene eseguito nuovamente nel menu a discesa che appare sul lato destro dello schermo. Una volta selezionato il protocollo, fare clic su Esegui. In questo test apparirà una casella che chiede quale caricatore utilizzare come fonte e quale caricatore è vuoto.

La casella inferiore sullo schermo corrisponde alla rivista anteriore. Assicurarsi che sia lo stack rapido che la scansione Vario siano attivati e fare clic su Avvia. La pila rapida caricherà automaticamente le piastre nel lettore di lastre, consentendo misurazioni continue delle lastre.

Osservare il primo caricamento delle lastre nella scansione Vario per garantire il corretto allineamento delle macchine per la lettura. 25 lastre richiedono circa 50 minuti. Una volta terminata la scansione di Barrios, rimuovere il caricatore pieno e posizionarlo sulla piattaforma di caricamento del caricatore.

Solleva il rettangolo esterno della piattaforma e il caricatore dovrebbe scivolare via, lasciando le piastre in piedi in una pila al centro. Infine, riposizionare i coperchi delle piastre per uno schermo a base di soluzione. Per ottenere prima l'attività della cellulosa, preparare la miscela di saggio utilizzando uno stock di lisi 10 volte preconfezionato.

Miscelare 50 millimolari di tampone acetato di potassio a pH 5,5 come descritto nel protocollo scritto. Quindi preparare un brodo fino a 75 milligrammi per millilitro, DIFENILE cromogenico o substrato biocida cellulare DNP in DMSO, assicurandosi che il substrato sia completamente disciolto. Aggiungere la soluzione madre di biocida cellulare DNP alla miscela di analisi fino a una concentrazione finale di 0,1 milligrammi per millilitro.

Tieni presente che ogni piastra utilizza circa 20 millilitri di soluzione e altri 50 millilitri sono necessari per tenere conto del volume morto. Impostare il riempimento Q tre come prima nella miscela di saggio su ciascuna piastra utilizzando il riempimento Q tre. Ogni piatto impiega circa 20 secondi per riempirsi.

Una volta aggiunta la miscela di saggio, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 12-16 ore. In una scatola per l'umidità, rimuovere le piastre dall'incubatrice a 37 gradi Celsius. Mettere da parte i coperchi e posizionare le piastre sulla piattaforma di caricamento del caricatore fornita con la pila rapida come prima.

Aprire il programma di scansione e impostarlo come fatto in precedenza ad eccezione della misura fotometrica, che dovrebbe essere impostata per leggere a 400 nanometri. Quindi inserire i parametri nel programma POLARA RS. Come è stato dimostrato in precedenza.

Lasciare che la scansione Vario legga le lastre. Dopo la corsa, rimuovere e smaltire le piastre. Per esportare le letture dell'assorbanza aperte, scansiona il software e scegli.

Aprire un file esistente. Seleziona la directory in cui è stata salvata la sessione e premi l'icona più per espandere l'elenco. Sotto l'intestazione del titolo ci saranno opzioni etichettate contenitore uno a contenitore N.A seconda del numero di piastre, selezionare la prima piastra da analizzare nella barra dei menu nella parte superiore della pagina, selezionare l'esportazione del rapporto dati.

Scegliere le opzioni per l'esportazione, ad esempio il layout delle lastre e i dati fotometrici. Fai clic su Visualizza rapporto, quindi su Salva file. Scegliere la directory desiderata.

Il formato di output è un foglio di calcolo Microsoft Excel. Qui, letture dell'assorbanza da un singolo 384. La piastra a pozzetti contenente un clone positivo come mostrato I cloni positivi mostrano un marcato aumento dell'assorbanza rispetto ai cloni che non esprimono attività cellulasi.

Le differenze nel tempo di analisi, nel pozzetto, nella posizione sulla piastra o nella concentrazione di DNP possono influenzare le letture assolute dell'assorbanza. Le letture dell'assorbanza relativa, come la differenza di assorbanza al di sopra della media della piastra o della colonna, sono un metodo più robusto per identificare i cloni positivi alla cellulasi. Vi abbiamo appena mostrato come identificare i cloni positivi alla cellulasi da una libreria metagenomica.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di sciogliere il lato bio della cellula DNP in DMSO e di incubare le piastre in una camera di umidità. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.