Name: Manipolazione meccanica di neuroni di controllo per lo sviluppo assonale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Impara la manipolazione meccanica dei neuroni per studiare lo sviluppo assonale. Questo metodo utilizza aghi di vetro calibrati per misurare le forze nel range dei microdyne durante l'allungamento degli assoni.

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Noi riconosciamo con gratitudine gli importanti contributi del Dr. Robert E. Buxbaum nello sviluppo di questa metodologia.

<ol><li>Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+growth+cone+adhesion+to+culture+surfaces+by+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation.</a> J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).</li>
<li>Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+neurite+outgrowth+from+chick+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons.</a> J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeidemann%2C+SR+%22The+Neuron+in+Tissue+Culture%22">The Neuron in Tissue Culture</a>. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).</li>
<li>Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+is+required+for+growth+cone+function+but+not+neurite+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rac is required for growth cone function but not neurite assembly.</a> J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).</li>
<li>Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+can+specify+axonal+fate+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons.</a> J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+the+mechanical+behaviors+of+the+cytoskeleton+in+living+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts.</a> J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).</li>
<li>Yoneda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Exerted+by+a+Single+Cilium+of+Mytilus-Edulis+.1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1.</a> Journal of Experimental Biology. 37, (1960).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Tension+Produced+by+Nerve-Cells+in+Tissue-Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture.</a> Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Fass, J. N., Odde, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+force-dependent+neurite+elicitation+via+anti-beta1+integrin+antibody-coated+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads.</a> Biophys J. 85, 623-636 (2003).</li>
<li>Yang, S., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Force+Sensors+and+Their+Applications+in+the+Study+of+Cell+Mechanical+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mech%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response.</a> Exp Mech. 49, 135-151 (2009).</li>
<li>Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drag+Force+as+a+Tool+to+Test+the+Active+Mechanical+Response+of+PC12+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites.</a> Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+growth+cones+pull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that growth cones pull.</a> Nature. 340, 159-162 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+behavior+and+production+of+traction+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth cone behavior and production of traction force.</a> J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-dish+incubator+for+live+cell+imaging+with+an+inverted+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope.</a> Biotechniques. 35, 708-708 (2003).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Tecniche da applicare e misurare le forze di cellulari hanno una lunga storia 9. Il nostro metodo è stato originariamente motivato dal lavoro di Dennis Bray, che ha usato gli aghi di vetro simile al nostro a &#39;trainare&#39; i neuroni a velocità costante utilizzando un dispositivo motorizzato idraulico 10. Ci sono molti mezzi alternativi di applicare forze di cellule che comprendono: motori passo-passo 11, perline magnetico da 12, travi microfabbricazione 13 e flu...

<table><tbody><tr><td>Provetta capillare R-6</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3111</td><td>Capillare in vetro R-6, diametro esterno 0,9 mm, diametro interno 0,6 mm, 8&quot;</td></tr><tr><td>BB-CH puller</td><td>Mecanex S.A., Ginevra, Svizzera</td><td>BB-CH puller</td><td>Utilizzare la modalità 4 Alt con CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000</td></tr><tr><td>Filo di Cromel da 0,001&quot;</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCH-001-50</td><td>Filo per termocoppia non rivestito, matassa da 50 piedi, ora chiamato Chromega</td></tr><tr><td>Filo di Costantana da 0,003&quot;</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCI-003-50</td><td>Filo per termocoppia non rivestito, matassa da 50 piedi</td></tr><tr><td>Pinzette fini</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Dumont Inox n. 5</td></tr><tr><td>Supporto universale per microscopio con braccio orientabile</td><td>Nikon Instruments</td><td>76135 o 90430</td><td>Per questo utilizzo vanno bene la maggior parte dei marchi o tipi di supporti con braccio</td></tr><tr><td>Micromanipolatore meccanico</td><td>Narishige International</td><td>M-152</td><td>Micromanipolatore meccanico grossolano a tre assi con azionamento diretto</td></tr><tr><td>Micromanipolatore idraulico</td><td>Narishige International</td><td>MO-203</td><td>Ora disponibile come MMO-203, tipo a tre assi mobili</td></tr><tr><td>Portaago</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520145</td><td>Set da 3 pezzi</td></tr><tr><td>Portastrumento singolo</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520142</td><td></td></tr><tr><td>Portastrumento doppio</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520143</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore meccanico</td><td>Leica Microsystems</td><td>39430001</td><td>Montaggio su asta, 1 porta-probe, modello RH 430001</td></tr><tr><td>Micromanipolatore meccanico a joystick</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520137</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM IRB</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Microscopio invertito</td></tr><tr><td>Tavolo di isolamento Vibraplane</td><td>Kinetic Systems</td><td>serie 1200</td><td>Il nostro modello è il 1201-02-12</td></tr><tr><td>Ringcubatore</td><td>Fatto in casa (vedi riferimento 19)</td><td></td><td>Riferimento 19, richiede il controllore aggiornato elencato di seguito</td></tr><tr><td>Controllore di temperatura programmabile</td><td>Instrumart.com</td><td>Fuji Electric PXR3</td><td>Sostituisce il controllore di temperatura PXV3 ormai fuori produzione</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Microscopio invertito, circa 1980</td></tr><tr><td>Nikon SMZ-10 binoculare per dissezione</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Altri microscopi per dissezione possono essere utilizzati</td></tr></tbody></table>

manipolazione meccanica di neuroni di controllo per lo sviluppo assonale

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Manipolazione delle cellule e l&#39;estensione degli assoni neuronali può essere realizzato con vetro calibrato micro-fibre in grado di misurare ed applicare le forze in campo μdyne 1,2 1-10. Misure di forza sono ottenute attraverso l&#39;osservazione del Hookean flessione degli aghi di vetro, che sono tarati con un metodo diretto ed empirica 3. Requisiti attrezzature e le procedure per la fabbricazione, la calibrazione, il trattamento, e utilizzando gli aghi sulle cellule sono descritti. La forza di regimi di tipi di cellule precedentemente utilizzati e diversi a cui queste tecniche sono state applicate dimostrano la flessibilità della metodologia e sono dati come esempi per la ricerca futura 4-6. I vantaggi tecnici sono il continuo &#39;visualizzazione&#39; delle forze prodotte dalle manipolazioni e la possibilità di intervenire direttamente in una varietà di eventi cellulari. Questi includono la stimolazione diretta e regolazione della crescita assonale e retrazione 7; così come distacco e di misure meccaniche su qualsiasi tipo di cellule in coltura 8.

Misure di applicazione e diretto di forze sui neuroni nel range 2000-1000 Microdyne sono realizzati con la massima precisione utilizzando aghi di vetro calibrato. Questa metodologia può essere utilizzato per controllare e misurare diversi aspetti dello sviluppo assonale, incluso l&#39;avvio assonale, tensione assonale, la velocità di allungamento assonale e vettori di forza.

Manipolazione meccanica di neuroni di controllo per lo sviluppo assonale

Le manipolazioni cellulari e l'estensione degli assoni neuronali possono essere realizzate mediante microfibre di vetro calibrate, in grado di misurare e applicare forze nell'ordine di...

Lo scopo di questo esperimento è allungare un assone misurando con precisione le forze. Questo risultato si ottiene realizzando un ago di riferimento in filo direttamente calibrato; successivamente, vengono preparati gli aghi di riferimento in filo calibrati, intermedi e di lavoro nell'intervallo di forza desiderato. In seguito, i coni di crescita vengono trainati con un ago di lavoro al fine di allungare un assone.L'allungamento assonale risultante viene registrato e le forze sono misurate in base alla flessione dell'ago calibrato. Questo metodo può fornire risposte a domande fondamentali sulla biofisica dell'allungamento assonale. Iniziare la procedura utilizzando un estrattore di microlame regolabile e tubi capillari di vetro per fabbricare aghi con punte affusolate di circa quattro millimetri di lunghezza.Conservare gli aghi in una piastra di Petri da 160 millimetri con coperchio. Successivamente, preparare un ago di calibrazione in filo metallico inserendo un filo di cromel dello spessore di 0,001 pollici all'interno di un ago di vetro privo della punta. Estrarre il filo dalla punta fino a una lunghezza di 26 millimetri e fissarlo in posizione con colla cianoacrilica.Piegare l

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Un unico metodo di ingegneria dei tessuti è stato sviluppato per allungare le fibre nervose in coltura da numerosi ricapitolando allungare la crescita degli assoni, una forma di crescita del sistema nervoso per cui i nervi allungare in concomitanza con la crescita del corpo ingrandimento.

Axon crescita Stretch: Il meccanotrasduzione di crescita neuronale

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

Morfogenesi neuronale e la migrazione sono eventi cruciali alla base un corretto sviluppo del cervello. Qui, descriviamo i metodi per manipolare geneticamente colture di neuroni granulari del cervelletto e del cervelletto in via di sviluppo per la valutazione della morfologia e delle caratteristiche migratorie dei neuroni.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Due fotoni di imaging, accoppiato ad nanodissection laser, sono strumenti utili per studiare processi degenerativi e rigenerativi nel sistema nervoso centrale con risoluzione subcellulare. Questo protocollo viene illustrato come etichetta, immagine e sezionare singole fibre di arrampicata nella corteccia cerebellare in vivo.

Laser nanochirurgia di cerebellari Assoni<em&gt; In Vivo</em

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Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

Questo protocollo descrive l'isolamento dei neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) isolati dai ratti e la coltura dei neuroni DRG su un sistema statico di coltura cellulare pre-allungata per migliorare l'allineamento degli assoni, con successiva co-coltura di cellule di Schwann (SC) per promuovere la mielinizzazione.

Un approccio per migliorare l&#39;allineamento e la mielinizzazione dorsale Root Ganglion neuroni

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Questa procedura descrive come avviare rapidamente, estendere e collegare neuriti organizzati in camere microfluidiche utilizzando perline poli-D-lisina fissate a micropipette che guidano l'allungamento del neurite.

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Impara la manipolazione meccanica dei neuroni per studiare lo sviluppo assonale. Questo metodo utilizza aghi di vetro calibrati per misurare le forze nel range dei microdyne durante l'allungamento degli assoni.

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