Name: Cristallizzazione delle proteine di membrana lipidica in Mesophases (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Impara la cristallizzazione delle proteine di membrana in fase lipidica cubica per la biologia strutturale. Questo metodo utilizza saggi LCP-FRAP per ottimizzare le condizioni e ottenere cristalli di alta qualità.

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Questo lavoro è stato finanziato in parte dal NIH GM073197 e RR025336.

Un profilo tipico di un esperimento di cristallizzazione meso è mostrato in Fig.1 1,2. Pre-cristallizzazione LCP-FRAP saggi sono opzionali, tuttavia, possono notevolmente accelerare il processo di ricerca di condizioni di cristallizzazione iniziali, soprattutto nel caso delle proteine ​​di membrana difficile 3. 1. La ricostituzione delle proteine ​​in LCP <ol><li> Purificare una proteina di membrana di interesse in una soluzione detergente e concentrare la proteina / detergente complessi di ~ 10 - 20 mg / mL, facendo attenzione a non concentrare troppo il 1,4 detergente. </li><li> Trasferimento ~ 25 mg di lipidi ospitare LCP (tipicamente monoolein) o una miscela dei lipidi in un tubo di 1,5 ml di plastica e incubare a 40 ° C per qualche minuto fino a quando la lipidica si scioglie. </li><li> Collegare un accoppiatore siringa ad un 100 microlitri a tenuta di gas siringa. </li><li> Caricare la siringa con la lipidico fuso con una pipetta del volume regolabile. Registrare il volume del lipidi nella siringa. </li><li> Carico di altri 100 microlitri siringa con la soluzione proteica in un rapporto proteina soluzione-to-lipidico 2 / 3 v / v. </li><li> Collegare i due siringhe insieme attraverso l'accoppiatore siringa. </li><li> Spingere la siringa tuffatori alternativamente per spostare il lipidi e proteine ​​attraverso l'ago interna del giunto, avanti e indietro, fino a quando la mesofase lipidi diventa omogenea. LCP si forma spontaneamente sulla miscelazione meccanica, e la proteina viene ricostituita nel doppio strato lipidico del LCP. Formazione di LCP può essere verificata dalla sua coerenza trasparente e gelatinosa e per l'assenza di birefringency se visto sotto un microscopio dotato di cross-polarizzatori, o, se possibile, utilizzando piccole angolo diffrazione di raggi X 1. </li></ol> 2. LCP-FRAP pre-cristallizzazione saggi LCP-FRAP test sono progettati per misurare le proprietà di diffusione delle proteine ​​di membrana ricostituite in LCP a una varietà di condizioni di screening 3. Il lungo raggio diffusione delle proteine ​​di membrana in LCP è essenziale per la cristallizzazione di successo, tuttavia, la microstruttura di LCP vincola la diffusione delle proteine ​​di grandi dimensioni o aggregati di proteine ​​oligomeriche. Un motivo comune per il fallimento di un esperimento di cristallizzazione meso è una aggregazione proteica veloce che porta ad una perdita di diffusione. E 'stato dimostrato che il comportamento di aggregazione di una proteina dipende dalla costruzione particolare proteina, i lipidi di accoglienza e la composizione della soluzione di screening 3. <ol><li> Etichetta la proteina con un colorante fluorescente (Cy3 o simili) con un rapporto proteine ​​/ colorante di circa 100 / 1, rimuovere il colorante che non ha reagito e concentrare la proteina a ~ 1 mg / mL. Etichetta sia ammine libero o tioli liberi. Quando l'etichettatura ammine libero, l'uso pH tra 7 e 7,5 per etichettare prevalentemente la libera N-terminale. Essere consapevoli del fatto che l'etichettatura aminoacidi possono anche etichetta lipidi co-purificato con la proteina 2,3. </li><li> Ricostituire la proteina etichettato in LCP, come descritto nella sezione 1). </li><li> Istituito piatti test come descritto nella sezione 3) utilizzando LCP-FRAP soluzioni di screening, invece di schermi cristallizzazione 2. </li><li> Incubare le piastre a 20 ° C al buio per almeno 12 ore per raggiungere uno stato di equilibrio. </li><li> Mettere una delle piastre sul LCP-FRAP stazione e concentrarsi sul primo pozzo utilizzando un obiettivo 10x. </li><li> Acquisire 5 immagini a fluorescenza per catturare l'iniziale stato di pre-sbiancato. </li><li> Innescare il laser. La potenza del laser e il numero di impulsi deve essere regolato a candeggina ~ 30 - 70% delle proteine ​​etichettate nel mezzo della macchia sbiancato. </li><li> Immediatamente dopo l'attivazione del laser, iniziare a registrare un rapido post-candeggio sequenza di circa 200 immagini al tasso più veloce possibile. </li><li> Seguite con la registrazione di un lento post-candeggina sequenza di ~ 50 immagini, scegliendo il ritardo tra le immagini di 1-20 s, a seconda della velocità di diffusione della proteina. </li><li> Integrare l'intensità all'interno della macchia di candeggina in tutti i fotogrammi e correggere per il candeggio e fluttuazioni di intensità della luce durante l'acquisizione dividendo l'intensità all'interno della macchia sbiancato con l'intensità media di un punto di riferimento al di fuori della zona di laser sbiancato. </li><li> Normalizzare l'intensità corretta per effettuare la pre-sbiancato intensità uguale a 1 e l'intensità iniziale sbiancato uguale a 0. </li><li> Montare la curva della intensità normalizzata in funzione del tempo, F (t), utilizzando la seguente equazione 5: F (t) = M x exp (-2T / t) x (I 0 (2T / t) + I 1 (2T / t)), (Eq.1) dove M è la frazione mobile di molecole che diffondono, T è il tempo di diffusione caratteristica, t è il tempo reale di ogni fotogramma registrato, I 0 e I 1 sono lo 0 ° e 1 ° ordine modificate funzioni di Bessel. </li><li> Calcolare il coefficiente di diffusione, D, come: D = R 2 / 4T, (Eq.2) dove R è il raggio dello spot sbiancato. </li><li> Spostare to il pozzo successivo e ripetere i punti 2,5) - 2.13). </li><li> Confrontare le frazioni cellulari e coefficienti di diffusione ottenuti per le diverse condizioni di screening. Cristallizzazione nuovo design schermi in base ai componenti che hanno facilitato la diffusione delle proteine ​​e le condizioni di esclusione per i quali la diffusione delle proteine ​​non è stata osservata. Se la proteina non ha diffuso in alcuna delle condizioni di screening, cercare di estendere lo spazio di screening o cercare una nuova proteina costrutto. </li></ol> 3. Impostazione Prove di cristallizzazione LCP <ol><li> Ricostituire la proteina in LCP, come descritto nella sezione 1). </li><li> Trasferire il carico di proteine ​​LCP in un 10 microlitri a tenuta di gas siringa collegata ad un erogatore siringa ripetitivo. </li><li> Inserire un ago corto rimovibile (calibro 26, 10 mm di lunghezza) alla siringa 10 L. </li><li> Dispensare 200 boli nL del LCP sulla superficie di quattro pozzi adiacenti che formano un quadrato 2x2. </li><li> Sovrapposizione ciascuno dei boli LCP con 1 ml di soluzione corrispondente schermo cristallizzazione. </li><li> Cap quattro pozzi caricato con un coprioggetto 18 mm di vetro quadrati. Applicare una leggera pressione sul vetrino per sigillare i pozzi. </li><li> Ripetere i passaggi 3.4) -3,6), con la prossima serie di 4 pozzi fino a quando il piatto è pieno. </li><li> Incubare la piastra a temperatura costante, controllando periodicamente per la formazione di cristalli e di crescita. </li></ol> 4. La raccolta Cristalli da LCP <ol><li> Posizionare un piatto con cristalli proteici al microscopio stereo con zoom variabile, dotato di un polarizzatore lineare di rotazione e analizzatore. </li><li> Concentrarsi sul pozzo di interesse utilizzando uno zoom a bassa potenza in modo che il tutto è ben posizionato all'interno del campo visivo. </li><li> Punteggio ottenuto il vetro coprioggetto in quattro colpi facendo un quadrato all'interno dei confini bene con un angolo acuto di una pietra da taglio in ceramica capillare. </li><li> Stampa in tutto il perimetro segnato con una forte forte punto di pinzette per propagare i graffi attraverso lo spessore del vetro coprioggetto. </li><li> Punch due piccoli fori agli angoli opposti della piazza segnato. </li><li> Iniettare pochi microlitri di soluzione precipitante attraverso uno dei fori per ridurre la disidratazione durante le fasi successive. </li><li> Utilizzando una sonda angolata ago appuntito rompere il vetro lungo uno o due lati per liberare il cut-out quadrati. </li><li> Sollevare delicatamente il quadrato di vetro per guardare il bolo fase cubi. Se il bolo è bloccato al coprioggetti, poi capovolgere il quadrato di vetro sopra e posto sul fondo del pozzo. </li><li> Aggiungi un ulteriore pochi microlitri di soluzione precipitante, integrato con un crio-protettore, se necessario, sulla parte superiore del bolo esposti fase cubi nel pozzo. </li><li> Aumentare l'ingrandimento del microscopio e concentrarsi su un cristallo. </li><li> Regolare l'angolo tra il polarizzatore e l'analizzatore per aumentare il contrasto tra il cristallo birifrangente e lo sfondo, mantenendo abbastanza luce per vedere il ciclo di raccolta. </li><li> Selezionare un micromount MiTeGen con un diametro corrispondente al formato di cristallo e poi raccogliere il cristallo direttamente dal LCP scavando in la micromount. </li><li> Flash congelare il micromount con i cristalli raccolti in azoto liquido, e la nave ad una linea di luce di sincrotrone per la fonte di raggi X raccolta di dati 6. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Un progettato umano beta 2 adrenergici G protein-coupled receptor (β 2 AR-T4L) è stato espresso in baculovirus infette SF9 cellule di insetto e purificata in dodecylmaltoside (DDM) / colesterolo emisuccinato (CHS) una soluzione detergente associato a un agonista parziale inversa carazololo 7. La proteina è stato marcato con Cy3 estere NHS e utilizzato in LCP-FRAP pre-cristallizzazione test (Figura 2). Schermi griglia grossolana sulla base di diverse condizioni selezionate dai risultati di LCP-FRAP saggi prodotto iniziale di cristallo come colpi (Figura 3). Ulteriore ottimizzazione delle condizioni precipitanti ceduto cristalli di qualità diffrazione (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Flow-chart di un tipico esperimento di cristallizzazione LCP. Passi nel box grigio non sono descritte nella attuali protocolli. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. LCP-FRAP test con β 2 AR-T4L/carazolol in LCP monoolein base. A) i risultati di un LCP-FRAP test eseguiti in automatico la modalità high-throughput, in cui ogni campione di una piastra a 96 pozzetti è sbiancato in sequenza e il recupero fluorescenza viene misurata dopo una incubazione di 30 min. I recuperi ottenuti fluorescenza, che rappresentano la frazione mobile in ogni campione, sono tracciati per tutti i 96 campioni. Le soluzioni di screening contengono 0,1 M Tris pH 8, 30% v / v PEG 400 in combinazione con 48 diversi sali a due differenti concentrazioni. B) profili di fluorescenza di recupero per alcuni repcondizioni rappresentativi. Curve linea continua rappresenta adatta da Eq. 1.L frazioni mobile e coefficienti di diffusione sono determinati utilizzando equazioni. 1 e 2. Recupero veloce di meno del 10% del campione contenente cloruro di sodio è dovuto al lipidi fluorescente co-purificato con la proteina. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Colpi di cristallo iniziale di β 2 AR-T4L/carazolol ottenuto dalla proiezione griglia grossolana attorno condizioni più promettenti identificati da LCP-FRAP, contenenti Na solfato (pannello A) e Na formiato (pannello B). La proteina è marcato con Cy3 estere NHS e le immagini fluorescenti sono scattate con eccitazione a 543 nm ed emissione a 605 nm. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Cristalli ottimizzata di β 2 AR-T4L/carazolol. Le immagini dei cristalli cresciuti in presenza di solfato di Na (pannelli A e B) e K formiato (pannelli C e D) sono presi in modalità campo chiaro (pannelli A e C) e l'utilizzo di polarizzatori incrociati (pannelli B e D).

<ol><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs%2C+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).</li>
<li>Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LCP-FRAP+assay+for+pre-screening+membrane+proteins+for+in+meso+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cryst.+Growth+Design%22%5BJournal%5D)">LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization.</a> J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).</li>
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<li>Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rastering+strategy+for+screening+and+centering+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+micrometer+size+X-ray+synchrotron+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam.</a> J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).</li>
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<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).</li>
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<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+inexpensive+nanoliter-volume+dispenser+for+highly+viscous+materials+used+in+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization.</a> J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+screens%3A+compatibility+with+the+lipidic+cubic+phase+for+in+meso+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins.</a> Biophys J. 81, 225-242 (2001).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I protocolli di fornire una guida di base visivo per le tappe principali coinvolti nello svolgimento di esperimenti di cristallizzazione meso. Più approfondito i dettagli relativi a questi protocolli, sottolineando possibili insidie, carenze o percorsi alternativi sono disponibili altrove 1,2. Opzionale LCP-FRAP test può aiutare nelle fasi precedenti per selezionare il costrutto proteina più promettenti, lipidi ospitare LCP e additivi lipidico, così come limitare la gamma di possibili fattori precipitanti e le condizioni di buffer 3. Una volta che un colpo di cristallizzazione iniziale si trova, dovrebbe essere ottimizzato per ottenere cristalli di migliore qualità. Ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione in meso è essenzialmente simile a ottimizzare le condizioni per le proteine ​​solubili con l&#39;aggiunta di parametri aggiuntivi associati con la composizione del LCP 1. Cristalli di proteina di membrana coltivate in mesofase lipidico sono generalmente di dimensioni inferiori rispetto cristalli ottenuti in soluzione detergente, ma più ordinato, quindi, beneficiando fortemente usare i microfocus linee di luce disponibile al moderne sorgenti di sincrotrone 6. Molte delle procedure relative alla cristallizzazione in meso, compresa la creazione di piatti cristallizzazione o saggio, conducendo LCP-FRAP test e rilevazione cristalli, sono state parzialmente o completamente automatizzati 1,2,8,9, che consente lo screening di una vasta gamma di condizioni consumando piccole quantità di proteine ​​e lipidi. D&#39;altra parte, ricostruzioni proteina in LCP e la raccolta di cristallo rimangono le operazioni manuali e più noioso e, quindi, hanno bisogno di miglioramento.

<table><tbody><tr><td>100 &amp;mu;L siringa ermetica per gas</td><td>Hamilton Co</td><td>7656-01</td><td>Sono necessarie 2 siringhe</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L siringa ermetica per gas</td><td>Hamilton Co</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>Copriginetto per siringa</td><td>Hamilton Co</td><td>7770-02 30902</td><td>Il copriginetto può essere realizzato utilizzando componenti disponibili, come descritto nelle referenze 10</td></tr><tr><td>Dispenser ripetitivo per siringa</td><td>Hamilton Co</td><td>83700</td><td>Il dispenser ripetitivo per siringa può essere modificato per ridurre il volume erogato di circa 3 volte&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Ago rimovibile corto (0,375&amp;#8221;) con punta piatta (stile punta 3, calibro 26)</td><td>Hamilton Co</td><td>7804-03</td><td></td></tr><tr><td>Piastra in vetro a sandwich da 96 pozzetti</td><td>Marienfeld</td><td>08 900 03</td><td>Per operazioni manuali, è più comodo assemblare la piastra in vetro a sandwich utilizzando vetrini da microscopio standard e un nastro adesivo doppio con fori punzonati&lt;sup&gt;1,2,12&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Coprioggetto in vetro</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63787-01</td><td></td></tr><tr><td>monooleina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7765</td><td></td></tr><tr><td>Schermate per cristallizzazione</td><td>Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience</td><td></td><td>La maggior parte delle schermate commerciali disponibili può essere utilizzata per lo screening iniziale. Le condizioni che disturbano costantemente il LCP possono essere diluite 2 volte per una migliore compatibilità&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Pietra per taglio capillari</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-334</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette a punta fine</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>510</td><td></td></tr><tr><td>Provetta affilata angolata</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13650</td><td></td></tr><tr><td>MicroMounts</td><td>MiTeGen</td><td>M1-Lxx-xx</td><td>Scegliere il diametro del MicroMount in base alle dimensioni del cristallo</td></tr></tbody></table>

cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in mesophases

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Proteine ​​di membrana svolgono funzioni fondamentali nelle cellule viventi relativi alla trasduzione del segnale, il trasporto e trasformazioni di energia, e, come tali, sono coinvolti in una moltitudine di disfunzioni e malattie. Tuttavia, una comprensione strutturale e funzionale delle proteine ​​di membrana è fortemente arretrato rispetto a quello dei loro partner solubile, soprattutto, a causa delle difficoltà legate alla loro solubilizzazione e la generazione di cristalli di qualità diffrazione. Cristallizzazione in mesophases lipidico (noto anche come cristallizzazione meso o LCP) è una tecnica promettente che è stato applicato con successo per ottenere strutture ad alta risoluzione di rhodopsins microbica, proteine ​​fotosintetiche, botti beta della membrana esterna e G recettori accoppiati alla proteina. In meso cristallizzazione si avvale di un nativo ambiente simile a membrana e produce tipicamente cristalli con basso contenuto di solventi e meglio ordinare rispetto ai tradizionali cristallizzazione da soluzioni detergenti. Il metodo non è difficile, ma richiede una comprensione del comportamento dei lipidi fase e pratiche nel trattamento dei materiali mesofase viscosi. Qui mostriamo un modo semplice ed efficiente di fare LCP e la ricostituzione di una proteina di membrana nel doppio strato lipidico di LCP utilizzando un mixer siringa, seguita dalla distribuzione di porzioni nanoliter LCP in un saggio o un piatto di cristallizzazione, conducendo i test pre-cristallizzazione e la raccolta di cristalli l&#39;LCP matrice. Questi protocolli di fornire una guida di base per accostarsi a prove di cristallizzazione meso, tuttavia, come per qualsiasi esperimento di cristallizzazione, lo screening esteso e ottimizzazione sono necessarie, e un risultato positivo non è necessariamente garantita.

I protocolli di descrivere le fasi essenziali per ottenere cristalli di diffrazione qualità di una proteina di membrana a partire dalla ricostituzione della proteina in una fase lipidica cubi (LCP), trovando condizioni iniziali con LCP-FRAP pre-cristallizzazione analisi, la creazione di processi di cristallizzazione LCP e cristalli di raccolta .

Cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in Mesophases

Le proteine di membrana svolgono funzioni critiche nelle cellule viventi relative alla trasduzione del segnale, al trasporto e alle trasformazioni energetiche e, come tali, sono...

L'obiettivo generale della seguente procedura è ottenere cristalli di alta qualità di una proteina di membrana per la determinazione strutturale mediante cristallografia a raggi X. Questo risultato si ottiene ricostituendo la proteina nella membrana di una fase cubica lipidica e incubandola con una soluzione precipitante, che induce la nucleazione e la crescita dei cristalli grazie all'ampio spazio di cristallizzazione e al limitato riscontro sperimentale derivante dai test di cristallizzazione. Il saggio di recupero della fluorescenza della fase cubica lipidica dopo fotobleaching o LCP Frap Prec è stato sviluppato per selezionare le condizioni di cristallizzazione più promettenti.Questo saggio riduce la quantità di screening e aumenta le probabilità di ottenere i primi risultati di cristallizzazione. Una volta individuati i primi risultati, vengono impostati esperimenti di ottimizzazione per migliorare la crescita dei cristalli. Infine, i cristalli ottimizzati vengono raccolti e congelati in azoto liquido per la raccolta dei dati presso una sorgente di sincrotrone.I risultati mostrano l'efficace utilizzo del saggio LCP FRA per ottenere cristalli iniziali del recettore beta-2 adrenergico in LCP, la cui ulteriore ottimizzazione ha portato a cristalli di qualità adatta alla diffrazione. Questa tecnica sfrutta un ambiente membranoso simile a quello nativo fornito dalla fase cubica ripetuta e produce tipicamente cristalli con contenuto di soluzione ridotto e un migliore ordine rispetto alla cristallizzazione in soluzioni detergenti. In generale, le persone nuove a questo metodo incontrano difficoltà a causa dell'elevata viscosità e delle proprietà reologiche della fase lipidica, che rendono questi materiali difficili da manipolare.Tuttavia, quando si utilizzano gli strumenti appropriati e si padroneggia la tecnica, questa procedura non è più difficile di qualsiasi altra tecnica di cristallizzazione proteica ed è adatta all'automazione e all'elaborazione ad alto rendimento. Cominciamo dunque. Purificare la proteina di membrana di interesse in una soluzione di detergente e concentrare i complessi proteina-detergente a circa 10-20 milligrammi per millilitro.Trasferire circa 25 milligrammi di un lipide ospite LCP A o di una miscela lipidica in un tubo di plastica e incubare a 40 gradi Celsius per alcuni minuti fino a quando il lipide non si sarà fuso. Successivamente, fissare un connettore per siringa a una siringa gastight da 100 microlitri. Caricare la siringa con il lipide fuso utilizzando una pipetta a volume regolabile.Registrare il volume del lipide nella siringa e caricare un'altra siringa da 100 microlitri con una quantità sufficiente di soluzione proteica da ottenere un rapporto tra soluzione proteica e lipide di due a tre in volume su volume. Collegare entrambe le siringhe tramite il connettore per siringhe. Spingere alternativamente gli stantuffi delle siringhe per far passare il lipide e la proteina attraverso l'ago interno del connettore avanti e indietro finché la fase mesomorfica lipidica non diventa omogenea.LCP si forma spontaneamente mediante miscelazione meccanica e la proteina viene reincorporata nel doppio strato lipidico di LCP. La formazione di LCP può essere verificata dall'aspetto trasparente e gelatinoso e dall'assenza di birifrangenza quando viene osservato al microscopio dotato di polarizzatori incrociati oppure, se possibile, mediante diffrazione a raggi X a piccolo angolo. Per iniziare i saggi di frap su LCP, etichettare la proteina con un colorante fluorescente in un rapporto proteina/colorante di circa 100 a 1 come descritto nel protocollo scritto.Rimuovere il colorante non reattivo e concentrare la proteina a circa un milligrammo per millilitro. Successivamente, ricostituire la proteina marcata in LCP nello stesso modo utilizzato per la proteina non marcata. Preparare le piastre per il saggio.Utilizzo di soluzioni di screening LCP wrap. Trasferire innanzitutto l'LCP contenente la proteina in una siringa ermetica da 10 microlitri collegata a un dispenser per siringhe ripetitive, quindi applicare un ago corto rimovibile alla siringa da 10 microlitri. Dispensare boli di 200 nanolitri di LCP sulla superficie di quattro pozzetti adiacenti, formando una sovrapposizione quadrata due per due; aggiungere a ciascun bolo di LCP un microlitro della corrispondente soluzione di screening LCP FRA.Dopo aver dispensato la soluzione di screening, sigillare le quattro pozzette caricate con un coprivetro quadrato da 18 millimetri. Applicare una leggera pressione sul coprivetro per sigillare le pozzette. Ripetere questa procedura per il successivo gruppo di quattro pozzette fino a quando l'intera piastra sarà riempita.Dopo averlo riempito, coprire la piastra con della pellicola. Incubare le piastre a 20 gradi Celsius per almeno 12 ore. Per raggiungere uno stato di equilibrio, posizionare una delle piastre sulla stazione LCP Frap e mettere a fuoco il primo pozzetto utilizzando un obiettivo da 10 volte.L'acquisizione dei dati FRAP viene eseguita automaticamente utilizzando uno script Image Pro in cui l'utente inserisce innanzitutto tutti i parametri di acquisizione e successivamente preme il pulsante di avvio. Una sequenza tipica di acquisizione inizia registrando cinque immagini pre-bleach, quindi attiva il laser di bleaching sincronizzato con l'acquisizione in streaming di una sequenza rapida di recupero di circa 200 immagini alla velocità massima possibile, seguita dall'acquisizione di una sequenza lenta di recupero di 50 immagini con intervalli da uno a 20 secondi tra un'immagine e l'altra, a seconda della velocità di diffusione della proteina. Al termine della raccolta dati, integrare l'intensità all'interno della zona di bleaching e in punti di riferimento posizionati al di fuori dell'area trattata dal laser di bleaching in tutti i fotogrammi corretti.La curva dell'intensità integrata per le deviazioni causate dalle fluttuazioni della luce e dal fotoblesciamento durante l'acquisizione dei dati normalizza l'intensità corretta in modo che l'intensità pre-bleaching sia pari a uno e l'intensità iniziale post-bleaching sia pari a zero; si adatta quindi la curva dell'intensità normalizzata in funzione del tempo come descritto nel protocollo scritto, al fine di ottenere la frazione mobile e il coefficiente di diffusione. Ripetere questa procedura per il successivo punto, confrontare le frazioni mobili e i coefficienti di diffusione ottenuti per le diverse condizioni di screening. Progettare schermate di cristallizzazione nuove basate sui componenti che hanno facilitato la diffusione della proteina ed escludendo le condizioni per cui non è stata osservata diffusione proteica, al fine di impostare prove di cristallizzazione in LCP.Ricostituire la proteina in LCP come in precedenza, quindi preparare le piastre per la cristallizzazione come per la frap in LCP, ma utilizzando soluzioni di screening per la cristallizzazione. In alternativa, una volta preparate le piastre per la cristallizzazione, è possibile impostare le prove di cristallizzazione in modo robotizzato, incubarle a temperatura costante e controllare periodicamente la formazione e la crescita dei cristalli. Una volta cresciuti i cristalli proteici, posizionare una piastra contenente i cristalli sotto un microscopio stereoscopico con ingrandimento variabile, dotato di polarizzatore e analizzatore lineari rotanti.Concentrarsi sul pozzetto di interesse utilizzando un ingrandimento a bassa potenza in modo che l'intero pozzetto sia compreso nel campo visivo. Incidere il vetrino coprioggetto con quattro passate, creando un quadrato all'interno dei limiti del pozzetto, usando un angolo appuntito di una pietra abrasiva per tagliare i capillari in ceramica. Premere lungo il perimetro inciso con pinzette dotate di punta robusta e affilata per propagare le incisioni attraverso tutto lo spessore del vetrino.Praticare con un punzone per vetrini due piccoli fori agli angoli opposti del quadrato segnato. Iniettare alcune microlitro di soluzione precipitante attraverso uno dei fori per ridurre la disidratazione durante i passaggi successivi. Utilizzando una sonda a ago affilata e inclinata, rompere il vetro lungo uno o due lati per staccare il quadrato ritagliato.Sollevare con attenzione il quadrato di vetro osservando il bolo in fase cubica. Aggiungere qualche microlitro aggiuntivo di soluzione precipitante, integrata con un crioprotettante se necessario, sulla sommità del bolo in fase cubica esposto nel pozzetto. Aumentare l'ingrandimento del microscopio e mettere a fuoco un cristallo. Regolare l'angolo tra polarizzatore e analizzatore per aumentare il contrasto tra il cristallo frt e lo sfondo, mantenendo sufficiente luce per vedere il loop di raccolta.Quindi rimuovere l'eccesso di lipidi ed estrarre il cristallo direttamente dal LCP prelevandolo con un supporto micro Mighty Gen scelto in modo che il diametro corrisponda alle dimensioni del cristallo. Congelare il supporto micro con il cristallo raccolto in azoto liquido e spedirlo a una linea di fascio di sincrotrone per la raccolta di dati a raggi X. Il recettore beta-2 adrenergico ingegnerizzato è stato marcato con l'estere NHS del S SI tre e utilizzato in saggi di cristallizzazione LCP Frep prec in modalità automatica ad alto rendimento, in cui ogni campione di una piastra a 96 pozzetti viene sbiancato in sequenza e il recupero della fluorescenza viene misurato dopo un'incubazione di 30 minuti. I recuperi di fluorescenza ottenuti, che rappresentano la frazione mobile in ciascun campione, vengono riportati in grafico per tutti e 96 i campioni.Le soluzioni di screening contengono tris 0,1 molare a pH 8, PEG 400 al 30% in volume, combinati con 48 diversi sali a due concentrazioni differenti. Vengono mostrati i profili di recupero della fluorescenza per diverse condizioni rappresentative. Le curve continue rappresentano gli adattamenti dell'intensità normalizzata rispetto al tempo; il rapido recupero inferiore al 10% nel campione contenente cloruro di sodio è dovuto ai lipidi marcati fluorescentemente.Co purificati con la proteina, i primi cristalli ottenuti del recettore beta-2 adrenergico in complesso con olol sono stati ottenuti mediante uno screening su griglia grossolana attorno alle condizioni più promettenti identificate da LCP Frap contenente solfato di sodio e formiato di sodio. Un'ulteriore ottimizzazione delle condizioni del precipitante ha prodotto cristalli di qualità adatta alla diffrazione. Qui, le immagini dei cristalli cresciuti in presenza di solfato di sodio e formiato di potassio sono state acquisite in modalità campo chiaro.Gli stessi cristalli possono essere osservati anche utilizzando polarizzatori incrociati. Una volta acquisita padronanza, la ricostituzione della proteina in fasi cubiche lipidiche può essere completata in 10-15 minuti, e l'allestimento manuale di una piastra di cristallizzazione a 96 pozzetti richiede circa un'ora. Il saggio L three B wrap in modalità alta richiede circa due ore per piastra a 96 pozzetti, mentre il cristallo H richiede approssimativamente da 10 a 20 minuti per pozzetto. Le procedure mostrate in questo video forniscono una guida di base per affrontare prove di cristallizzazione di proteine.Tuttavia, come in ogni esperimento di cristallizzazione, è necessaria una schermatura ampia e un'ottimizzazione approfondita, e un esito positivo non è necessariamente garantito.

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