Name: Isolamento di cellule staminali del mouse ghiandole salivari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Impara un protocollo ottimizzato per isolare cellule staminali dalle ghiandole salivari del topo utilizzando digestione enzimatica e meccanica. Questo metodo consente la coltura di salisfere con caratteristiche di cellule staminali per studi di medicina rigenerativa.

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1. Reggente di preparazione <ol><li> Buffer: 1% (w / v) di BSA in soluzione salina bilanciata di Hank </li><li> Ricostituire enzimi. Enzima ialuronidasi: 40 mg / mL, sciolta in tampone. Collagenasi II: 23mg / ml, sciolta in tampone. Usa appena soluzioni enzima preparato fresco per ogni isolamento. Quando sciolto, conservare a 4 ° C fino all'utilizzo per la digestione. </li><li> 50 mM di cloruro di calcio in acqua distillata. Filtrare attraverso un filtro sterilizzare 0,2 uM dimensione dei pori. </li><li> Topo ghiandola salivare (MSG) terreno di coltura: DMEM: F12 con penicillina (100 UI / ml), streptomicina (100 mg / ml), glutamax (2 mm), fattore di crescita epidermico-2 (20 ng / mL), il fattore di crescita dei fibroblasti -2 (20 ng / mL), N2 supplemento (1%), l'insulina (10 mg / mL) e desametasone (1 mM). </li></ol> 2. Tissue Digestione meccanica e enzimatica <ol><li> Pesare le ghiandole salivari sezionato. </li><li> Tritare ghiandole in una polpa omogenea utilizzando forbici sterili dissezione curve in un piccolo piatto di Petri. </li><li> Raccogliere tessuto tritata in 14 mL, utilizzando 1 ml di buffer per 80 mg di tessuto sottomandibolare. Lavare i piatti di Petri pulita di tessuto utilizzando alcuni buffer. </li><li> Aggiungere un altro 1 mL di tampone per 80 mg di tessuto, seguito da 25 microlitri soluzione enzima collagenasi II, 25 microlitri soluzione enzimatica ialuronidasi e 250 microlitri di soluzione di cloruro di calcio per 80 mg di tessuto. Se si utilizzano grandi quantità di tessuto, a pochi passi 2,4-2,9 possono essere eseguite in tessuto fiasche T25 cultura per convenienza. </li><li> Incubare a bagnomaria agitazione a 37 ° C per 20 minuti. Rimuovere i tubi e triturare con pipetta di mescolare accuratamente enzima attraverso il tessuto nuovo. </li><li> Sostituire a bagnomaria per 20 minuti. </li><li> Raccogliere i tessuti per centrifugazione a 400 xg, per 8 minuti. Gettare il surnatante. </li><li> Risospendere in 2 mL di tampone per ogni 80 mg di tessuto, e ripetere enzima e il cloruro di calcio aggiunta come sopra. Incubare 20 minuti in agitazione bagnomaria. Rimuovere i tubi e triturare con pipetta di mescolare accuratamente gli enzimi. </li><li> Incubare per 20 minuti finali in agitazione bagnomaria. Raccogliere le cellule per centrifugazione come sopra, scartare il surnatante. </li></ol> 3. Fasi di lavaggio <ol><li> Risospendere ogni 80 mg di tessuto in 2 mL di tampone e pipetta per lavare il tessuto privo di enzimi. </li><li> Centrifuga come in precedenza per la raccolta. Gettare il surnatante. </li><li> Ripetere il lavaggio con buffer di 1 ml per 80 mg di tessuto. Centrifuga per raccogliere, scartare il surnatante. </li></ol> 4. Filtraggio <ol><li> Risospendere soluzione tessuto in 1 mL di tampone per 80 mg di tessuto. </li><li> Aggiungi soluzione a 100 micron di dimensioni dei pori del filtro posto sopra tubo da 50 ml Falcon. Non applicare più di 3 ml di soluzione di tessuto macinato per colonna, i filtri possono essere bloccati. Permettono di filtrare attraverso. Rimuovere il materiale filtrato appeso inferiore del filtro con la pipetta, ed aggiungere al filtrato. </li><li> Usare siringa con 26 gauge a prendere filtrato dalla 50mL tubi e applicare i filtri a 50 micron dimensione dei pori, il 5 mL. Permettono di filtrare, assistendo allentando coperchi, se necessario. </li><li> Provette da centrifuga come in precedenza per la raccolta. Gettare il surnatante. </li></ol> 5. Placcatura e medie imprese <ol><li> Combina tutti i pellets in un unico volume. Conte con contatore automatico di cellule o emocitometro. </li><li> Cellule germi a densità di 0,4 x 10 6 cellule per pozzetto di 12 pozzetti, o 2,67 x 10 6 cellule per T25 fiasco di coltura tissutale. Aggiungere 1 ml MSG medio in ciascun pozzetto o 6 ml per ogni pallone T25. </li><li> Incubare a 37 ° C. Sfere devono essere chiaramente visibili di giorno 2. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Dopo due o tre giorni di cultura, piccoli aggregati di cellule (salispheres) sarà evidente nelle culture. Salispheres continuerà a crescere in dimensioni per un periodo di dieci giorni nella cultura. Rappresentante immagini microscopio a contrasto di fase di salispheres sono mostrati in Figura 1. Le cellule in proliferazione delle cellule staminali che esprimono proteine ​​associate marcatore può essere isolato da questi ambiti, in modo ottimale tra i giorni 3-5 isolamento post, e sono in grado di differenziazione in funzionali, le cellule acinari saliva produce. <img src="/files/ftp_upload/2484/2484fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Salisphere formazione in vitro. A seguito di digestione meccanica ed enzimatica utilizzando il protocollo attuale, sfere di dimensioni crescenti si possono trovare nelle culture galleggiante. I pannelli sono rappresentative immagini microscopio a contrasto di fase di sfere dai giorni 0 (A), 4 (B), 7 (C) e 10 (D). Barra di scala = 50 micron.

<ol><li>Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oral+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).</li>
<li>Nape&ntilde, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+xerostomia+%28dry+mouth%29%5BTitle%5D)+AND+%22Odontology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth).</a> Odontology. 97, 76-83 (2009).</li>
<li>Denny, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenchymal+cell+proliferation+and+mechanisms+for+maintenance+of+granular+duct+and+acinar+cell+populations+in+adult+male+mouse+submandibular+gland%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland.</a> 235, 475-485 (2005).</li>
<li>Man, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+a+perinatal+cellular+phenotype+in+submandibular+glands+of+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat.</a> J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).</li>
<li>Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+acinar+cells+following+ligation+of+rat+submandibular+gland+retraces+the+embryonic-perinatal+pathway+of+cytodifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation.</a> Differentiation. 79, 120-130 (2010).</li>
<li>Eirew, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+quantifying+normal+human+mammary+epithelial+stem+cells+with+in+vivo+regenerative+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability.</a> Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).</li>
<li>Gorjup, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glandular+tissue+from+human+pancreas+and+salivary+gland+yields+similar+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).</li>
<li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+of+the+skin+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stem cells of the skin epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).</li>
<li>Lombaert, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+salivary+gland+function+after+stem+cell+transplantation+in+irradiated+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands.</a> Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).</li>
<li>Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapy+to+Reduce+Radiation-Induced+Normal+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage.</a> Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di coltura tissutale qui descritto rappresenta un protocollo riproducibile per l&#39;isolamento di cellule staminali contenenti salispheres dalle ghiandole salivari di topi. Gli studi che utilizzano cellule isolate in questo modo hanno evidenziato la capacità rigenerativa delle cellule staminali della ghiandola salivare 9. Il trapianto di un centinaio di c-Kit + cellule derivate dal salispheres indotto il recupero funzionale delle ghiandole salivari di topo irradiati. Questi dati sono entusiasmanti e di fornire un punto di partenza per lo studio della terapia con cellule staminali a base di xerostomia. Molte strade rimangono da esplorare però, compresa la piena profilo di espressione delle proteine ​​marker delle cellule staminali, la capacità delle ghiandole sottomandibolari per salvare la funzione delle ghiandole salivari, parotidi irradiati e viceversa, e la caratterizzazione dei putativi di nicchia delle cellule staminali in vivo di le cellule. In ultima analisi, la traduzione di questo protocollo di campioni di tessuto umano e il potenziale successive per la terapia di xerostomia nei pazienti umani con le cellule isolate è l&#39;applicazione più interessante del metodo descritto.

<table><tbody><tr><td>Ialuronidasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>Conservare a &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Collagenasi II</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17101-015</td><td>Conservare a 4 &amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>Preparare una soluzione madre di 10 &amp;#x03BC;g / mL in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS). Conservare a &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C in aliquote monouso.</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>Preparare una soluzione madre di 25 &amp;#x03BC;g / mL in PBS. Conservare a &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C in aliquote monouso.</td></tr><tr><td>Integratore N2</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Secondo le istruzioni del produttore.</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>Preparare una soluzione madre di 2 mg / mL in acqua di rubinetto. Regolare il pH dell'acqua a 2-3 utilizzando acido acetico glaciale prima di sciogliere il composto.</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Filtri cellulari sterili con pori di 100 &amp;mu;M</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Tubi rotondi in polistirene con cappucci filtranti (dimensione dei pori 50 &amp;mu;M)</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di cellule staminali del mouse ghiandole salivari

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Maturo ghiandole salivari di origine umana e topo comprendono un minimo di cinque tipi di cellule, ognuna delle quali facilita la produzione e l&#39;escrezione di saliva nella cavità orale. Cellule acinari sierose e mucose sono le proteine ​​e mucose fabbriche della ghiandola, rispettivamente, e rappresentano l&#39;origine della produzione di saliva. Una volta sintetizzate, le varie componenti enzimatiche e le altre proteica della saliva sono secreti attraverso una serie di cellule epiteliali duttali cuscinetto tipo morfologia, fino alla eventuale espulsione della saliva attraverso un condotto grande nella cavità della bocca. La composizione della saliva è anche modificata dalle cellule duttali durante questo processo. Nella manifestazione di malattie come la sindrome di Sjögren, e in alcune situazioni cliniche come il trattamento di radioterapia per i tumori testa e collo, produzione di saliva da parte delle ghiandole è drasticamente ridotto 1,2. La xerostomia risultante, una sensazione soggettiva di secchezza delle fauci, colpisce non solo la capacità del paziente di deglutire e parlare, ma incoraggia anche lo sviluppo della carie dentale e può essere socialmente debilitanti per il paziente. Il restauro della produzione di saliva in condizioni cliniche di cui sopra rappresenta dunque un bisogno insoddisfatto clinico, e come tali diversi studi hanno dimostrato la capacità di rigenerazione delle ghiandole salivari 3-5. Ulteriormente l&#39;isolamento di cellule staminali simili a popolazioni di cellule provenienti da tessuti diversi all&#39;interno del mouse e corpi umani 6-8, abbiamo dimostrato con il metodo descritto che le cellule staminali isolate dalle ghiandole salivari del mouse può essere utilizzato per salvare la produzione di saliva in salivari irradiati ghiandole 9,10. Questa scoperta apre la strada per lo sviluppo di cellule staminali a base di terapie per il trattamento di condizioni xerostomic negli esseri umani, e anche per l&#39;esplorazione della ghiandola salivare come un microambiente che contengono cellule multipotenti con capacità auto-rigenerante.

Un protocollo ottimizzato per l&#39;isolamento di cellule staminali dalla ghiandola salivare del mouse è descritto. Il metodo impiega digestione enzimatica e meccanica, e permette l&#39;isolamento di salispheres contenenti cellule con caratteristiche di cellule staminali.

Isolamento di cellule staminali del mouse ghiandole salivari

Le ghiandole salivari mature, sia di origine umana che murina, comprendono un minimo di cinque tipi cellulari, ciascuno dei quali facilita la produzione e l'escrezione di...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'isolamento di cellule staminali putative dalle ghiandole SIV dei neuroni. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo le ghiandole salivari sottomandibolari da topi adulti. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'utilizzare forbici curve per processare il tessuto in una polpa omogenea.Il terzo passaggio della procedura consiste nel digerire ulteriormente il tessuto utilizzando enzimi di collaghenasi e liasi più attivi. È necessario fare attenzione a non digerire eccessivamente il tessuto. Poiché una sospensione cellulare completa non produce un numero elevato di sfere, i cluster di due o tre cellule sono l'opzione ottimale.L'ultimo passaggio della procedura consiste nella filtrazione dell'omogenato attraverso filtri da 100 micron e 50 micron. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la coltura e l'isolamento di cellule staminali della ghiandola SIV mediante l'uso combinato di digestione meccanica ed enzimatica di ghiandole SIV intere. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della xerostomia, nota anche come bocca secca, che può insorgere come conseguenza di un trattamento radioterapico.Le cellule staminali delle ghiandole salivari possono essere utilizzate per trattare la xerostomia in pazienti affetti da tumori della testa e del collo. Prima di iniziare questa procedura, preparare tamponi, topo, coltura della ghiandola salivare, mezzi e soluzioni enzimatiche. Secondo il protocollo scritto allegato, tutti i passaggi di dissezione e di coltura dei tessuti devono essere eseguiti in una cappa sterile per colture cellulari.Dopo aver isolato e dissezionato le ghiandole salivari del topo, pesare il tessuto ghiandolare su una bilancia e registrare il peso. Utilizzare una spatola per trasferire le ghiandole salivari in una piccola capsula di Petri e, con forbici da dissezione curve, tritare le ghiandole in una poltiglia omogenea. Tagliare l'estremit&agrave; di una punta per pipetta P 1000 per creare un'apertura pi&ugrave; larga.Utilizzare questa soluzione per pipettare un millilitro di tampone ogni 80 milligrammi di tessuto nella piastra di Petri e trasferire l'omogenato in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Aggiungere un altro millilitro di tampone ogni 80 milligrammi di tessuto nella piastra di Petri. Per raccogliere eventuali frammenti residui di tessuto, aggiungere questa soluzione alla provetta da centrifuga.Quindi aggiungere rapidamente 250 microlitri di soluzione di cloruro di calcio, 25 microlitri di soluzione di ialuronidasi e 25 microlitri di soluzione enzimatica di collaghenasi per ogni 80 milligrammi di tessuto. Posizionare il tubo contenente il tessuto e la miscela enzimatica in un bagno d'acqua agitato a 37 °C e incubare per 20 minuti.Dopo l'incubazione, rimuovere le provette. Utilizzare una punta P 1000 con la punta rimossa, come in precedenza, per mescolare accuratamente il tessuto e la soluzione enzimatica circa 10 volte. Reintrodurre la provetta nel bagnomaria a 37 gradi Celsius per ulteriori 20 minuti.Dopo il secondo periodo di incubazione, centrifugare il campione a 400 ×g per otto minuti; al termine della centrifugazione, eliminare il sopranatante e risospendere accuratamente il pellet in due millilitri di tampone per ogni 80 milligrammi di tessuto iniziale. Quindi aggiungere ulteriori 250 microlitri di soluzione di cloruro di calcio, 25 microlitri di soluzione di ialuronidasi e 25 microlitri di collaghenasi. Due soluzioni enzimatiche per ogni 80 milligrammi di tessuto.E riportare il tubo nel bagnomaria agitato a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Rimuovere i tessuti dal bagnomaria e ripetere le incubazioni precedenti seguendo l'incubazione. Centrifugare il campione a 400 ×g per otto minuti.Una volta ancora, quindi scartare il soprannatante. Il tessuto è ora pronto per essere lavato in previsione della filtrazione dopo la precedente centrifugazione. Pipettare due millilitri di tampone nel tubo e tritare accuratamente.Sospendere il pellet dopo la risospensione. Centrifugare il campione a 400 ×g per otto minuti. Quindi eliminare il soprannatante con la pipetta.Un millilitro di tampone per 80 milligrammi di tessuto nel tubo, quindi triturare nuovamente. Per risospendere il pellet. Ripetere la centrifugazione.Centrifugare a 400 ×g per otto minuti. Durante la centrifugazione, prepararsi per il passaggio di filtrazione posizionando un filtro con pori di 100 micron su una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Al termine della centrifugazione, scartare il soprannatante e pipettare un millilitro finale di tampone per ogni 80 milligrammi di tessuto nella provetta. Utilizzare una punta P1000 con l'estremità tagliata, pipettando su e giù per assicurare che il pellet venga completamente risospeso.Quindi trasferire l'omogenato nel filtro con pori di 100 micron e lasciarlo filtrare nel tubo da centrifuga da 50 millilitri. È importante non applicare più di tre millilitri di omogenato, poiché il filtro potrebbe ostruirsi. Se si supera questo volume, utilizzare una pipetta P1000 per rimuovere qualsiasi tessuto accumulato sulla faccia inferiore del filtro e trasferire tale tessuto nel tubo da centrifuga da 50 millilitri contenente il filtrato.Utilizzando una siringa da un millilitro dotata di un ago da 26 gauge, aspirare l'omogenato dal tubo centrifuga da 50 millilitri e applicarlo sul cappuccio filtrante con pori da 50 micron posizionato sopra il tubo da cinque millilitri. Lasciare che l'omogenato passi attraverso il filtro. Se la filtrazione è lenta, allentare leggermente il cappuccio filtrante, poiché potrebbe essere troppo stretto.Una chiusura ermetica può impedire la filtrazione quando tutto l'omogenato è passato attraverso il filtro nel tubo. Centrifugare il campione a 400 volte la forza di gravità per otto minuti. Dopo la centrifugazione, le cellule in pellet sono pronte per essere seminate su piastra.Le cellule delle ghiandole salivari vengono sospese in un millilitro di mezzo MSG per ogni 80 milligrammi di tessuto. Contare le cellule seguendo protocolli standard. In questo caso, viene utilizzato un contatore cellulare automatico per determinare il numero di cellule.Calcolare il volume di sospensione cellulare necessario per 0,4 volte 10 alla sesta cellule e, da questo, il numero di pozzetti che possono essere seminati. Aggiungere un millilitro di mezzo MSG per ogni pozzetto in una piastra da coltura a 12 pozzetti. Assicurarsi che la sospensione cellulare sia ben mescolata e aggiungere il volume richiesto di sospensione cellulare per 0,4 volte 10 alla sesta cellule in ciascun pozzetto.Trasferire le piastre in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Dopo due giorni di incubazione, esaminare le colture per verificare la presenza di sfere SLO e l'assenza di cellule ace. Questo è un esempio di tessuto della ghiandola salivare di topo processato come descritto e visualizzato mediante microscopia a contrasto di fase da zero a 10 giorni di coltura; i piccoli aggregati cellulari sono sfere SLO, che aumentano di dimensione nel corso di questo periodo.Qui è mostrata la colorazione immunoistochimica di una coltura sferoidale rappresentativa di SLOs di tre-cinque giorni per il marcatore delle cellule staminali. Kit proteina C. Come analizzato mediante citometria a flusso, l'espressione del kit sea conferma la presenza di cellule staminali putative nelle colture di SLOs. Sfere di SLOs di tre-cinque giorni possono inoltre differenziarsi formando strutture simili a un seno e a dotti, con una morfologia analoga a quella presenti nella ghiandola salivare nativa.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le ghiandole salivari e le cellule staminali dalle ghiandole salivari di topo.

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