Manipolazione meccanica di neuroni di controllo per lo sviluppo assonale
10 aprile 2011
Misure di applicazione e diretto di forze sui neuroni nel range 2000-1000 Microdyne sono realizzati con la massima precisione utilizzando aghi di vetro calibrato. Questa metodologia può essere utilizzato per controllare e misurare diversi aspetti dello sviluppo assonale, incluso l'avvio assonale, tensione assonale, la velocità di allungamento assonale e vettori di forza.
Lo scopo di questo esperimento è allungare un assone misurando con precisione le forze. Questo risultato si ottiene realizzando un ago di riferimento in filo direttamente calibrato; successivamente, vengono preparati gli aghi di riferimento in filo calibrati, intermedi e di lavoro nell'intervallo di forza desiderato. In seguito, i coni di crescita vengono trainati con un ago di lavoro al fine di allungare un assone.
L'allungamento assonale risultante viene registrato e le forze sono misurate in base alla flessione dell'ago calibrato. Questo metodo può fornire risposte a domande fondamentali sulla biofisica dell'allungamento assonale. Iniziare la procedura utilizzando un estrattore di microlame regolabile e tubi capillari di vetro per fabbricare aghi con punte affusolate di circa quattro millimetri di lunghezza.
Conservare gli aghi in una piastra di Petri da 160 millimetri con coperchio. Successivamente, preparare un ago di calibrazione in filo metallico inserendo un filo di cromel dello spessore di 0,001 pollici all'interno di un ago di vetro privo della punta. Estrarre il filo dalla punta fino a una lunghezza di 26 millimetri e fissarlo in posizione con colla cianoacrilica.
Piegare l'ultimo millimetro del filo in un gancio. Successivamente, si realizzano pesetti microscopici a partire da un metro di filo di costantana dello spessore di 0,003 pollici. Per misurare il filo, fissarlo con del nastro adesivo a un metro a nastro.
Per facilitarne il posizionamento più dritto possibile, pesare il filo di un metro e tagliarlo con precisione in pezzi da un centimetro. Piegarne alcuni a forma di vaso.
La calibrazione degli aghi metallici richiede un microscopio stereoscopico dotato di scala verticale graduata e un micromanipolatore. Il microscopio viene inclinato di 90 gradi sul lato. Si utilizza un supporto universale con braccio orientabile, in modo da poter osservare la deflessione verso il basso dell'ago metallico.
Montare l'ago metallico in un portastrumento su un micromanipolatore in modo che sia perpendicolare all'asse ottico del microscopio. Allineare la punta dell'ago metallico con un segno radicale. Appendere il micro pesetto da un centimetro all'uncino e registrare la deflessione.
La costante di flessione del filo di riferimento è uguale alla massa del micro pesetto divisa per la deflessione osservata. Dopo la calibrazione, preparare l'ago per il passaggio successivo tagliando il gancio nel punto intermedio con la lametta, al fine di calibrare gli aghi di vetro intermedi. È necessario un microscopio invertito dotato di micrometro oculare.
Da un lato del palco del microscopio è presente un micromanipolatore meccanico utilizzato per tenere l'ago metallico. Dall'altro lato è posizionato un micromanipolatore idraulico impiegato per muovere l'ago intermedio in vetro. Utilizzando i micromanipolatori, posizionare entrambi gli aghi al centro del campo ottico formando un angolo di 45 gradi, all'interno di una piastra di Petri da 160 millimetri per 30 millimetri contenente acqua, osservando con un obiettivo 10x. Successivamente, eseguire una serie di deflessioni per ciascuna di queste deflessioni.
Si osservi la quantità iniziale deviata e la posizione finale a carico nullo dell'ago di vetro dopo il rilascio. Ciò genera 10 coppie di punti dati. Per preparare le 10 coppie di dati per una regressione lineare, si sottrae la deviazione iniziale dal secondo numero delle coppie registrate.
Aggiungere cinque coppie di controllo di zero zero alle 10 coppie di dati sperimentali per ancorare la regressione lineare a zero, ovvero a deflessione nulla, a forza nulla. Calcolare la regressione lineare utilizzando queste 15 coppie di dati.
La costante elastica dell'ago di vetro intermedio è uguale alla costante di flessione nota degli aghi di filo divisa per la pendenza della retta di regressione. Quindi calibrare gli aghi di vetro di lavoro rispetto all'ago di vetro intermedio come appena descritto. Aghi di vetro con meno di due micron per micrometro possono essere leggermente accorciati per portarli in un intervallo di rigidità appropriato.
Premere gli aghi da rivestire contro il lato di un pezzo di argilla tenuto sopra un becher da 10 millilitri contenente la soluzione del fattore di adesione, in modo che solo la punta dell'ago sia immersa nella soluzione in modo sequenziale. Immergere gli aghi nella soluzione di polilisina 0,1% per 30 minuti. Successivamente, immergere gli aghi in conval e a per 30 minuti, trattando contemporaneamente l'ago con fattori di adesione.
Accendere il sistema di riscaldamento dell'incubatore o del palchetto del microscopio, in modo che il palchetto raggiunga l'equilibrio termico. La postazione di trazione montata su un tavolo a isolamento dalle vibrazioni è costituita da un microscopio invertito dotato di un manipolatore idraulico che sostiene un'estensione personalizzata bilanciata, all'interno della quale viene inserito il portastrumenti doppio.
Inserire un ago di riferimento non calibrato in un portaago in modo che sporga il più possibile. Posizionare questo insieme sul lato destro del portaago doppio. Inserire quindi l'ago di lavoro trattato in un portaago in modo che sporga per metà rispetto all'ago di riferimento e posizionarlo sul lato sinistro del portaago doppio.
Impostare inizialmente il micromanipolatore idraulico in modo che il controllo verticale sia completamente sollevato. Successivamente, avvicinare le punte delle due aghi utilizzando la vite di regolazione laterale. Posizionare l'ago.
Quindi, esaminare visivamente la coppia lateralmente e utilizzare la vite superiore-inferiore per portare le punte nello stesso piano. Ruotare il supporto dello strumento e posizionare le punte degli aghi nel percorso luminoso sopra la superficie del mezzo. Inclinarle verso il basso con un angolo ripido.
Serrare la vite del giunto sferico alla base. Mettere a fuoco verso l'alto, sopra le cellule, sul fondo della piastra utilizzando l'obiettivo 10x. Abbassare gli aghi nel mezzo per individuare le punte degli aghi nel campo visivo del microscopio.
Prima di immergerli troppo in profondità nella piastra di coltura. Spostare l'ago lateralmente avanti e indietro e cercarne l'ombra. Una volta che un ago è in vista, ruotare la vite laterale per determinare quale ago sia stato individuato.
Se si muove insieme alla vite, è l'ago di riferimento. Se non si muove, è l'ago calibrato. Una volta individuati entrambi gli aghi, utilizzare i comandi fini del supporto doppio per allinearli.
L'obiettivo è posizionare le punte degli aghi a circa 50 micrometri di distanza, ovvero circa un pollice sul monitor. Il riferimento dovrebbe trovarsi più in alto rispetto alla piastra di coltura e quindi leggermente fuori fuoco. Quando l'ago di traino è a fuoco sulla piastra, registrare l'immagine di questa posizione finale regolata.
La distanza di separazione tra gli aghi costituisce la distanza di riferimento zero. Sollevare gli aghi al di sopra del piano del campione e posizionarli al bordo del campo visivo. Selezionare un assone sperimentale seguendo le indicazioni riportate nel protocollo scritto.
Spostare gli aghi vicino al cono di crescita dell'assone e registrare nuovamente la distanza zero. Successivamente, attivare la tavola antivibrante per manipolare un cono di crescita sull'ago. Posizionare l'ago trainante accanto al cono di crescita al di sotto di esso, quindi abbassare l'ago contro il fondo della piastra.
Questo farà deviare verso l'alto l'ago, che si piegherà e scivolerà lungo la piastra entrando nel cono di crescita, per poi staccare il cono di crescita e spostarlo verso l'alto. Premere l'ago contro il fondo della piastra con la giusta pressione, in modo che il cono di crescita si agganci alla punta dell'ago, ma non così forte da farlo scivolare oltre l'ago e indietreggiare. Attendere 20 minuti per permettere al collegamento di stabilizzarsi.
Quando il cono di crescita si trova sull'ago, applicare una leggera tensione spostando l'ago verso destra e sollevandolo leggermente; compensare il movimento verso il basso dell'ago spostandolo leggermente in avanti mentre viene sollevato. Sollevare l'ago a stadi fino a quando il prolungamento ad esso attaccato risulti perpendicolare all'ago e posizionato al di sopra della superficie della piastra. Il traino avviene spostando gli aghi lontano dal corpo cellulare.
A incrementi minimi, si osservano forze come un aumento dello spazio tra gli aghi mentre si aumenta gradualmente la tensione. Osservare attentamente eventuali segni di distacco del cono di crescita dall'ago. Mantenere il livello del mezzo nella piastra aggiungendo acqua ogni ora per compensare l'evaporazione.
Utilizzando un segno sul lato della piastra per indicare la profondità iniziale, aggiungere lentamente acqua lungo il lato della piastra, lontano dagli aghi, alla fine dell'esperimento. Prima di sollevare gli aghi dalla piastra, verificare nuovamente la distanza zero. Leggere le posizioni degli aghi lungo l'asse orizzontale sullo schermo.
Registrare anche la posizione del corpo cellulare e i momenti in cui la distanza di separazione degli aghi, meno la distanza zero a riposo, moltiplicata per la costante di flessione dell'ago, equivale ai micron di forza applicata. Illustrato. Ecco un esempio di campo di cellule con diverse possibili scelte per controllare lo sviluppo assonale. L'assone orizzontale con un grande cono di crescita rappresenta una buona selezione.
Il corpo cellulare è posizionato vicino al margine dello schermo e gli aghi vengono avvicinati al cono di crescita. Viene acquisita un'immagine della separazione degli aghi a carico nullo, che corrisponde alla distanza zero. Prima dell'inizio dell'esperimento, l'ago trainante viene appoggiato contro il cono di crescita per verificare se può realizzarsi un'adesione spontanea.
Quindi l'ago viene inserito ulteriormente all'interno del cono di crescita. La manovra di avanzamento viene eseguita abbassando l'ago contro il fondo della piastra, provocando la flessione dell'ago stesso e facendolo scivolare nel cono di crescita, staccandolo. È stata inoltre applicata una piccola incremento di tensione in avanti.
Dopo 15 minuti, l'assone appare esteso a seguito del movimento in avanti dell'ago. Successivamente, si aggiunge ulteriore tensione all'ago di traino e si inizia a sollevare l'ago. Viene applicata tensione aggiuntiva, indicata dall'aumento della separazione tra gli aghi.
A questo punto, l'assone si sta chiaramente allungando. L'ago di riferimento non si è spostato in avanti, ma l'assone è cresciuto verso di esso, riducendo la tensione. Inoltre, gli aghi sono stati sollevati leggermente.
Qui ancora, viene aggiunta ulteriore tensione all'ago di traino. È avvenuta una crescita significativa in risposta alla tensione applicata all'ago di traino flesso. Al termine dell'esperimento, viene eseguito un controllo finale dello zero.
L'intero processo è dimostrato in questa sequenza in time-lapse. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come calibrare gli aghi, manipolare il cono di crescita su un ago e misurare le forze durante l'allungamento di un assone.
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Panoramica
Questo studio presenta una metodologia per allungare gli assoni misurando con precisione le forze nell'ordine dei microdyn utilizzando aghi di vetro calibrati. L'approccio consente di indagare diversi aspetti dello sviluppo assonico, inclusi la dinamica di iniziazione e di allungamento.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biophysica
Sfondo
- Comprendere lo sviluppo assonale è fondamentale per ottenere informazioni sul funzionamento neuronale.
- La misurazione delle forze applicate ai neuroni può rivelare importanti proprietà biofisiche.
- Aghi calibrati forniscono un metodo preciso per la misurazione della forza.
- Questa tecnica può migliorare la nostra conoscenza dei meccanismi di allungamento assonale.
Scopo dello studio
- Estendere gli assoni misurando contemporaneamente le forze coinvolte nel processo.
- Studiare la biofisica dell'allungamento assonale.
- Sviluppare una metodologia affidabile per future ricerche sulla dinamica assonale.
Metodi Utilizzati
- Realizzazione di aghi in vetro conici mediante un estrattore di microlancette regolabile.
- Calibrazione di aghi di riferimento in metallo per misurazioni precise della forza.
- Trascinamento dei coni di crescita con aghi operativi per allungare gli assoni.
- Registrazione dell'allungamento assonico e misurazione delle forze in base alla flessione dell'ago.
Risultati principali
- Estensione riuscita degli assoni durante la misurazione di forze nell'ordine dei microdyn.
- Dimostrato il rapporto tra le forze applicate e l'allungamento assonale.
- Fornito informazioni sulle meccaniche dello sviluppo assonale.
- Convalidato l'uso di aghi calibrati per misurazioni precise.
Conclusioni
- La metodologia consente studi dettagliati della dinamica assonale.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dello sviluppo neuronale.
- Questo approccio può essere applicato a diverse domande di ricerca in neuroscienze.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La manipolazione meccanica degli assoni neuronali mediante microfibre calibrate consente l'applicazione e la misurazione precisa di forze nell'intervallo 10-1000 μdyne, fornendo un metodo diretto per indagare i meccanismi biofisici della crescita assonale. Questo approccio supporta la validazione di bersagli nella scoperta di farmaci nel campo delle neuroscienze, permettendo una riduzione del rischio meccanicistica delle vie di allungamento assonale attraverso stimolazione meccanica controllata. La tecnica offre un valore predittivo per la valutazione degli effetti dei composti sulla crescita dei neuriti e sulla connettività sinaptica in modelli preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi diretta della meccanica dei coni di accrescimento assonali per validare bersagli terapeutici coinvolti nell'estensione e nel restringimento dei neuriti.
- Valore operativo: Fornisce dati quantitativi su forza e spostamento per correlare bersagli molecolari a fenotipi biofisici nello sviluppo assonale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera misurazioni di forza standardizzate e riproducibili, adatte per lo screening ad alto contenuto di composti che influenzano la dinamica assonale.
- Valore operativo: Permette la calibrazione e la normalizzazione del saggio mediante riferimenti meccanici tracciabili, migliorando la comparabilità dei dati tra diversi studi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la modellizzazione di lesioni e rigenerazione assonali rilevanti per le malattie applicando stimoli meccanici controllati a colture neuronali.
- Valore operativo: Consente il monitoraggio longitudinale delle risposte assonali a interventi meccanici e farmacologici nella validazione preclinica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo letture biomeccaniche che integrano saggi molecolari e di imaging nelle fasi di validazione del bersaglio e di identificazione dei composti promettenti.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su segnali di guida assonale e regolatori del citoscheletro mediante perturbazione meccanica diretta.
- Screening: Fornisce metriche quantitative in tempo reale di forza e allungamento per valutare gli effetti di composti sulla crescita dei neuriti.
- Analisi: Produce curve forza-tempo e spostamento-tempo che permettono il confronto statistico delle risposte assonali tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega la meccanica assonale in vitro alla rilevanza in vivo modellando stimoli meccanici presenti nello sviluppo e nel danno neuronale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per studi di meccanobiologia su diversi tipi cellulari neuronali e modelli di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l’ambiguità meccanicistica nei percorsi di crescita assonica consentendo l’applicazione e la misurazione diretta delle forze.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di taratura degli aghi e di misurazione delle forze.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo dati sull’efficacia biofisica insieme ai risultati molecolari nei saggi di crescita dei neuriti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta per rischio degli obiettivi in base al loro ruolo nei processi di sviluppo assonico sensibili alle forze.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta esperienza in microchirurgia, micromanipolazione e tecniche di coltura neuronale per un traino affidabile degli assoni e la misurazione delle forze.
- La strumentazione comprende estrattori di micropunture, microscopi invertiti con reticoli oculari, micromanipolatori e tavoli con isolamento dalle vibrazioni.
- La standardizzazione tra i gruppi richiede protocolli condivisi per la fabbricazione delle punture, la calibrazione e il trattamento dei fattori di adesione.
- L'adattamento a diversi sottotipi neuronali potrebbe richiedere un'ottimizzazione della rigidità della puntura e del rivestimento superficiale per un efficace coinvolgimento del cono di crescita.
- I limiti pratici includono l'abilità tecnica necessaria per la calibrazione della puntura e la suscettibilità delle misurazioni alla deriva in assenza di controlli frequenti alla distanza zero.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:42
Fabrication of Glass Needles and Wire Needles
2:15
Calibration of the Intermediate and Working Glass Needles
3:42
Coating Needles with Attachment Factors
4:13
Equipment Set Up and Needles Alignment
6:15
Cell Attachment
7:19
Axon Extension and Data Analysis
8:13
Representative Results for Controlling Axonal Development
9:43
Conclusion
