Name: Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Zellformänderungen in lebenden Drosophila-Embryonen mit konfokaler Zeitraffer-Mikroskopie und GFP-markierten Proteinen visualisieren. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Beobachtungen der Zellularisierung.

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Wir danken Eric Wieschaus, der das Fundament, auf dem dieses Protokoll wurde entwickelt, zur Verfügung gestellt. Unsere Arbeit wird durch eine Verna &amp; Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology Start-up Award, Baylor College of Medicine unterstützt.

1. Montieren Embryo Sammlung Cups <ol><li> Schneiden Sie die unten aus einer 100 ml Tri-Mais Becherglas mit einer Rasierklinge, so dass die Kante so glatt wie möglich. Die Tassen sind einfacher zu handhaben, wenn Sie schneiden auch die drei Ecken von der Spitze, obwohl dies nicht zwingend erforderlich. </li><li> Schneiden Sie ein Quadrat aus Drahtgitter (6 cm x 6 cm). Auf einer vorgewärmten heißen Platte, innerhalb einer Abzugshaube, Schicht des Platzes aus Drahtgitter auf einem Stück von schweren Aluminium-Folie. Schieben Sie den Schnitt unteren Rand der Tasse fest auf den heißen Masche. Warten Sie ein paar Sekunden, und heben Sie die Tasse mit dem Mesh jetzt angebracht. Wenn die Folie auch Stöcke, nur diese abziehen. </li><li> Kühlen Sie die Tasse über Nacht. Entfernen Sie das überschüssige Gewebe mit einer Schere und Sand aus alle scharfen Kanten mit feinkörnigem Sandpapier. </li></ol> 2. Machen Apfelsaft Agar-Platten <ol><li> In einem 6L-Kolben, kombiniert 100 g BD Bacto Agar und 3L destilliertem Wasser. Autoclave der Agar für 30 Minuten auf der langsamen Auspuff-Einstellung. </li><li> In einem 2L Kolben mit einem Rührstab, kombinieren 100 g Saccharose, 1L Apfelsaft, und 6 g p-Hydroxybenzoesäure. Erhitzen Sie die Lösung zum Sieden unter Rühren auf einer heißen Platte. Nicht kochen für mehr als 2 Minuten. Lassen Sie den Apfelsaft Mischung abkühlen, und fügen Sie dann mit Rührstab auf dem Agar. Mix komplett. </li><li> Lassen Sie die kombinierte Lösung in einem 60 ° C Wasserbad vor dem Einfüllen in 60x15 mm Petrischalen cool. Alternativ kann eine Schlauchpumpe verwendet, um den Agar zu verzichten. Lassen Sie die Platten auf Raumtemperatur für mindestens 4 Stunden kühlen. Stack in Rubbermaid Behälter mit einer Schicht aus nassem Papier Handtücher und lagern bei 4 ° C. </li></ol> Notes: <ul><li> Im Herbst oder Winter, kann es notwendig sein, weitere 100 ml Wasser zu dem Agar hinzufügen. </li><li> Die Marke von Petrischalen ist uns wichtig! Nur die BD Falcon Gerichten passen die Tri-Mais Becher. Spezielle Bestellinformationen finden Sie in den Materialien Tabelle im folgenden Abschnitt. </li></ul> 3. Add GFP Flies auf die Embryo-Entnahme-Cups <ol><li> Expand GFP Aktien nach Ihren Bedürfnissen Sammlung durch die Einrichtung von Flaschen fliegt etwa zwei Wochen vor der Bildgebung. Eine Flasche fliegt in der Regel mehr als ausreichend, wenn ein Embryo-Entnahme-Tasse mit einem Minimum von 50 Frauen und 30 Männern zu füllen. Für eine optimale Verlegung sollte Fliegen sein neu eclosed (dh weniger als 5 Tage nach dem Schlüpfen). </li><li> Machen Sie eine Hefe, indem eine kleine Tasse mit etwa gleichen Teilen Red Star aktiven Trockenhefe und destilliertem Wasser einfügen, und rühren, bis die Hefe gelöst ist. Die Paste sollte in etwa die Konsistenz von nassem Erdnussbutter. Mehr Hefe oder Wasser hinzugefügt werden, um die Konsistenz zu verändern. Hefe Paste kann für mehrere Tage verwendet werden und gespeichert werden sollen, abgedeckt, bei 4 ° C. </li><li> Sobald die Hefe paste bereit ist, zu entfernen Apfelsaft Platten von 4 ° C Lagerung. Streak der Apfelsaft-Platten mit der Hefe einfügen und es ihnen ermöglichen, auf 22-25 ° C erwärmen, die einen Anreiz für die Eiablage wird. </li><li> Falten Sie ein Rundschreiben Filterpapier in der Mitte, dann in der Hälfte wieder. Trim auf 8-9 cm Durchmesser, und machen Akkordeon Falten im Viertelkreis. Klappen Sie den Kreis, kehren sie, und fügen Sie ihn in einem Auffangbehälter, bis er das Netz berührt. Stellen Sie sicher, dass das Papier sicher ist in der Tasse, so dass sie nicht fallen und zerschlagen die Fliegen. Das Filterpapier ist optional, aber ein günstiges Umfeld für die Paarung zu schaffen, und hält Feuchtigkeit in die Tasse. </li><li> Beschriften Sie eine Tasse mit Lager Namen und Datum. Übertragen Sie die Fliegen aus der Flasche zu den Auffangbehälter durch leichtes Schütteln der umgedrehten Flasche über den Kelch, und sofort Deckel des Bechers mit einer vorbereiteten Apfelsaft Platte. Befestigen Sie die Platte in die Tasse mit einem Gummiband. Set Tassen Netzseitentaschen bis in einen Bereich mit direktem Licht. Stellen Sie sicher, dass kein Schatten auf die Tasse fallen, da fliegt nicht gut lag im Dunkeln. </li><li> Ändern Sie den Apfelsaft Platte nach Bedarf. Zwei-Stunden-Sammlungen, bei Raumtemperatur gut für bildgebende Zellularisierung. </li></ol> 4. Bereiten Sie eine Montage Kammer <ol><li> So bereiten Sie eine Aufnahmekammer für die Embryonen, schneiden Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband 2-3 cm lang und legen Sie es auf einer Folie, die Ausrichtung der Längsachse des Bandes und Rutsche. Cut eine zweite 2-3 cm langes Stück doppelseitiges Klebeband und Schicht es auf der anderen Stück Klebeband, so dass Sie sicher, dass die Kanten ausgerichtet sind. </li><li> Mit einer Rasierklinge, machen zwei Schnitte von etwa 3 mm Abstand in der Mitte des Bandes und senkrecht zur Längsachse des Schlittens. Entfernen Sie das Klebeband zwischen den Schnitten, um einen Kanal zu machen. Pipet ein Tropfen Halocarbon 27 Öl in den Kanal. Dieser Kanal ist, wo die Embryonen montiert werden. </li></ol> Notes: <ul><li> Nur die ½-Zoll-Scotch doppelseitige Klebeband ist die richtige Dicke, um die Embryonen unterzubringen. </li><li> Halocarbon 27 Öl ist Sauerstoff durchlässig, und so ermöglicht Austausch von Sauerstoff und verhindert gleichzeitig Embryo Austrocknung. Aufgrund dessen Brechungsindex ist Halocarbon 27 Öl auch ideal für die Inszenierungund Imaging-Embryonen. </li></ul> 5. Dechorionate Embryos <ol><li> Zu sammeln und zu dechorionate Embryonen genug pour 50% Bleichmittel auf die Apfelsaft-Agar-Platte voll versenken die gesamte Oberfläche. Mit einem Binokular, wie die Zeiss Entdeckung V8 mit Durchlicht, achten Sie auf die Embryonen aus ihrem Chorion freizugeben. Sobald das Chorion und lockert Versionen von ein paar Embryonen (30-60 Sekunden), pour Bleichmittel und Embryonen in eine Zelle Sieb. </li><li> Wash Embryonen in das Sieb sofort und kräftig mit destilliertem Wasser aus einer Spritzflasche. Dab Sieb auf Küchenpapier. Wenn die rosa ist auf dem Handtuch nach dem Abtupfen gesehen, weiterhin das Waschen der Embryonen mit Wasser. </li><li> Mit einem feuchten Pinsel auf 10-50 Embryonen, um eine saubere Apfelsaft Platte (ohne Hefe-Paste) zu übertragen. Wick entfernt Wasser mit den zerrissenen Rand ein Papiertuch, und sofort decken die Embryonen mit einer kleinen Menge von Halocarbon 27 Öl. </li></ol> Notes: <ul><li> Verwenden Sie keine Clorox Bleiche. Verwenden Sie stattdessen eine Marke wie Austin A-1 Handelsregister Bleach, die &lt;6% Natriumhypochlorit ist. </li><li> Over-Bleaching oder unzureichende Spülung wird in matschig Embryonen mit unregelmäßigen Zellularisierung führen. </li></ul> 6. Bühne und Mount Embryos <ol><li> Mit dem Binokular mit Durchlicht, folgen Sie den morphologischen Richtlinien Bownes 20 bis Embryonen auf der Platte Bühne. Mit einer Pinzette, Transfer ca. 5 Mitosecyclus 11 oder 12 Embryonen, entsprechend Bownes Stufe 4, um den Kanal der Montage Kammer. Vereinbaren Embryonen in einer Linie mit dorsalen und ventralen Seiten sichtbar und lateralen Seite nach unten. Embryonen sind leicht in diese Orientierung in Öl allein angeordnet. Nicht Menge Embryonen zusammen, wie sie ihre Nachbarn von Sauerstoff wird entzogen, wenn das Deckglas unten aufgetragen wird. (Lassen Sie etwa die Hälfte eines Embryos Länge zwischen ihnen). </li><li> Lay einer Kante eines 25x25 mm Deckglas auf dem doppelseitigen Klebeband an einer Seite des Kanals. Drop the Deckglas, um den Kanal zu decken. Wenn Luft unter gefangen ist, eine kleine Menge von Halocarbon 27 Öl am Rande des Deckglases. Kapillarwirkung wird das Öl in den Kanal Pull-und Push out der Luft. </li></ol> Notes: <ul><li> Eine weitere hervorragende Ressource für die Inszenierung Embryonen ist die folgende: Campos-Ortega, JA und Hartenstein, V. (1985). Die Embryonalentwicklung von Drosophila melanogaster. Springer-Verlag, Berlin. Während dieses Buch nicht mehr veröffentlicht wird, werden gebrauchte Exemplare regelmäßig auf Amazon.com. </li><li> Verwenden Sie immer die Halocarbon 27 Öl sparsam. Damit wird die Montage zu erleichtern. Es wird auch ein versehentliches Nässen des Öls auf den Mikroskop-Objektiv in den folgenden Imaging-Schritten. </li></ul> 7. Bild Embryos <ol><li> Wie Sie hier vorgehen wird natürlich von der Zelle Form zu ändern, dass Sie Bildgebung sind, und die Frage, die Sie ansprechen diktiert werden. Für jede Form zu ändern, platzieren Sie Ihre Montage Kammer entweder auf eine aufrechte oder inverse Mikroskop finden Sie Ihre Embryonen im Durchlicht, und wechseln Sie dann zu konfokale Bildgebung auf eine Region von Interesse sind. Halten Sie sich an Best Practices für die konfokale Mikroskopie, wie die im Nikon MicroscopyU (diskutiert <a href="http://www.microscopyu.com/articles/confocal">http://www.microscopyu.com/articles/confocal</a> ). Seien Sie besonders strengen in die Offenlegung Ihrer lebenden Embryonen, so wenig Laserleistung wie möglich Bleichen und Phototoxizität zu verhindern. </li><li> Für Zellularisierung mit uns Bild auf einem Zeiss 710 Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop, ein C-Apochromat 40x/1.2 W Corr Ziel. Dieses Mikroskop wird in einem klimatisierten Raum untergebracht, mit Temperaturen von 18-20 ° C. Während Temperaturregelung ist nicht unbedingt notwendig, ist es besser für das Mikroskop und macht die Bildgebung mehr konsistent. Wir führen regelmäßig Bild in einer Ebene, in der Nähe der Mitte des Embryos, zur Plasmamembran Einstülpungen im Querschnitt (Abb. 2) folgen. Für einfach folgenden Invagination Dynamik, sind zu 30-60 Sekunden reichen für Zeitraffer-Imaging und Embryonen Bildgebung für&gt; 90 Minuten ohne erkennbare Anzeichen von Sauerstoffmangel zu widerstehen. </li><li> Nach dem Erwerb der Bilder können sie unter Verwendung einer beliebigen Anzahl von Bildanalyse-Pakete, einschließlich Freeware von den National Institutes of Health, genannt ImageJ (werden <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a> ). Die Daten können dann zum Beispiel Filme (Movie 1), Sequenzen (Abbildung 2) oder kymographs 21 vorgestellt werden. </li></ol> Hinweis: <ul><li> Das Eintauchen in Wasser C-Apochromat 40x/1.2 W Corr Ziel ist es, für die Bildgebung in der Nähe des Embryo mittleren Abschnitt durch seine hohe Blende, die Aberrationen Grenzwerte für Deep Tissue Imaging in wässrigen Proben gut geeignet und bietet eine hohe Auflösung und hohe Fluoreszenz-Signal. Darüber hinaus dieses Zielhat eine sehr lange Distanz (220 um). Allerdings werden auch andere Wasser oder Glycerin Immersionsobjektive gute Leistung, vor allem, wenn die Zelle Formveränderung von Interesse in der Nähe des Embryo Oberfläche abgebildet werden kann. </li></ul> 8. Alternative Methode: Mount Embryonen mit "Embryo-Kleber" <ol><li> Um das Bild einer Zelle Form zu ändern außer Zellularisierung, kann es notwendig sein, um Embryonen in einer bestimmten Orientierung, die nicht leicht in Öl gepflegt allein montieren. Dazu verwenden Sie eine alternative Methode zur Montage der zuvor beschriebenen. Beginnen Sie, indem "Embryo-Kleber" durch die Kombination von 20 cm von doppelseitigem Klebeband mit 250 ul Heptan in einem Scintillationsfläschchen. Legen Sie die Scintillationsfläschchen auf einem Kolbenpendel oder rotierenden Plattform, und mischen Sie über Nacht. </li><li> Tauchen Sie ein gelbes Pipettenspitze in den Embryo Kleber, und dann verfolgen die Spitze entlang einer Rutsche, eine Spur von Leim. Während die Heptan verdunstet, richten Sie Ihre inszenierten Embryonen in der vorgeschriebenen Richtung auf einen Block von Agar. (Denken Sie daran, dass der Embryo Oberfläche abgebildet werden sollte nach der Agar. Zum Beispiel, um Bildzelle Formänderung beim Bildung der ventralen Furche, mount Embryonen mit ihrem ventralen Seite nach der Agar.) </li><li> Drehen Sie die Folie mit Klebstoff und drücken Sie vorsichtig den Spuren von Klebstoff gegen die Embryonen auf die Agar-Block. Jetzt kehren die Folie wieder. Die Embryonen werden in die entsprechende Ausrichtung aufgeklebt werden. Fügen Sie zwei Schichten von doppelseitigem Klebeband auf beiden Seiten des Embryos, decken Sie sie mit Halocarbon 27 Öl und Deckglas auflegen. Fahren Sie mit der Bildgebung wie oben beschrieben. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse: Wenn die Embryonen gesund sind und die Abbildung optimal ist, dann Zellularisierung sollte 50-60 Minuten, und der Plasmamembran Einstülpungen sollte das Eindringen von fast 40 Mikron. Allerdings, wenn die Embryonen over-gebleicht, Sauerstoff entzogen oder durch Phototoxizität beschädigt sind, dann Einstülpung entweder verlangsamen oder stoppen, vor allem in der abgebildeten Fläche. Solche Verschlechterung der Embryo Gesundheit führt oft veränderte Entwicklung, und ein Ausfall als Larven schlüpfen. Somit ist für einen rigorosen Test Test Embryo Gesundheit nach der Bebilderung, halten Sie Ihre Folien in einer feuchten Kammer und sehen für das Ausbrüten des nächsten Tages. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Workflow von Embryo-Entnahme zur Bildgebung. Der Workflow des Protokolls lässt sich in vier Hauptphasen unterteilt werden. In der ersten Phase werden alle einzelnen Lieferungen und Komponenten hergestellt, und dann die Embryo-Entnahme-cup, Apfelsaft-Agar-Platte und GFP Fliegen sind zusammen, um den Embryo-Verlegung zu schaffen setzen. In der zweiten Phase werden die Eier und Embryonen, die auf der Apfelsaft-Agar-Platten gelegt werden gesammelt. In der dritten Phase, die Embryonen von der Platte entfernt werden, inszeniert und an die Montage Kammer. In der vierten Phase werden die montierten Embryonen auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Repräsentative Daten aus Zeitraffer-Bildgebung von Zellularisierung. Embryonen werden mit dorsaler (D) und ventralen (V) Seiten gut sichtbar angebracht und sind in der Nähe ihrer Mitte abgebildet an die Plasmamembran Einstülpungen im Querschnitt zu folgen. Der Embryo hier gezeigten drückt eine GFP-Myosin-2-Sonde 6, die an den Spitzen der Plasmamembran Einstülpungen konzentriert. So verfolgen das Eindringen von dieser Front im Laufe der Zeit gibt die Rate, mit der Plasmamembran stülpt. Die 0.00 Minuten-Zeitpunkt entspricht Zellularisierung Beginn. Kurz nach der 56:00 Minuten-Zeitpunkt, beginnt der Gastrulation auf der Bauchseite des Embryos. Bar ist 40 Mikron. Movie 1. Vertreter Film von Zeitraffer-Bildgebung von Zellularisierung. Dieser Film entspricht 2 Abbildung. So nehmen Sie den gesamten Prozess der Zellularisierung begann Bildgebung in der vorherigen Mitosecyclus 13, Erfassung pseudocleavage Furche Regression, und dauerte bis Gastrulationsbewegungen auf der Bauchseite des Embryos zu sehen waren. Die Bilder wurden in Intervallen von einer Minute gesammelt. Die Intensitäten wurden nach der Akquisition erhöht, um es einfacher, die Gastrulationsbewegungen sehen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2503/Movie%201.mov">Klicken Sie hier für Film</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Developmental Event-und Timing * </td><td> Zellform Änderungen im Zusammenhang mit </td><td> Ein Link zu Krankheit oder die menschliche Gesundheit </td><td> Aktuelle Referenzen mit Live-Bildgebung </td></tr><tr><td> Pseudo-Teilungsfurche Bildung (4; 90 Minuten pf) </td><td> Cytokinesis </td><td> Polyploidie und Krebs Reihe 1 </td><td> Mavrakis et al., 2009 8 Cao et al., 2010 9 </td></tr><tr><td> Zellularisierung (5; 130 Minuten pf) </td><td> Cytokinesis </td><td> Polyploidie und Krebs Reihe 1 </td><td> Cao et al., 2008 10 Sokac &amp; Wieschaus, 2008 11 </td></tr><tr><td> Bildung der ventralen Furche; Mesoderm Invagination (6; 180 Minuten pf) </td><td> Apikalen Konstriktion, Epithelial-mesenchymale Transition </td><td> Krebs Metastasen 2 </td><td> Fox &amp; Peifer, 2007 12 Martin et al., 2009 13 </td></tr><tr><td> Germband Erweiterung (7; 195 Minuten pf) </td><td> Konvergente Extension </td><td> Neuralrohrdefekte 3 </td><td> Bertet et al., 2004 14 Blankenship et al., 2006 15 </td></tr><tr><td> Tracheogenesis (11; 320 Minuten pf) </td><td> Epitheliale tube formation und Verzweigung </td><td> Angiogenese 4 </td><td> Caussinus et al., 2008 16 Gervais &amp; Casanova, 2010 17 </td></tr><tr><td> Dorsal Schließung (14; 620 Minuten pf) </td><td> Apikalen Konstriktion </td><td> Die Wundheilung 5 </td><td> Gorfinkiel et al., 2009 18 Solon et al., 2009 19 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Beispiele Zellform Veränderungen in lebenden Embryonen zu fliegen abgebildet * Die Bownes Bühne Zahl und Zeit nach der Befruchtung (pf), wenn jedes Ereignis beginnt, werden nach Campos-Ortega, 1985 aufgeführt. <table border="1"><tbody><tr><td> Fly Lager </td><td> Labels </td><td> Original-Referenz </td></tr><tr><td> Spider-GFP (95-1) </td><td> Plasma-Membran </td><td> Morin et al., 2001 22 </td></tr><tr><td> Resille-GFP (117-2) </td><td> Plasma-Membran </td><td> Morin et al., 2001 22 </td></tr><tr><td> GAP43-Venus </td><td> Plasma-Membran </td><td> Mavrakis et al., 2009 8 </td></tr><tr><td> Spaghetti Squash-GFP (SQH-GFP) </td><td> Myosin-2 </td><td> Royou et al., 2002 6 </td></tr><tr><td> E-Cadherin-GFP (ECAD-GFP) </td><td> Zell-Zell-Verbindungen </td><td> Oda et al., 2001 23 </td></tr><tr><td> GFP-Moesin </td><td> F-Aktin </td><td> Kiehart et al., 2000 24 </td></tr><tr><td> Utrophin-Venus (Utro-Venus) </td><td> F-Aktin </td><td> Sokac et al., Unveröffentlichte Ergebnisse </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Nützliche Aktien für die Bildgebung Zellform Änderung fliegen Embryonen

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<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotically+controlled+F-actin+establishes+cortical+compartments+to+stabilize+furrows+during+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization.</a> J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).</li>
<li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).</li>
<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
</ol>

Das Protokoll beschriebenen wird die Live-, konfokale Bildgebung von einer Reihe von Zellform Veränderungen in den Entwicklungsländern zu fliegen Embryo zu ermöglichen. GFP Aktien für die Bildgebung kann durch einen individuellen Labor (Tabelle 2) hergestellt werden, aber viele dieser Bestände sind auch öffentlich verfügbar von Zentren wie Bloomington Drosophila Stock Center an der Indiana University ( <a href="http://flystocks.bio.indiana.edu">http://flystocks.bio.indiana.edu</a> ) und Fliegenfalle Stock Cente...

<table><tbody><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 25x25</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 2-524C</td><td></td></tr><tr><td>Sprühflaschen (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-897-11</td><td></td></tr><tr><td>Falcon-Röhrchen, 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Glaskolben für kleine Pipetten, 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>Zählfläschchen mit Verschlusskappen</td><td>VWR international</td><td>66021-533</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Corn-Becher, 100 ml</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>60970</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Petrischale 60x15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08757 100B</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Zellfilter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Gelbe Pipettenspitzen</td><td>Rainin</td><td>L200</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahlgewebe, Typ 304, 12x24</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150-F-01</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Pasteurpipetten, 5&amp;#190; Zoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>P4-Filterpapier</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-803-6F</td><td></td></tr><tr><td>Gummibänder</td><td>Office Max</td><td>A620645</td><td></td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband (Scotch), &amp;frac12; Zoll</td><td>Office Max</td><td>A8137DM-2</td><td></td></tr><tr><td>Robert Simmons Expression Pinsel E85 rund Nr. 2</td><td>Jerry&amp;rsquo;s Artarama</td><td>56460</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Nr. 5 Pinzette, hochpräzise, Inox</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon-Öl 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H 8773</td><td></td></tr><tr><td>Heptan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto-Agar</td><td>VWR international</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>p-Hydroxybenzoesäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Red Star Trockenhefe, aktiv</td><td>LeSaffre</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>Papiertücher, C-förmig gefaltet</td><td>Kleenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schweres Aluminiumfolie</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorbleiche</td><td>Austin&amp;rsquo;s A-1 Commercial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 % Apfelsaft</td><td>Ocean Spray oder Tree Top</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging zellgröße veränderung der lebens- drosophila embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Die Entwicklung von Drosophila melanogaster Embryo durchläuft eine Reihe von Zellform Veränderungen, die sehr gut für konfokale Bildgebung leben. Zellform Veränderungen in-the-fly sind analog zu denen in höheren Organismen, und sie fahren Gewebemorphogenese. Also, in vielen Fällen hat ihre Studie direkte Implikationen für das Verständnis menschlicher Erkrankungen (Tabelle 1) 1-5. Auf der sub-zellulärer Ebene sind diese Zellform Veränderungen das Produkt der Aktivitäten reicht von der Genexpression bis Signaltransduktion, Zellpolarität, Zytoskelett-Umbau-und Membran-Handel. Somit stellt die Drosophila-Embryo nicht nur den Kontext zu Zellform Veränderungen zu bewerten, da sie Gewebemorphogenese beziehen, sondern bietet auch eine völlig physiologischen Umgebung, die sub-zellulären Aktivitäten, die Form-Zellen zu studieren. Die hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um Bild einer bestimmten Zelle Formveränderung genannt Zellularisierung. Zellularisierung ist ein Prozess der dramatischen Plasmamembran Wachstum, und es letztendlich wandelt die Syncytial Embryo in die zelluläre Blastoderm. Das heißt, bei der Interphase der Mitose-Zyklus 14, der Plasmamembran gleichzeitig stülpt sich um jede ~ 6000 kortikal verankert Kerne auf ein Blatt von primären Epithelzellen zu generieren. Zähler zur vorherigen Vorschläge, ist Zellularisierung nicht von Myosin-2 Kontraktilität 6 angetrieben, sondern wird weitgehend durch Exozytose von Membran aus internen Shops 7 angeheizt. So ist Zellularisierung ein hervorragendes System zur Untersuchung von Membran-Handel während der Zellform Veränderungen, die Plasmamembran Invagination oder Erweiterung erfordern, wie Zytokinese oder Quer-Tubuli (T-Tubulus) Morphogenese in der Muskulatur. Beachten Sie, dass dieses Protokoll einfach auf die Abbildung von anderen Zellform Veränderungen in-the-fly Embryo angelegt und erfordert nur geringe Anpassungen wie die Änderung der Phase der Embryo-Entnahme oder Verwendung von &quot;Embryo Kleber&quot;, um den Embryo in einer bestimmten Orientierung (Tabelle montieren 1) 8-19. In allen Fällen wird der Workflow im Grunde die gleichen (Abbildung 1). Standard-Verfahren für das Klonen und Drosophila Transgenese werden verwendet, um stabile fliegen Aktien, die ein Protein von Interesse exprimieren, fusioniert mit Green Fluorescent Protein (GFP) oder dessen Varianten vorzubereiten und diese Fliegen bieten eine erneuerbare Quelle von Embryonen. Alternativ sind auch fluoreszierende Proteine ​​/ Sonden direkt in fly Embryonen über einfache Mikro-Injektion Techniken 9-10 eingeführt. Dann, je nach Entwicklungs-Event-und Zell-Form zu ändern, die abgebildet werden, sind Embryonen gesammelt und inszeniert von Morphologie auf einem Binokular und schließlich positioniert und montiert für Zeitraffer-Bildgebung an einem konfokalen Mikroskop.

Frühe Entwicklung der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, wird durch eine Reihe von Zell-Form verändert, dass auch für die Bildgebung Ansätze geeignet sind, geprägt. Dieser Artikel beschreibt grundlegende Werkzeuge und Methoden für die Live-konfokale Abbildung von Drosophila Embryonen erforderlich ist, und wird auf eine Zelle Formveränderung genannt Zellularisierung konzentrieren.

Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

Der sich entwickelnde Embryo von Drosophila melanogaster durchläuft eine Reihe von Veränderungen der Zellform, die sich hervorragend für die konfokale Live-Imaging-Mikroskopie eignen. Die Zellform ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Formveränderungen von Zellen in lebenden Drosophila-Embryonen abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst transgene Fliegenstämme erzeugt und vermehrt werden, die GFP-markierte Proteinsonden exprimieren. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, diese Fliegen in Sammelbecher für Embryonen zu überführen.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Embryonen zu sammeln. Der vierte Schritt ist das Beschichten und Montieren des Embryos. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zelluläre Formveränderungen wie zelluläre Veränderungen mittels zeitraffender konfokaler Bildgebung der montierten Embryonen zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Bildgebung von fixiertem Gewebe, liegt darin, dass die dynamischen Aspekte von Zellformveränderungen im Kontext lebender Embryonen erfasst werden können. Obwohl die hier beschriebene Methode speziell auf die Speiseröhrenbildung zugeschnitten ist, kann sie angepasst und auf andere Zellformveränderungen übertragen werden, die die frühe Flugentwicklung begleiten, wie beispielsweise die Bildung der ventralen Furche, die Ausdehnung des Kei

imaging-cell-shape-change-in-living-drosophila-embryos

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Hier präsentieren wir eine Montage-Protokoll für...

Upright Imaging von Drosophila Embryos

Hier beschreiben wir eine effektive Methode zur Untersuchung der Dynamik apoptotischen...

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

Dieses Papier zeigt die Verwendung eines schnellen konfokalen Mikroskop, um Bildzelle Verhalten direkt durch die Puppenhülle. Nach dem Verlassen der Puppenhülle intakt ist, erlaubt dieses Verfahren die Beobachtung und Messung von dynamischen Zellprozesse im Stadium der Drosophila-Entwicklung, die schwer direkt zu studieren.

Imaging Durch die Puppenhülle von<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Bildgebung des lebenden Neuroepithels des Puppenaugen von Drosophila dar. Diese Methode kompensiert Gewebebewegungen und ungleichmäßige Topologie, verbessert die Visualisierung von Zellgrenzen durch die Verwendung mehrerer GFP-markierter Verbindungsproteine und verwendet ein einfach zu montierendes Bildgebungsgerät.

Live-Bilder aus dem Drosophila Pupal Augen

Hierin beschreiben wir ein Verfahren zur Aufnahme von Live-Bildern der Drosophila-Gastrulation. Dies hat es uns ermöglicht, die apikale Verengung in der frühen Entwicklung besser zu verstehen und die Mechanismen, die zelluläre Bewegungen während der Gewebestrukturmodifikation steuern, weiter zu analysieren.

Bildgebung von Zell-Form-Veränderung und Bewegung der Zellen in Drosophila Gastrulation Mit DE-Cadherin Reporter Transgene Flies

Dieses Protokoll ist für die Bildgebung und Analyse der Dynamik der Zellorientierung und des Gewebewachstums in der Drosophila-Bauchepithelie konzipiert, während die Fruchtfliege einer Metamorphose unterzogen wird. Die hier beschriebene Methodik kann auf die Untersuchung verschiedener Entwicklungsstadien, Gewebe und subzellulärer Strukturen in Drosophila oder anderen Modellorganismen angewendet werden.

Bildgebung und Analyse der Gewebeorientierung und Wachstumsdynamik in der Entwicklung drosophila Epithelia während der Pupal-Stadien

Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie ist das wertvollste Werkzeug in der Entwicklungsbiologie. Ein wichtiges Thema in vergleichenden Studien ist die Varianz der Umgebung. Unser Protokoll beschreibt ein experimentelles Framework für die gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Proben und befasst sich daher proaktiv mit diesem Problem.

Gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Insektenembryonen in probenkammerbasierten Lichtbogenfluoreszenzmikroskopen

Dieses Protokoll beschreibt die maßgeschneiderte antikörperbasierte Fluoreszenzmarkierung und Injektion in frühe Drosophila-Embryonen , um Live-Imaging von Proteinen mit geringer Häufigkeit oder posttranslationalen Modifikationen zu ermöglichen, die mit herkömmlichen GFP/mCherry-Tag-Ansätzen nur schwer zu erkennen sind.

Visualisierung von Proteinen mit geringer Häufigkeit und posttranslationalen Modifikationen in lebenden Drosophila-Embryonen mittels Fluoreszenz-Antikörper-Injektion

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um Live-Bildgebung der asymmetrischen Teilung von Keimbahnstammzellen (GSCs) in der ovariellen Nische von Drosophila durchzuführen. Wir verwenden eine transgene Linie, die ubiquitär eine grün fluoreszierende Protein (GFP)-Fusion des Spektrosomproteins Par-1 exprimiert.

Erweiterte Live-Bildgebung von weiblichen Drosophila melanogaster Keimbahn-Stammzellnischen

Erfahren Sie, wie Sie Zellformänderungen in lebenden Drosophila-Embryonen mit konfokaler Zeitraffer-Mikroskopie und GFP-markierten Proteinen visualisieren. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Beobachtungen der Zellularisierung.

Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

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