Purificazione del DNA plasmidi da colonie batteriche Utilizzando il kit Qiagen Miniprep

Sono del laboratorio di Mike Halen, Dipartimento di Fisiologia e Biofisica, Università della California, Irvine. Oggi vi mostrerò come utilizzare il mini kit in collagene per purificare il DNA da batteri. Eseguo questo passaggio come parte di un esperimento di mutagenesi mirata.

Dopo aver ottenuto il plasmide, sequenzierò l'inserto per verificare che le colonie selezionate contengano le mutazioni desiderate. Prima di effettuare la mini preparazione, introduciamo brevemente ciò che abbiamo fatto ieri. Per coltivare i batteri, devo prima inoculare cinque millilitri di LB A in provette singole.

E come potete vedere, prima di inserire i batteri nel tubo, il mezzo è limpido. Poi uso il PERS per inoculare una singola colonia da una piastra airb e cambio sempre il puntale per evitare contaminazioni. Successivamente inserisco i tubi in un agitatore e li coltivo a 300 giri al minuto per almeno otto ore, normalmente possiamo farlo durante la notte.

Esistono tre tamponi importanti nel kit di mini preparazione del collagene: P uno, P due e N tre. Normalmente manteniamo P uno a quattro gradi perché contiene RNAsi, P due lo lasciamo a temperatura ambiente, mentre N tre lo prepariamo appena prima dell'esperimento dopo otto ore.

Come puoi vedere, ora il mezzo è torbido perché all'interno stanno crescendo batteri, e preleverò cinque microlitri del mezzo su un'altra piastra. Così, una volta verificati i cloni, potrò tornare direttamente ai batteri senza dover effettuare un'altra trasformazione. Dopo aver centrifugato il mezzo, si può osservare un bel pellet batterico sul fondo del tubo e rimuoveremo il sopranatante aggiungendolo alla candeggina, in modo da evitare qualsiasi contaminazione dell'ambiente, mentre il pellet rimarrà ancora lì.

Ora aggiungo il tampone P1 ai pellet batterici. Il tampone P1 è un tampone di risospensione per risospendere i batteri. Successivamente pipetto la soluzione su e giù per mescolare i batteri con il tampone.

In questa fase, non si desidera vedere alcuna colonia batterica in soluzione. Ora trasferirò i batteri resus bender in un nuovo tubo appol. Etichetto sempre i miei tubi in modo da poterli tracciare e sapere da quale clone proviene ciascuna soluzione.

Ora aggiungo il buffer P2 in ogni provetta e il buffer P2 è un buffer di lisi per lisare i batteri. Dopo aver aggiunto il buffer P2, si può notare che la soluzione non è ancora limpida. Ora capovolgo tutte le provette diverse volte in modo che la soluzione si mescoli bene.

E ora si può osservare che la soluzione diventa limpida. Ora aggiungo il buffer N tre e in ogni provetta aggiungo il buffer M tre, ovvero il buffer di neutralizzazione. Una volta aggiunto il buffer N tre, osservo immediatamente la precipitazione delle proteine, ma comunque inverto ancora più volte le provette per mescolare accuratamente la soluzione.

Dopo aver mescolato accuratamente la soluzione. Ecco come dovrebbe apparire dopo aver aggiunto il buffer e tre. Ora utilizzerò l'SGE per centrifugare il precipitato proteico per 10 minuti. Ho assemblato un Cal VAC sei s.

Metto tutti i pezzi in ordine e poi li collego a un sistema a vuoto. Ora assisto il cal prep aid, collegando la fascetta al collettore. Oggi ne faremo solo uno, quindi blocco gli altri alloggiamenti.

Quindi abbiamo un buon vuoto. Come potete vedere, ho etichettato la fascetta in base ai miei tubi e, una volta attivato il vuoto, ottengo un buon livello di vuoto. Ok, dopo aver centrifugato il tubo, potete vedere il pellet proteico sul fondo, mentre il DNA dovrebbe rimanere disciolto nel sopranatante.

Ora trasferiamo il sopranatante, che contiene il DNA, sui listelli per la preparazione del campione di mucca, e dovrei menzionare che dobbiamo sempre cambiare i puntali per prevenire contaminazioni incrociate. Ora accendo il vuoto. Ora spengo il vuoto e aggiungo il buffer PB per lavare il listello, che al momento contiene il DNA nel filtro.

Ora aggiungo la soluzione PB alla striscia per lavarla, poiché le strisce contengono ancora DNA nel filtro. Questa volta non è necessario cambiare i puntali, purché non si tocchi la striscia. Ora aggiungo il buffer P alla striscia nello stesso modo in cui ho fatto per il buffer PB.

E ripeterò questa operazione due volte dopo aver acceso il vuoto. Come potete vedere, la soluzione P in questo momento sta attraversando la striscia e lasceremo il vuoto acceso per altri cinque minuti per assicurarci che il filtro sia completamente asciutto. Dopo cinque minuti di vuoto, togliere la striscia dalla scatola e avvolgerla con un fazzoletto Kim. Batterla contro il tavolo per rimuovere il tampone P residuo.

Ora potete vedere che non ci sono molte gocce di coperchio del tampone P e il DNA dovrebbe ancora trovarsi nel filtro. Ecco le microprovette per la raccolta. Le ho etichettate in base alla striscia.

Ora apro il vuoto del carrello e lo riassemblo con le microprovette di raccolta, assicurandomi che le fessure corrispondano alle microprovette. Questo è l'aspetto che il manifold deve avere al momento. Ecco come appare il manifold a vuoto, preparato per l'eluzione del DNA dallo strip alla microprovetta.

La striscia è in alto e il tubo si trova immediatamente al di sotto, etichettato nello stesso modo. Aggiungere ora acqua sterile sulla striscia senza applicare vuoto e lasciare in posa per un minuto. Questa volta, quando il vuoto viene mantenuto a lungo, come si può osservare, l'acqua attraversa la striscia e penetra nei microtubi di raccolta.

L'acqua contiene il DNA. Lascio anche il vuoto attivo per un po' per assicurarmi che tutta l'acqua venga raccolta. Ecco le microprovette di raccolta con la soluzione di DNA dopo questo passaggio.

Ciao, ti ho appena mostrato come utilizzare un kit di mini-preparazione del calcio per purificare l'acido nucleico dai batteri. Ora ho sequenziato l'inserzione per verificare le clone corrette e dovrei menzionare l'utilizzo di questo metodo. La resa di DNA è solitamente nell'ordine del microgrammo.

In bocca al lupo per i vostri esperimenti. Grazie per aver guardato.