JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
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Iniziare con una miscela di plasmidi sospesi in un mezzo nutriente.
Il primo plasmide contiene un genoma virale adeno-associato ricombinante (AAV) che codifica per il gene di interesse.
Il secondo plasmide codifica le proteine Rep e Cap.
Il terzo plasmide codifica per proteine ausiliarie.
Aggiungere un agente di trasfezione alla soluzione plasmidica. Mescolare bene e incubare.
L'agente di trasfezione con carica positiva si lega al DNA plasmidico con carica negativa, formando complessi.
Introdurre i complessi in un monostrato di cellule mammifere. Incubare.
I complessi entrano nelle cellule attraverso l'endocitosi.
All'interno delle cellule, i geni codificati dal plasmide inducono l'espressione delle proteine virali.
La proteina Rep replica il genoma virale, mentre le proteine Cap formano i gusci del capside.
La proteina Rep, insieme alle proteine ausiliarie, incapsula il genoma virale replicato nei capside, formando particelle AAV complete.
I vettori AAV ricombinanti che trasportano il gene di interesse sono pronti per applicazioni di trasferimento genico.
Dopo aver generato i costrutti rAAV9 e coltivato le cellule HEK293 secondo il protocollo descritto, per trasfettare le cellule al primo gio
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