Name: Identificare gli effetti delle mutazioni BRCA1 sulla ricombinazione omologa utilizzando cellule che esprimono endogeno wild-type BRCA1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Scopri come testare varianti BRCA1 nella riparazione del DNA mediante ricombinazione omologa utilizzando cellule HeLa. Questo metodo combina RNAi e citometria a flusso per analizzare l'espressione di GFP come indicatore di riparazione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Siamo grati allo Stato dell&#39;Ohio Centro Comprehensive Cancer dell&#39;Università per il finanziamento per questo lavoro.

1. Linea cella con un substrato ricombinazione integrato <ol><li> Le cellule HeLa sono state trasformate stabilmente con PDR-GFP (plasmide 7 dono di M. Jasin, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) e mantenuti in puromicina per la selezione dei trasformanti. </li><li> Le cellule sono diversi passaggi in DMEM / FBS, contenente 10% siero fetale bovino, 2 mM GlutaMAX, 1 mM sodio piruvato, penicillina / streptomicina (100 U / mL/0.1 mg / mL), e 1,5 ug / mL puromicina. </li></ol> Il substrato ricombinazione del PDR-GFP plasmide, e in trasformanti stabili, contiene due alleli inattivi di GFP (Figura 1). Un allele è inattivo a causa dell'inclusione nella sua sequenza codificante del sito di riconoscimento degli enzimi di restrizione 18 bp per I-SCEI. Espressione di I-SCEI in queste cellule crea un doppio filamento rottura del DNA (DSB). C'è un secondo allele di GFP inattivi su questo DNA, ma la parte della sua sequenza correlata con la I-SCEI sito sul allele prima wild-type. Questo allele GFP secondo può funzionare come un donatore sequenza per ricombinazione omologa la riparazione del DSB e si tradurrebbe in un allele GFP attivo, che è prontamente rilevata mediante citometria di flusso. In alternativa, il DSB possono essere riparati con nonhomologous fine-adesione, che avrebbe distrutto l'I-SCEI sito di restrizione e si tradurrebbe in negativo GFP-cellule. Il livello di ricombinazione omologa in una cella è determinato dal conteggio della percentuale di cellule GFP-positive. Questa linea cellulare, pHeLa-DR13-9, è stato selezionato tra tutti i cloni per lo zero segnale di fondo GFP e una percentuale relativamente elevata di cellule GFP-positive sulla trasfezione con l'I-SCEI esprimendo plasmide, pCBASce. (Il pCBASce e il suo controllo vettoriale, pCAGGS, sono stati entrambi forniti da M. Jasin del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.) La linea HeLa-DR13-9 celle è disponibile presso gli autori su richiesta. 2. Trasfezione di impoveriscono BRCA1 endogena e Aggiungi Indietro BRCA1 Mutant. <ol><li> Il giorno prima della trasfezione prima (di solito un Martedì): Iniziare con un piatto di 10 cm di HeLa-DR13-9 celle di almeno il 90% confluenti. </li><li> Trypsinize in 1 ml e interrompere la reazione con l'aggiunta di 9 ml DMEM / FBS, mescolare bene nel pipettaggio. </li><li> Aggiungere 40 ml di cellule trypsinized per pozzetto di una piastra ben 24 in 0,5 ml di DME / FBS. </li><li> Giorno 1 trasfezioni (Mercoledì): le cellule devono essere confluenti ~ 40-50%, molto meno se ricominciare da capo. Trasfezione mescolando: 5 siRNA pmol + 0,3 ug BRCA1-mutante che esprime DNA plasmidico in 12,5 microlitri Opti-MEM, e 0,5 microlitri Lipofectamine 2000 a 12,5 microlitri Opti-MEM. Procedere con la transfezione secondo il protocollo Lipofectamine (Invitrogen). </li><li> Sostituire le 4-6 ore dei media dopo. L'siRNA che utilizziamo per esaurire BRCA1 si basa sul GCUCCUCUCACUCUUCAGU sequenza specificando BRCA1 3'-UTR sequenze 80.780 a 80.798 (adesione numero AY273801). </li><li> Giorno 2: Trasferire le cellule trypsinizing dalla piastra 24 bene a un piatto ben 6. </li><li> 3 ° giorno trasfezioni: 25 siRNA pmol + 0,75 ug BRCA1-mutante che esprime DNA plasmidico + 0,75 pCBASce ug (o pCAGGS controllo vettoriale) a 62,5 microlitri Opti-MEM e 2,5 microlitri Lipofectamine 2000 a 62,5 microlitri Opti-MEM. Sostituire le 4-6 ore dei media dopo. </li></ol> 3. Analisi dei trasfettate. <ol><li> Il giorno 6, trypsinize cellule di ogni pozzetto e fermare in 1 ml di DMEM / FBS. Analizzando le cellule per l'espressione GFP può essere effettuata nei giorni 5 o 7, ma a nostro parere giorno 6 funziona meglio. </li><li> Analizzare 10.000 cellule per pozzetto mediante citometria di flusso. Usiamo un Becton Dickinson strumento FACSCalibur in Ohio State University Comprehensive Cancer Center Citometria analitica risorsa condivisa. Singolo, cellule vive sono gated utilizzando i parametri scatter in avanti e laterale. GFP-positive le cellule vengono rilevati tramite il rilevatore GFP fluorescenza (FL1), ed i risultati sono presentati come un istogramma (figura 2, in basso). </li><li> Sinistra su cellule possono essere saltuariamente per la fotografia al microscopio a fluorescenza, se desiderato. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: BRCA1 regola il percorso per la riparazione delle doppie rotture del DNA bloccati dalla ricombinazione omologa 6,11. Quelle cellule che hanno subito la riparazione per ricombinazione omologa sono prontamente rilevate al microscopio a fluorescenza (Figura 2, in alto). Esaurimento dei risultati BRCA1 in una diminuzione della GFP-positive rilevate cellule (Figura 2, a destra). L'output del FACSCalibur è un istogramma con intensità GFP per cella sul asse X e il numero di celle dell'asse Y (Figura 2, in basso). In un tipico insieme di risultati di un singolo esperimento, il 15,5% delle cellule sono state GFP-positive dopo la I-SCEI espressione e di controllo esaurimento RNAi (Figura 3). In confronto, l'esaurimento di BRCA1 e vettore aggiungere di nuovo ridotto GFP-conversione al 0,7%. Add-back di tipo selvaggio BRCA1 o di BRCA1 (I21V) completamente restaurato ricombinazione omologa, come rilevato da ottenere 15-16% delle cellule GFP-positive. Add-posteriore del (BRCA1 M18T) mutante (Figura 3, corsia 5) ha avuto un effetto simile a quello della reintegrazione del controllo vettoriale. Dato che questa variante espressa a livelli simili a quelli della proteina endogena 9, abbiamo quindi interpretare le (M18T) BRCA1 variante non è funzionale a ricombinazione omologa. Noi in genere hanno il 10-20% delle cellule convertire GFP-positive dopo la trasfezione I-SCEI plasmide di espressione. L'esaurimento delle BRCA1 riduce riproducibile la conversione di cellule GFP-positive di circa 8-10 volte. Anche se le percentuali effettive di GFP-positive cellule possono cambiare da esperimento per esperimento, il rapporto tra le cellule GFP-positive a seguito di esaurimento BRCA1 rispetto al depauperamento controllo all'interno di un esperimento è del tutto coerente. Noi normalizzare i risultati impostando il tasso di conversione disinibita al 100% e risultati esprimono con svuotamenti BRCA1 e aggiungere-backs come percentuali. In questo modo, siamo in grado di combinare molteplici esperimenti, e la variazione sperimentale non è elevato. Aggiungere nuovamente di mutanti BRCA1 hanno finora dato risultati robusti: ogni variante BRCA1 o ha completamente restaurato ricombinazione omologa attività o ha avuto alcun effetto. Una considerazione importante per ottenere questi risultati è che le nostre condizioni di trasfezione produrre livelli di proteina BRCA1 che approssimativamente uguale alla concentrazione della proteina endogena in cellule non trattate. Troppo alto di una sovraespressione di anche un mutante difettoso di BRCA1 può comportare in alcuni positivi attività ricombinazione omologa. Un problema che abbiamo dovuto superare è stata la tossicità di trasfezione. L'esaurimento delle BRCA1 si può rallentare la crescita cellulare, e l'equilibrio del DNA Lipofectamine-2000 e plasmide rispetto al numero di celle nel piatto deve essere tenuto ad un livello costante. DNA troppo Lipofectamine o plasmide sarà ridurre il numero delle cellule, e il numero di cellule non sarà sufficiente per ottenere risultati affidabili citometria a flusso. Il saldo dei reagenti plasmide e Lipofectamine rispetto al numero di cellule trasfettate è molto importante per il mantenimento della vitalità delle cellule. <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Il substrato ricombinazione. La strategia che era stato sviluppato dal gruppo di M. Jasin 7,12 è raffigurato. Il PDR-GFP plasmide contiene due alleli difettosi di GFP, uno dei quali contiene un I-SCEI sito endonucleasi di restrizione. Un derivato linea cellulare HeLa contiene questo substrato di DNA integrato in un unico sito nel genoma 9, e la riparazione attiva della doppia elica del DNA rompere al I-SCEI sito ricombinazione omologa risultati nella conversione di un allele di GFP-positive. <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Rilevamento di GFP-positive le cellule al microscopio a fluorescenza. Le cellule sono state testate di cui al presente protocollo e di controllo impoverito le cellule erano attivi in ​​ricombinazione omologa, come rilevato da un'alta percentuale di cellule con espressione di GFP (a sinistra). L'esaurimento delle BRCA1 dai risultati RNAi in una forte riduzione del numero di cellule GFP-positive (a destra). <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. I risultati di un add-back di mutanti missense BRCA1. I risultati di un singolo esperimento sono riportati in questo istogramma. In assenza di transfettate I-SCEI esprimendo plasmide (corsia 1) non ci sono cellule GFP-positive rilevate. I risultati in corsie 2-6 sono stati tutti presi dalle cellule in cui è stato transfettate I-SCEI plasmide che esprime al giorno 3. Nelle cellule che sono state esaurite per un gene irrilevante (luciferasi) e con vettore aggiungere-back, il 15,5% delle cellule sono state GFP-positive (corsia 2). L'esaurimento delle BRCA1 e vettore di add-back rivela l'effetto della perdita di BRCA1 sulla ricombinazione omologa (corsia 3). Gli effetti di impoverimento delle BRCA1 e add-retro di wild-type BRCA1 (corsia 4), BRCA1 (M18T) (corsia 5), ​​e BRCA1 (I21V) (corsia 6) sono mostrati. Questi risultati provengono da un singolo esperimento, e potrebbe essere combinata con almeno due esperimenti ripetere più al fine di ottenere una misura della ricombinazione omologa supportata da una data proteina BRCA1 mutato.

<ol><li>Carvalho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cancer+risk+associated+with+germ+line+BRCA1+missense+variants+by+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis.</a> Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).</li>
<li>Couch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+epidemiology+of+BRCA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Genetic epidemiology of BRCA1.</a> Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).</li>
<li>Couch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+functional+effects+of+unclassified+genetic+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Assessment of functional effects of unclassified genetic variants.</a> Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).</li>
<li>Tomlinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+breast+cancer+cell+line+derived+from+a+germ-line+BRCA1+mutation+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier.</a> Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).</li>
<li>Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-predisposing+mutations+within+the+RING+domain+of+BRCA1%3A+loss+of+ubiquitin+protein+ligase+activity+and+protection+from+radiation+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).</li>
<li>Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brca1+controls+homology-directed+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Brca1 controls homology-directed DNA repair.</a> Mol Cell. 4, 511-518 (1999).</li>
<li>Nakanishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Fanconi+anemia+monoubiquitination+pathway+promotes+homologous+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).</li>
<li>Pierce, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+breaks+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Double-strand breaks and tumorigenesis.</a> Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).</li>
<li>Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+breast+tumor+mutations+in+BRCA1+that+abolish+its+function+in+homologous+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination.</a> Cancer Res. 70, 988-995 (2010).</li>
<li>Easton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genetic+assessment+of+1%2C433+sequence+variants+of+unknown+clinical+significance+in+the+BRCA1+and+BRCA2+breast+cancer-predisposition+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes.</a> Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).</li>
<li>Snouwaert, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+deficient+embryonic+stem+cells+display+a+decreased+homologous+recombination+frequency+and+an+increased+frequency+of+non-homologous+recombination+that+is+corrected+by+expression+of+a+brca1+transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene.</a> Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).</li>
<li>Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ku+DNA+end-binding+protein+modulates+homologous+repair+of+double-strand+breaks+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells.</a> Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).</li>
<li>Spearman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+applicable+models+to+characterize+BRCA1+and+BRCA2+variants+of+uncertain+significance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance.</a> J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).</li>
<li>Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+BRCA1+ring+finger+variants+of+uncertain+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance.</a> Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il vantaggio di questo metodo è che possiamo studiare la funzione della proteina BRCA1 nella regolazione della riparazione del DNA per ricombinazione omologa utilizzando cellule che hanno wild-type BRCA1 endogenamente espresso. Abbiamo adottato due metodi distinti costituiti di studiare il processo di ricombinazione omologa e di utilizzare l&#39;RNAi mediato esaurimento per ottenere il nuovo metodo per il test per la funzione varianti BRCA1 nella riparazione del DNA. La chiave per il successo di questo metodo è stato quello di stabilire una linea di cellule facilmente transfectable, come ad esempio HeLa, con il substrato ricombinazione del genoma in modo tale che si ottengono livelli molto alti di conversione GFP. Avevamo proiettato più cloni della trasformazione originale al fine di ottenere uno che non aveva segnale rilevabile GFP fondo, ma dopo trasfezione delle I-SCEI plasmide di espressione aveva un livello molto elevato di conversione GFP. Con questo metodo, ora stiamo studiando altri specifici residui di aminoacidi BRCA1 per la funzione di ricombinazione omologa. Insieme con la intuizioni biologico da questo lavoro, queste conclusioni possono essere applicate alla genetica clinica sul cancro. Un&#39;alta percentuale di BRCA1 mutazioni missense sono sconosciute significato clinico poiché ci sono molte varianti rare e non ci sono informazioni sufficienti per molte di queste per determinare l&#39;associazione del cancro attraverso l&#39;analisi di segregazione genetica 3,10,13,14. Utilizzando questo metodo, le conseguenze di una variante specifica per la funzione biologica di BRCA1 nella regolazione della ricombinazione omologa potrebbero essere utilizzati per informare le donne che svolgono una di queste varianti nel loro genoma.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>9871-5200</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-GR312</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr></tbody></table>

identificare gli effetti delle mutazioni brca1 sulla ricombinazione omologa utilizzando cellule che esprimono endogeno wild-type brca1

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

L&#39;analisi funzionale di mutazioni missense può essere complicata dalla presenza nella cellula della proteina endogena. Struttura-funzione di analisi del BRCA1 sono state complicate dalla mancanza di un test affidabile per la proteina BRCA1 pieno lunghezza e le difficoltà insite nel lavoro con linee cellulari che esprimono proteine ​​BRCA1 hypomorphic 1,2,3,4,5. Abbiamo sviluppato un sistema in cui la proteina BRCA1 endogena in una cella è stato acutamente impoverito da RNAi intese a promuovere l&#39;3&#39;-UTR del mRNA BRCA1 e sostituito da co-trasfezione un plasmide che esprime una variante del gene BRCA1. Un vantaggio di questa procedura è che il silenzio acuto di sostituzione BRCA1 e simultanea permettono alle cellule di crescere senza mutazioni secondarie o adattamenti che potrebbero sorgere nel corso del tempo per compensare la perdita della funzione del gene BRCA1. Questo impoverimento e add-back procedura è stata fatta in un HeLa derivate linea cellulare che è stato prontamente analizzati per attività di ricombinazione omologa. La ricombinazione omologa test si basa su un metodo precedentemente pubblicato con il quale è integrato un substrato ricombinazione nel genoma (Figura 1), 6,7,8,9. Questo substrato ricombinazione ha il raro taglio I-SCEI sito enzima di restrizione all&#39;interno di un allele inattivo GFP, ed è a valle un allele secondo GFP inattivo. Trasfezione del plasmide che esprime I-SCEI si traduce in un doppio filamento pausa, che può essere riparato per ricombinazione omologa, e se ricombinazione omologa fa riparare la rottura che crea un allele attivo GFP che è prontamente segnato mediante citometria di flusso per l&#39;espressione della proteina GFP . L&#39;esaurimento delle BRCA1 endogena comportato un 8-10-fold riduzione dell&#39;attività ricombinazione omologa, e aggiungere-back di tipo selvaggio funzione plasmide ricombinazione omologa completamente restaurato. Quando mutanti specifico punto di BRCA1 lunghezza sono stati espressi dal co-trasfettate plasmidi, l&#39;effetto della mutazione missense specifico potrebbe essere segnato. A titolo di esempio, l&#39;espressione della (M18T) proteina BRCA1, una variante di significato clinico sconosciuto 10, è stato espresso in queste cellule, non è riuscito a ripristinare BRCA1-dipendente ricombinazione omologa. Al contrario, espressione di un&#39;altra variante, anche di significato sconosciuto, BRCA1 (I21V) completamente restaurato BRCA1-dipendente funzione di ricombinazione omologa. Questa strategia di test della funzione di BRCA1 mutazioni missense è stato applicato a un altro sistema biologico dosaggio per la funzione centrosoma (Kais et al, osservazioni non pubblicate). Nel complesso, questo approccio è adatto per l&#39;analisi dei mutanti missense in qualsiasi gene che deve essere analizzato recessiva.

Forniamo un metodo per testare le varianti BRCA1 in un test di coltura di tessuti a base di ricombinazione omologa la riparazione del danno al DNA mediante deplezione delle proteine ​​endogene BRCA1 da una cella con RNAi e la sua sostituzione con un mutante punto BRCA1 che contiene un cambio di codifica.

Identificare gli effetti delle mutazioni BRCA1 sulla ricombinazione omologa utilizzando cellule che esprimono endogeno wild-type BRCA1

L'analisi funzionale delle mutazioni missenso può essere complicata dalla presenza della proteina endogena all'interno della cellula. Le analisi struttura-funzione di...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è verificare la presenza di varianti specifiche nella proteina BRCA1 mediante un saggio in vitro di ricombinazione omologa. Questo viene ottenuto sostituendo la proteina BRCA1 di tipo selvaggio endogena con la variante in esame attraverso la trasfezione, in un primo passaggio, di RNA interferenti specifici per BRCA1 e di un plasmide per la re-espressione delle proteine varianti di BRCA1 da testare. In un secondo passaggio, l'RNA interferente e il plasmide per l'espressione della variante mutata di BRCA1 vengono co-trasfettati insieme a un plasmide per l'espressione della proteina ISCE1, che induce un danno al DNA in un sito specifico del genoma della cellula in esame. Successivamente, le cellule vengono incubate per due o tre giorni per consentire il verificarsi del danno e della riparazione del DNA. I risultati ottenuti indicano se specifiche varianti proteiche della proteina BRCA1 siano funzionali nel processo di riparazione del DNA mediante ricombinazione omologa, in base all'analisi mediante citometria a flusso delle cellule che esprimono GFP.Questa tecnica combina due metodi consolidati al fine di creare un sistema versatile per l'analisi di specifiche varianti proteiche nel riparo dei danni al DNA mediante ricombinazione omologa. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che i metodi precedentemente stabiliti si basavano su linee cellulari con un knockout genetico di BRCA1. Utilizziamo una linea cellulare più agevole derivata da cellule HELOC che consente l'esaurimento di BRCA1 mediante interferenza dell'RNA della proteina endogena e il reintegro della proteina di prova in queste cellule.Ora, esprimendo una variante della proteina BRC1, possiamo eseguire un test per la ricombinazione omologa. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà a causa della morte cellulare eccessiva durante la procedura. È fondamentale impostare con attenzione le condizioni di transfezione, massimizzando l'effetto della reazione di ricombinazione e limitando al contempo la citotossicità.Prima dell'inizio di questo protocollo, la linea cellulare hela DR 13 nine è stata ottenuta trasfettando cellule hela con il plasmide P-D-R-G-F-P. Mantenere la linea cellulare su piastre di Petri da 10 centimetri in puromicina per la selezione delle cellule stably trasfettate. Il substrato di ricombinazione presente nel plasmide P-D-R-G-F-P e nei transformanti stabili contiene due alleli inattivi di GFP. Uno degli alleli è inattivo a causa dell'inserimento del sito di riconoscimento di 18 paia di basi per l'enzima di restrizione ISCE uno.Nella sua sequenza codificante, l'espressione di ISCE1 in queste cellule genera un'interruzione del DNA a doppio filamento (DSB) sul secondo allele di GFP inattivo. La porzione della sua sequenza correlata al sito I-SCEI sul primo allele è di tipo selvaggio. Questo secondo allele di GFP può fungere da donatore di sequenza per la riparazione mediante ricombinazione omologa del DSB e porterebbe alla formazione di un allele di GFP attivo, facilmente rilevabile mediante citometria a flusso il giorno precedente al primo transfezionamento.Prelevare una piastra da 10 centimetri di cellule HeLa DR 13-9 con una confluenza di almeno il 90%. Incubare le cellule con tripsina in un millilitro per due-tre minuti. Arrestare la reazione aggiungendo nove millilitri di D-M-E-M-F-B-S e mescolare bene la sospensione cellulare mediante pipettaggio. Aggiungere 40 microlitri di cellule trypsinizzate per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti, in 0,5 millilitri di D-M-E-M-F-B-S, e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tutta la notte.Al primo giorno, le cellule dovrebbero avere una confluenza compresa tra il 40 e il 50%. Iniziare la trasfezione mescolando sia l'irna per esaurire la b RCA endogena uno sia il plasmide esprimente la mutante B RCA uno in mezzo ottimale. Successivamente, combinare gli acidi nucleici con il lip in mezzo ottimale.Procedere con la trasfezione mediante lipectomia secondo le istruzioni del produttore dopo la trasfezione. Reintrodurre le cellule nell'incubatore. Sostituire il mezzo di coltura quattro-sei ore più tardi con un mezzo privo di antibiotici.Riportare le cellule in incubazione durante la notte al secondo giorno. Dopo una breve incubazione a 37 gradi Celsius, aggiungere 0,3 millilitri di reagente trip trip tripsina in ogni pozzetto per trattare le cellule, quindi staccarle aspirando e dispensando su e giù nel reagente tripsina. Una volta completata la tripsinizzazione, trasferire le cellule dalla piastra a 24 pozzetti a una piastra a 6 pozzetti contenente due millilitri di D-M-E-M-F-B-S per arrestare l'attività della tripsina.Lasciare che la piastra a sei pozzetti incubi tutta la notte nelle stesse condizioni di due giorni dopo la transfezione iniziale. Preparare il SIR A, il DNA plasmidico mutante BRCA1 e il plasmide ISCE1 in 62,5 microlitri di Optum. Mescolare questa soluzione con 2,5 microlitri di LIPECTOMY 2060 e 2,5 microlitri di Optum.Procedere alla trasfezione delle cellule dopo un'incubazione di quattro-sei ore. Sostituire il mezzo con D-M-E-M-F-P-S privo di antibiotici. Reintrodurre le cellule nell'incubatore al sesto giorno.Incubare le cellule in ogni pozzetto con 0,5 millilitri di reagente tripsina. Arrestare la reazione aggiungendo due millilitri di D-M-E-M-F-B-S e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1000 giri al minuto per cinque minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in un millilitro di D-M-E-M-F-B-S fresco ed analizzare 10.000 cellule per pozzetto per l'espressione di GFP.Mediante citometria a flusso, le singole cellule vive vengono selezionate utilizzando parametri di diffusione anterograda e dimensionale. Le cellule positive per GFP vengono rilevate tramite il detector della fluorescenza GFP e i risultati sono presentati come un istogramma. Le cellule rimanenti possono essere riseminata per la ripresa fotografica mediante fluorescenza.La microscopia del BRCA1 desiderato regola il percorso di riparazione delle rotture del DNA a doppio filamento mediante ricombinazione omologa. Le cellule che hanno subito riparazione mediante ricombinazione omologa sono facilmente rilevabili mediante microscopia fluorescente. L'esaurimento del BRCA1 mediante RNAi determina una netta diminuzione delle cellule positive per GFP rilevate.L'output dell'FCA è un istogramma con l'intensità di GFP per cellula sull'asse X e il numero di cellule sull'asse Y. In assenza del plasmide esprimente transfezionato, non vengono rilevate cellule positive per GFP.I risultati nelle colonne da due a sei sono stati tutti ottenuti da cellule in cui il plasmide esprimente ISC uno è stato trasfettato al terzo giorno. In un insieme tipico di risultati provenienti da un singolo esperimento, il 15,5% delle cellule risulta positivo per GFP dopo l'espressione di ISC uno e l'abbattimento mediante RNAi di controllo per un gene irrilevante; al confronto, l'abbattimento di BRCA uno e l'inserimento di un vettore plasmidico vuoto riducono la conversione GFP allo 0,7%. L'aggiunta di BRCA uno esogeno di tipo selvatico ripristina completamente la ricombinazione omologa, come evidenziato dal recupero di cellule positive per GFP nel range dal 15 al 16%.Allo stesso modo, l'espressione di un'altra variante di significato sconosciuto. La mutazione BRCA1 I21B ha completamente ripristinato la funzione di ricombinazione omologa dipendente da BRCA1. Il ripristino della variante mutante BRCA1 M18T ha avuto un effetto simile a quello del controllo con vettore.Poiché questa variante è espressa a livelli simili a quelli della proteina endogena, ciò suggerisce che la variante BRCA1 M18T sia non funzionale nel processo di ricombinazione omologa. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di monitorare la crescita delle cellule, che si dividono lentamente e a bassa confluenza, e che la quantità di miscela di trasfezione utilizzata deve essere ridotta. È inoltre fondamentale rimuovere tempestivamente il mezzo di trasfezione.Nei giorni successivi alla trasfezione, osserviamo un elevato livello di citotossicità se nel mezzo sono presenti antibiotici. Per questo motivo, tutto il mezzo utilizzato dopo il primo giorno non contiene antibiotici dopo lo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello studio del cancro al seno per esplorare la genetica delle varianti di BRC1 con significato clinico sconosciuto nelle cliniche oncologiche.Speriamo che il saggio funzionale per BRC uno sviluppato in questo studio permetta una previsione migliore degli effetti delle varianti di BRC uno sulla predisposizione al cancro.

identifying-effects-brca1-mutations-on-homologous-recombination-using

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

l'arricchimento del gDNA per il sequenziamento NGS è uno strumento facile e potente per lo studio delle mutazioni costituzionali. In questo articolo, presentiamo la procedura per analizzare semplicemente la sequenza completa di 11 geni coinvolti nella riparazione del danno al DNA.

gDNA arricchimento da una tecnologia basata trasposasi-NGS per l'analisi della sequenza intera BRCA1, BRCA2, e 9 geni coinvolti nella riparazione del DNA Damage

Il silenziamento genico da parte di siRNA rappresenta una comoda strategia sperimentale per analizzare le funzioni biologiche dipendenti da BRCA2 con implicazioni immediate per comprendere meglio la biologia del cancro. Viene presentato un metodo per silenziare in modo efficiente BRCA2, insieme alla procedura sperimentale per rilevare e quantificare i cambiamenti nell'espressione della proteina BRCA2 mediante immunoblotting in linee cellulari umane.

Silencing di<em&gt; BRCA2</em&gt; Per identificare le funzioni biologiche Novel BRCA2-regolamentato coltivate cellule umane

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro di un gene basate su CRISPR/Cas9 modifica del sistema per la riparazione delle mutazioni puntiformi in cellule di mammifero. Qui, usiamo un approccio combinatorio di gene editing con una dettagliata strategia sperimentale proseguimento per misurare indel formazione nel sito di destinazione — in sostanza, l'analisi in loco mutagenesi.

Una metodologia Standard per esaminare in loco mutagenicità in funzione della mutazione di punto riparazione catalizzata da CRISPR/Cas9 e SsODN in cellule umane

Riparazione di rotture a doppio filamento del DNA è un processo dinamico, che richiede non solo la formazione di complessi di riparazione presso le pause, ma anche la loro risoluzione dopo che la lesione è indirizzata. Qui, usiamo il microscopia di immunofluorescenza per interruzioni di double-stranded transitorie e di lunga durata come strumento per sezionare questo meccanismo di mantenimento del genoma.

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

In seguito al danno al DNA, le cellule umane attivano percorsi di riparazione essenziali per ripristinare l'integrità del loro genoma. Qui, descriviamo il metodo dell'immunofluorescenza indiretta come mezzo per rilevare le proteine di riparazione del DNA, analizzare il loro reclutamento spaziale e temporale e contribuire a interrogare l'interazione proteina-proteina nei siti di danno al DNA.

Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA per immunofluorescenza

Le persone con mutazioni BRCA1 hanno un rischio più elevato di sviluppare il cancro, il che giustifica una valutazione accurata della funzione delle varianti BRCA1. Nel presente documento, abbiamo descritto un protocollo per la valutazione funzionale delle varianti BRCA1 utilizzando editor di base citosina mediati da CRISPR che consentono la conversione da C:G a T:A mirata nelle celle viventi.

Valutazione funzionale delle varianti BRCA1 utilizzando editor di base mediati da CRISPR

Nel presente protocollo, dimostriamo come visualizzare la resezione finale a doppio filamento del DNA durante la fase S/ G2 del ciclo cellulare utilizzando un metodo basato sull'immunofluorescenza.

Valutazione della resezione finale globale a doppio filamento del DNA utilizzando l'etichettatura BrdU-DNA abbinata all'imaging di discriminazione del ciclo cellulare

Qui viene presentata l'endonucleasi sgRNA/CAS9 e il protocollo di sequenziamento di nuova generazione che può essere utilizzato per identificare le mutazioni associate alla riparazione della rottura del doppio filamento vicino al promotore CD4.

Utilizzo del sequenziamento di nuova generazione per identificare le mutazioni associate alla riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da CAS9 vicino al promotore CD4

Questo protocollo descrive un saggio di giunzione delle estremità extracromosomiche non omologhe (NHEJ) e un saggio di ricombinazione omologa (HR) per quantificare l'efficienza di NHEJ e HR nelle cellule HEK-293T.

Analisi dell'unione di estremità non omologhe e dell'efficienza di ricombinazione omologa in cellule HEK-293T utilizzando sistemi reporter basati su GFP

Questo protocollo è progettato per studiare l'entità del danno al DNA che si verifica durante la replicazione del DNA. In condizioni neutre, l'induzione di rotture del DNA può essere facilmente valutata in un breve lasso di tempo. Inoltre, il protocollo è adattabile ad altri tipi di cellule e a vari reagenti per lo stress di replicazione.

Rilevamento di rotture del DNA nelle cellule umane in divisione mediante saggio della cometa neutra

Scopri come testare varianti BRCA1 nella riparazione del DNA mediante ricombinazione omologa utilizzando cellule HeLa. Questo metodo combina RNAi e citometria a flusso per analizzare l'espressione di GFP come indicatore di riparazione.

Identificare gli effetti delle mutazioni BRCA1 sulla ricombinazione omologa utilizzando cellule che esprimono endogeno wild-type BRCA1 (Video) | JoVE Journal

Identificare gli effetti delle mutazioni BRCA1 sulla ricombinazione omologa utilizzando cellule che esprimono endogeno wild-type BRCA1

Esplora altri video