Name: Profilo Esperimento bioenergetica utilizzando cellule dei mioblasti C2C12 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-06T16:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Impara a profilare la funzione mitocondriale nelle cellule C2C12 utilizzando l'analizzatore XF 96. Questo metodo misura la respirazione basale, il turnover ATP e la capacità di riserva per studiare il metabolismo cellulare.

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In questo esperimento, mioblasti C2C12 cellule vengono seminate ad una densità dato in lastre di cellule Seahorse cultura. Il consumo di ossigeno basale (OCR) e l'acidificazione extracellulare (ECAR) sono misurati per stabilire i tassi di riferimento. 1. Cellule di iniezione Le cellule sono metabolicamente perturbati da tre all'aggiunta di composti diversi (in successione) che spostano il profilo bioenergetico della cellula. Un gruppo servirà come il controllo, con la corsa media, ha aggiunto il controllo "composti". <ol><li> La prima iniezione è oligomicina. Oligomicina inibisce la sintesi di ATP, bloccando il canale protonico della porzione F o ATP sintasi (complesso V). Nella ricerca mitocondriale, è usato per prevenire lo stato 3 (fosforilazione) respirazione. Con le cellule, può essere utilizzato per distinguere la percentuale di consumo di O2 dedicata alla sintesi di ATP e la percentuale di consumo di O2 necessari per superare la perdita naturale di protoni attraverso la membrana mitocondriale interna. </li><li> La seconda iniezione è FCCP. FCCP (carbonile cianuro-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) è un ionoforo che è un vettore di ioni mobili. Si tratta di un agente disaccoppiamento perché interrompe la sintesi di ATP da trasportare ioni di idrogeno attraverso la membrana mitocondriale invece del canale protonico della ATP sintasi (complesso V). Questo collasso del potenziale di membrana mitocondriale porta ad un rapido consumo di energia e ossigeno senza la produzione di ATP. In questo caso, sia OCR e ECAR aumenterà, OCR a causa di disaccoppiamento, e ECAR come le cellule tentativo di mantenere l'equilibrio energetico utilizzando glicolisi per produrre ATP. FCCP trattamento può essere usata per calcolare la capacità di "ricambio" delle cellule delle vie respiratorie che è definito come la differenza quantitativa tra massima incontrollata OCR e l'iniziale OCR basale. E 'stato proposto che il mantenimento di una certa capacità di riserva respiratoria anche in condizioni di massima stimolo fisiologico o fisiopatologico è uno dei principali fattori che definiscono la vitalità e / o la sopravvivenza delle cellule. La capacità delle cellule di rispondere allo stress, in condizioni di maggiore domanda energetica è in gran parte influenzato dalla capacità bioenergetiche dei mitocondri. Questa capacità bioenergetico è determinata da diversi fattori, inclusa la capacità della cellula di fornire supporto ai mitocondri e la capacità funzionale degli enzimi coinvolti nel trasporto degli elettroni </li><li> Nella terza iniezione, rotenone, un inibitore complesso I, si aggiunge alle cellule. Questa si spegnerà la respirazione mitocondriale e consentirà ad entrambe le frazioni mitocondriali e non contribuisce alla respirazione mitocondriale da calcolare. Un osserverà una diminuzione OCR a causa di alterata funzione mitocondriale, con un aumento concomitante ECAR come la cellula si sposta verso uno stato più glicolitica al fine di mantenere il proprio equilibrio energetico Rotenone è un inibitore mitocondriale che impedisce il trasferimento di elettroni dal Fe-S centro Complesso I ubichinone (coenzima Q). Questa inibizione del complesso I impedisce l'energia potenziale in NADH di essere convertito in energia utilizzabile sotto forma di ATP. </li></ol> 2. Reagenti e materiali <ol><li> Oligomicina, FCCP, e soluzioni Rotenone (Seahorse Kit Mito stress test) </li><li> DMEM corsa Media (Seahorse # 100965-000) </li><li> DMSO (Sigma D8418) </li><li> Acqua distillata (Gibco 15230-170) </li><li> Calibrazione del buffer (Seahorse Bioscience) </li></ol> 3. Crescita media <ol><li> 500 ml DMEM (Gibco 11965-092) </li><li> 10% FBS (Hyclone SH90070.03) </li><li> 5 ml Penn / Strep (Gibco 15140-122) </li><li> 5 ml Piruvato di sodio (Sigma S8636) </li><li> 5 ml Glutamax (Gibco 35050-061) </li></ol> 4. Semina protocollo <ol><li> Le cellule sono seminate in piastre di colture cellulari XF96 con 10.000 cellule / pozzetto in 100 ml di mezzo di crescita e posti in incubatore a 37 ° C con 10% di CO 2. </li><li> Cellule aderiscono alla piastra di coltura cellulare XF96 entro 1 ora. </li><li> Cellule saggio in XF96 24 ore dopo la semina. </li></ol> 5. Preparazione del modello di analisi <ol><li> Utilizzando la procedura guidata di analisi (Appendice I), generare un modello con il layout seguente gruppo: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Layout di griglia ben identificare incarichi colonna e di gruppo </li></ol> 6. Composto di preparazione <ol><li> Preparare i seguenti composti in XF DMEM Assay media come segue: 10 oligomicina uM, uM FCCP 30,0, 20,0 Rotenone mM, Queste concentrazioni rappresentano la diluizione 10X, che sarà fatta quando i composti vengono iniettate nel pozzo. Le concentrazioni di lavoro sono: 1 oligomicina uM, 3.0 uM FCCP, 2.0 mM Rotenone </li></ol> 7. Cambia mezzi e preparazione cellulare <ol> Posizionare la piastra cella del Prep XF Stazione <li> Impostare il volume finale di media a 160 microlitri per bene. </li><li> Incubare a 37 ° C incubatore senza CO 2 per 60 minuti per consentire alle cellule di pre-equilibrare con il terreno di coltura. </li></ol> 8. Caricamento della cartuccia del sensore <ol><li> Composti calda a 37 ° C prima del caricamento della cartuccia sensore e caricare i composti nelle porte iniettore come segue: <ol><li> Colonne 1-4: Carico 16, 18 e 20 ml di XF Assay media (DMEM) nei porti A, B e C, rispettivamente. </li><li> Colonne 5-12: Carico da 16 ml di oligomicina nei porti A Carico di 18 l di FCCP nei porti B Carico di 20 l di Rotenone nei porti C </li></ol></li></ol> 9. Protocollo comandi <table border="1"><tbody><tr><td> Comando </td><td> Tempo (min) </td><td> Porto </td></tr><tr><td> Calibrare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Equilibrare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 3X </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Aspettare </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Loop End </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Iniettare </td><td></td><td> A </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Aspettare </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Iniettare </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Aspettare </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Iniettare </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Aspettare </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Fine </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Protocollo comandi

<ol><li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale%3A+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li>
<li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li>
<li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li>
<li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li>
<li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells%3A+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li>
<li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li>
<li>Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li>
<li>Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2%2B+transfer+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li>
</ol>

Min Wu, Per Bo Jensen, George W. Rogers e David A. Ferrick sono dipendenti della Seahorse Bioscience, che produce reagenti e strumentazioni presenti in questo articolo.

Questo test è derivato dal classico esperimento per sondare la funzione mitocondriale e funge da quadro con cui costruire esperimenti più complessi volti a comprendere diversi cambiamenti nel metabolismo cellulare, la funzione mitocondriale, e bioenergetica generale. Tutti i composti utilizzati in questo esperimento dovrebbe essere ottimizzato per la concentrazione che fornisce il massimo effetto. Che è, si deve eseguire esperimenti di titolazione separati per accertare questi valori. Questo è particolarmente importante con FCCP, come la curva di titolazione tende ad essere abbastanza forte, e FCCP troppo può effettivamente diminuire risposte in OCR. Range tipico (concentrazioni finali) per testare sarebbe: <ul><li> 0,1-1,0 ug / mL di oligomicina </li><li> 0,1-5,0 uM FCCP </li><li> 0,1-1,0 Rotenone uM </li></ul> Si noti che le risposte a ogni composto sopra (soprattutto FCCP) sarà influenzata dalla composizione del test media (tipo di base, [glucosio], [piruvato], presenza / assenza di BSA, ecc.) Inoltre, se il test XF mezzi di comunicazione la composizione è cambiata, ottimizzazione dovranno essere nuovamente eseguite. La presenza e la concentrazione di piruvato è particolarmente importante per ottenere la massima capacità respiratoria a causa di FCCP. Seahorse Bioscience ha osservato in un numero di linee di cellule che omissione del piruvato abroga la capacità delle cellule di rispondere al massimo (di sopra del basale) per FCCP. Tipicamente, le concentrazioni di piruvato 1-10 mm dovrebbe essere testato per capire la concentrazione ottimale di piruvato di ottenere la massima respirazione. Si noti che [piruvato] E [glucosio] potrebbe essere necessario "cross-titolato" per ottenere le condizioni ottimali dei media per l'esperimento. Risultati tipici di questo esperimento sono presentati qui di seguito in un grafico che mostra OCR in funzione del tempo e un altro che mostra ECAR tempo contro: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. OCR vs Tempo <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. ECAR vs Tempo Qui abbiamo osservato le risposte attese in OCR e ECAR come le cellule vengono trattate con ogni composto successive. Per oligomicina, OCR diminuisce a causa del blocco alla sintesi di ATP mitocondriale Complesso V. Poiché le cellule sono in grado di sintetizzare ATP via OXPHOS, ritornano a glicolisi per soddisfare la loro domanda di ATP, in tal modo si osserva un aumento della ECAR. Come mostrato in precedenza, FCCP agisce come un agente sganciamento. Dal momento che le cellule devono ora superare la perdita di protoni attraverso la membrana mitocondriale interna, OCR aumenta in maniera significativa come più O2 viene consumato per pompare i protoni in eccesso indietro attraverso la membrana mitocondriale. Infine, rotenone inibisce Complesso I mitocondriale e Complesso III, rispettivamente, che fa sì che il flusso di elettroni al cessare della catena di trasporto degli elettroni, e quindi il consumo di O2 è drasticamente ridotto. <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Respirazione parametri Al di là dei cambiamenti attesi nella respirazione e ECAR, una serie di parametri respiratori possono essere ottenute da questi dati. Questo è riassunto nella figura sopra: Qui vediamo che si può ottenere informazioni circa la respirazione basale delle cellule, la percentuale di consumo di O2 dedicata alla produzione di ATP e l'importo destinato a mantenere il gradiente di protoni (H + a causa di perdite). Inoltre, possiamo ottenere la massima capacità respiratoria in condizioni di respirazione disaccoppiato (a volte indicato come ricambio capacità respiratoria) e, infine, siamo in grado di determinare la quantità di consumo di O2 non a causa di processi mitocondriali. Un numero sempre crescente di studi stanno utilizzando questo profilo mitocondriale per la valutazione bioenergetica cellulare, identificare la disfunzione mitocondriale e di predire la capacità delle cellule di rispondere allo stress e / o insulti. Per ulteriori informazioni e dettagli su questo metodo sperimentale e l'idea di ricambio capacità respiratoria, consultare riferimento alle seguenti pubblicazioni 1-8.

<table><tbody><tr><td>Soluzioni di oligomicina, FCCP, rotenone e antimicina A</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td>Kit per il test di stress mitocondriale Seahorse</td></tr><tr><td>Mezzo di esercizio DMEM</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100965-000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15230-170</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di calibrazione</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

profilo esperimento bioenergetica utilizzando cellule dei mioblasti c2c12

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

La capacità di misurare il metabolismo cellulare e comprendere la disfunzione mitocondriale, ha permesso agli scienziati di tutto il mondo per promuovere la loro ricerca nella comprensione del ruolo della funzione mitocondriale nell&#39;obesità, tossicità diabete, invecchiamento, il cancro, la funzione cardiovascolare e sicurezza. Metabolismo cellulare è il processo di assorbimento di substrato, come l&#39;ossigeno, glucosio, acidi grassi, e glutammina, e conversione di energia attraverso una serie successiva di ossidazione enzimatica controllata e reazioni di riduzione. Queste reazioni biochimiche intracellulari risultato nella produzione di ATP, il rilascio di calore e sottoprodotti chimici, come il lattato e CO 2 nell&#39;ambiente extracellulare. Informazioni preziose sullo stato fisiologico delle cellule, e l&#39;alterazione dello stato di queste cellule, può essere ottenuta attraverso la misurazione del tasso di ossigeno consumato da parte delle cellule, un indicatore della respirazione mitocondriale - il tasso di consumo di ossigeno - o OCR. Cellule anche generare ATP attraverso la glicolisi, ovvero: la conversione del glucosio in lattato, indipendente di ossigeno. In pozzi colto, lattato è la fonte primaria di protoni. Misurare l&#39;acido lattico prodotto indirettamente attraverso i protoni rilasciati nel mezzo extracellulare che circonda le cellule, che provoca acidificazione del mezzo fornisce extracellulare Vota acidificazione - o ECAR. In questo esperimento, mioblasti C2C12 cellule vengono seminate ad una densità dato in lastre di cellule Seahorse cultura. Il consumo di ossigeno basale (OCR) e l&#39;acidificazione extracellulare (ECAR) sono misurati per stabilire i tassi di riferimento. Le cellule sono poi metabolicamente perturbati da tre all&#39;aggiunta di composti diversi (in successione) che spostano il profilo bioenergetico della cellula. Questo test è derivato da un esperimento classico per valutare mitocondri e funge da quadro con cui costruire esperimenti più complessi volti a comprendere la funzione sia fisiologici e fisiopatologici dei mitocondri e di predire la capacità delle cellule di rispondere allo stress e / o insulti.

Una descrizione di un metodo per la profilatura funzione mitocondriale nelle cellule è fornito. Il profilo mitocondriale generato fornisce quattro parametri della funzione mitocondriale, che può essere misurata in un esperimento: frequenza respiratoria basale, ATP-linked respirazione, perdita protonica, e la capacità di riserva.

Profilo Esperimento bioenergetica utilizzando cellule dei mioblasti C2C12

La capacità di misurare il metabolismo cellulare e di comprendere la disfunzione mitocondriale ha permesso agli scienziati di tutto il mondo di far progredire la ricerca in...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è verificare lo stato funzionale dei mitocondri in cellule vive e mitocondri isolati misurando diversi parametri del metabolismo ossidativo mediante l'analizzatore del flusso extracellulare XF 96. Questi parametri sono la respirazione basale, il ricambio dell'ATP, la perdita protonica e la respirazione massima o la capacità respiratoria di riserva. Ciò si ottiene aggiungendo in sequenza specifici modulatori della respirazione mitocondriale a cellule mioblastiche C2C12 e misurando la variazione del tasso di consumo di ossigeno, o OCR, un indicatore della respirazione, e della conversione del glucosio in lattato, che genera ATP attraverso la glicolisi.L'altro importante percorso metabolico nelle cellule viene misurato anche come ECAR, ovvero tasso di acidificazione extracellulare. È possibile ottenere profili mitocondriali che forniscono informazioni sul ruolo centrale svolto dalla funzione mitocondriale nella determinazione della durata della vita delle cellule. Ciao, mi chiamo David Nichols.Sono stato un artista dei mitocondri per tutta la mia carriera e il dispositivo più importante che ho utilizzato nei miei studi è stato l'elettrodo per l'ossigeno. Se si riesce a misurare la velocità di assorbimento dell'ossigeno in diverse condizioni con mitocondri isolati, si ottiene un'informazione estremamente significativa. Quando si passa alle cellule, specialmente a cellule coltivate in una piastra multipozzetto o su un cover slip, i metodi classici non funzionano.Questo è un problema importante, che è stato superato alcuni anni fa grazie allo sviluppo di un saggio in piastre multipozzetto che ci permette di studiare in parallelo la respirazione cellulare in un formato a piastre multipozzetto. Quello che vedrete oggi è un esperimento molto semplice ma ricco di informazioni, che abbiamo ideato per monitorare la funzione bioenergetica mitocondriale di base in cellule in coltura. Per iniziare, seminare le cellule in piastre per colture cellulari XF 96 con 10.000 cellule per pozzetto in 100 microlitri di mezzo di crescita e collocare in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 10% di anidride carbonica.Le cellule possono essere saggiate nel XF 96, 24 ore dopo la semina, utilizzando il saggio. L'assistente genera un modello con la seguente disposizione dei gruppi. Le colonne da uno a dodici contengono tutte 10.000 cellule C2C12.Il gruppo uno in blu viene utilizzato come controllo cellulare. Al gruppo due in rosso verranno somministrati i farmaci oligo Micina, FCCP e roone. Successivamente, preparare i composti nel mezzo di saggio X-F-D-M-E-M come descritto nella parte scritta del protocollo.Oligomicina, FCCP, rotenone. Questi composti sono pre-dispensati nel kit del test di stress mitocondriale XF. Utilizzando la stazione di preparazione XF, sostituire il mezzo di crescita con mezzo di esecuzione DMEM.Infine, incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica per 60 minuti, in modo da permettere alle cellule di pre-equilibrarsi con il mezzo dell'assay prima di aggiungere i composti iniettabili nella cartuccia del sensore, riscaldando i composti a 37 gradi Celsius. Successivamente, caricarli nei porti dell'iniettore come segue. Per le colonne da uno a quattro, aggiungere 16, 18 e 20 microlitri di mezzo XF assay o DMEM rispettivamente nei porti A, B e C.Per le colonne da cinque a dodici, caricare 16 microlitri di tutti i liga micina nella porta A, 18 microlitri di FCCP nella porta B e 20 microlitri di rot noto nella porta C. Successivamente, definire i comandi del protocollo: impostare il ciclo su tre volte. Mescolare per tre minuti e misurare per tre minuti. Quindi, fare clic su avvia.Seguire le istruzioni sullo schermo che indicheranno all'utente quando caricare la cartuccia al termine della calibrazione. Seguire i messaggi guidati e aggiungere la piastra cellulare per l'esperimento. Quindi fare clic su continua e lasciare che il saggio proceda.Rimuovere la piastra al termine dell'esperimento. Questo saggio deriva dall'esperimento classico per lo studio della funzione mitocondriale e costituisce una base su cui sviluppare esperimenti più complessi volti a comprendere gli effetti di diversi composti sul metabolismo cellulare, sulla funzione mitocondriale e sulle attività bioenergetiche complessive. In questo caso, abbiamo osservato la risposta attesa nel tasso di consumo di ossigeno man mano che le cellule venivano trattate con ciascun composto in successione.Per la ligamicina, la quantità di ATP diminuisce a causa del blocco della sintesi di ATP nel complesso mitocondriale V. Poiché le cellule non erano in grado di sintetizzare ATP mediante fosforilazione ossidativa dopo il trattamento con ligamicina, sono ricorse alla glicolisi per soddisfare la loro richiesta di ATP. Di conseguenza, abbiamo osservato un aumento del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), un indicatore della glicolisi, come mostrato in precedenza. La FCCP agisce come agente disaccoppiante e rimuove il limite al reingresso dei protoni.La respirazione accelera ed è ora limitata dal trasporto di elettroni. Infine, il rotenone inibisce il complesso I mitocondriale, causando l'arresto del flusso di elettroni nella catena di trasporto degli elettroni e, di conseguenza, il consumo di ossigeno è drasticamente ridotto. In questo modo si ottengono informazioni sulla respirazione basale delle cellule, sulla percentuale di consumo di ossigeno destinata alla produzione di ATP, nonché sulla quantità impiegata per mantenere il gradiente protonico a causa della perdita di protoni.Inoltre, possiamo ottenere la massima velocità respiratoria in condizioni di respirazione disaccoppiata, talvolta definita capacità respiratoria di riserva. E infine, possiamo determinare la quantità di consumo di ossigeno non attribuibile a processi mitocondriali. Avete appena visto con il Seahorse.XF 96, una serie di esperimenti che fornisce un'enorme quantità di informazioni sulla bioenergetica mitocondriale nelle cellule. L'esperimento fondamentale, così importante da essere chiamato esperimento numero uno, fornisce dati sulla respirazione basale, sul ricambio dell'ATP, sulla perdita protonica mitocondriale e sulla capacità respiratoria di riserva. Questi parametri forniscono informazioni essenziali sullo stato bioenergetico dei mitocondri all'interno della cellula.

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Analisi in tempo reale della bioenergetica in cellule epiteliali pigmentate primarie della retina umana mediante respirometria ad alta risoluzione

Le cellule mononucleate isolate del sangue periferico possono essere utilizzate per l'analisi delle funzioni e dei disturbi immunitari, delle malattie metaboliche o delle funzioni mitocondriali. In questo lavoro, descriviamo un metodo standardizzato per la preparazione di PBMC da sangue intero e la successiva crioconservazione. La crioconservazione rende questo tempo e questo luogo indipendenti.

Crioconservazione e valutazione bioenergetica delle cellule mononucleate del sangue periferico umano

Impara a profilare la funzione mitocondriale nelle cellule C2C12 utilizzando l'analizzatore XF 96. Questo metodo misura la respirazione basale, il turnover ATP e la capacità di riserva per studiare il metabolismo cellulare.

Profilo Esperimento bioenergetica utilizzando cellule dei mioblasti C2C12

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