Identificare gli effetti delle mutazioni BRCA1 sulla ricombinazione omologa utilizzando cellule che esprimono endogeno wild-type BRCA1

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di testare varianti specifiche nella proteina BRCA one utilizzando un saggio di ricombinazione omologa in vitro. Ciò si ottiene sostituendo la proteina BRCA one wild type endogena con la variante in fase di test attraverso la trasfezione sia dell'RNA interferente corto, specifico per BRCA one che del plasmide per la riformulazione delle proteine varianti di BRCA one del test nelle cellule come secondo passo, l'RNA interferente corto e il plasmide per esprimere BRCA mutante uno è RET resecato oltre a un plasmide per esprimere la proteina ISCE one, che provoca danni al DNA in un sito specifico del genoma del DNA della cellula in esame. Successivamente, le cellule vengono incubate per due o tre giorni al fine di consentire il danno al DNA e la riparazione, si ottengono risultati che mostrano se specifiche varianti proteiche della proteina BRCA one funzionano nella riparazione del DNA mediante ricombinazione omologa basata sull'analisi della citometria a flusso delle cellule che esprimono GFP.

Questa tecnica combina due metodi consolidati al fine di creare un sistema versatile per l'analisi di specifiche varianti proteiche nella riparazione del danno al DNA mediante ricombinazione omologa. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che i metodi precedentemente consolidati si basavano su linee cellulari che avevano un knockout genetico di BRCA one. Utilizziamo una linea cellulare più gestibile derivata da cellule HELOC che consente la deplezione di BRC one per interferenza dell'RNA della proteina endogena e l'aggiunta della proteina di prova in queste cellule.

Ora che esprime una variante BRC one protein possiamo testare la ricombinazione omologa. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa dell'eccessiva morte cellulare durante la procedura. È importante avere una condizione di transezione accuratamente impostata che massimizzi l'effetto della reazione di ricombinazione limitando la citotossicità.

Prima dell'inizio di questo protocollo, la linea a nove cellule hela DR 13 è stata stabilita mediante sezionamento di cellule hela con P-D-R-G-F-P Mantenere la linea cellulare su piastre di Petri da 10 centimetri in micina pur per la selezione di cellule trasfettate stabilmente. Il substrato di ricombinazione nel plasmide P-D-R-G-F-P e nei trasformanti stabili contiene due alleli inattivi di GFP. Un allele è inattivo a causa dell'inclusione del sito di riconoscimento dell'enzima di restrizione di 18 coppie di basi per quello ISCE.

Nella sua sequenza codificante, l'espressione di ISCE uno in queste cellule crea una rottura del DNA a doppio filamento o DSB sul secondo allele della GFP inattiva. La porzione della sua sequenza correlata con l'I SCE E un sito sul primo allele è wild type. Questo secondo allele GFP può funzionare come donatore di sequenze per la riparazione omologa a ricombinazione del DSP e risulterebbe in un allele GFP attivo, che viene prontamente rilevato dalla citometria a flusso il giorno prima della prima trasfezione.

Ottenere un piatto di 10 centimetri di hela DR 13 nove cellule che sono almeno il 90% di tripsina confluente occhi le cellule in un millilitro per due o tre minuti. Arrestare la reazione aggiungendo nove millilitri di D-M-E-M-F-B-S e mescolare bene la sospensione cellulare pipettando. Aggiungere 40 microlitri di cellule inizzate di triplo per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti in 0,5 millilitri di D-M-E-M-F-B-S incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica durante la notte.

Il primo giorno, le cellule dovrebbero essere tra il 40 e il 50% confluenti. Iniziare la trasfezione mescolando sia l'irna per esaurire il plasmide endogeno b RCA one che il mutante B RCA one che esprime il plasmide in mezzi ottimali. Quindi combinare gli acidi nucleici con il labbro in un mezzo ottimale.

Procedere con la trasfezione della lipectomia secondo le istruzioni del produttore dopo la trasfezione. Rimettere le cellule in incubazione. Sostituire il terreno da quattro a sei ore dopo con un terreno che non contenga antibiotici.

Rimettere le cellule in incubazione per una notte il secondo giorno. La tripsina è l'aggiunta di 0,3 millilitri di reagente tripla tripla tripsina a ciascun pozzetto dopo una breve incubazione a 37 gradi Celsius, allentare le cellule pipettando le cellule su e giù nel reagente tripsina. Una volta ottenuta la tripsina, trasferire le cellule dalla piastra a 24 pozzetti a una piastra a sei pozzetti contenente due millilitri di D-M-E-M-F-B-S per arrestare l'attività della tripsina.

Lasciare incubare la piastra a sei pozzetti per una notte nelle stesse condizioni di prima, due giorni dopo la trasfezione iniziale. Preparare il SIR A, il mutante BRCA che esprime il DNA plasmatico e quello ISCE che esprime il plasmide in 62,5 microlitri di Optum. Mescolare questa soluzione con 2,5 microlitri di LIPECTOMY 2060 2,5 microlitri di Optum.

Procedere alla trasfettazione delle cellule dopo un'incubazione di quattro-sei ore. Sostituire il terreno con D-M-E-M-F-P-S privo di antibiotici. Rimetti le cellule nell'incubatrice il sesto giorno.

La tripsina è costituita dalle cellule in ogni pozzetto aggiungendo 0,5 millilitri di trip e reagente tripsina. Arrestare la reazione aggiungendo due millilitri di D-M-E-M-F-B-S raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1000 RPM per cinque minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in un millilitro di D-M-E-M-F-B-S fresco e analizzare 10.000 cellule per pozzetto per l'espressione di GFP.

Mediante citometria a flusso, le singole cellule vive vengono gated utilizzando parametri diretti e di dimensione diffusa. Le cellule GFP positive vengono dirette utilizzando il rivelatore a fluorescenza GFP e i risultati vengono presentati sotto forma di istogramma. Le celle rimanenti possono essere ripiastrate per la fotografia mediante fluorescenza.

La microscopia del BRCA one desiderato regola il percorso per la riparazione delle rotture del DNA a doppio filamento mediante ricombinazione omologa. Quelle cellule che hanno subito riparazione per ricombinazione omologa sono prontamente rilevate dalla microscopia fluorescente. La deplezione di BRCA one da parte dell'RNAi provoca una forte diminuzione delle cellule GFP positive rilevate.

L'output dell'FCA è un istogramma con l'intensità GFP per cella sull'asse x e il numero di celle sull'asse Y. In assenza di trasfettato, SCE un plasmide esprimente. Non sono state rilevate cellule GFP positive.

I risultati nelle colonne da due a sei sono stati tutti presi da cellule in cui il plasmide che esprime ISC 1 è stato trasfettato il terzo giorno. In una serie tipica di risultati di un singolo esperimento, il 15,5% delle cellule è GFP positivo dopo l'espressione di I SCE 1 e controlla la deplezione dell'RNAi per un gene irrilevante per confronto con la deplezione di BRCA one e l'aggiunta di un vettore plasmidico vuoto. Ridurre la conversione della GFP allo 0,7%Aggiunta di BRCA wildtype esogena una ricombinazione omologa completamente ripristinata, come rilevato ottenendo dal 15 al 16% di cellule GFP positive.

Allo stesso modo, espressione di un'altra variante di significato sconosciuto. La mutazione BRCA one I 21 B è stata completamente ripristinata. L'aggiunta della funzione di ricombinazione omologa dipendente di BRCA one del mutante BRCA one M 18 T ha avuto un effetto simile al controllo vettoriale.

Poiché questa variante si esprime a livelli simili a quelli della proteina endogena, suggerisce che la variante BRCA one M 18 T non sia funzionale nella ricombinazione omologa. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di monitorare la crescita delle cellule, che le cellule crescono lentamente e a bassa fluidità di conffezione e che la quantità di miscela di trasfezione utilizzata deve essere ridotta. È anche importante rimuovere il mezzo di trasfezione in modo tempestivo.

Troviamo che nei giorni successivi alla trasfezione, c'è un'elevata quantità di citotossicità se gli antibiotici sono inclusi nel terreno. Per questo motivo, tutto il mezzo dopo il giorno uno manca di antibiotici Dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sul cancro al seno per esplorare la genetica delle varianti di BRC one con significato clinico sconosciuto nelle cliniche oncologiche.

Ci auguriamo che il test funzionale BRC one sviluppato in questo lavoro consenta una migliore previsione degli effetti delle varianti BRC one sulla predisposizione al cancro.