Profilo Esperimento bioenergetica utilizzando cellule dei mioblasti C2C12

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di testare lo stato funzionale dei mitocondri in cellule viventi e mitocondri isolati misurando più parametri del metabolismo ossidativo utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare XF 96. Questi parametri sono la respirazione basale, il turnover A TP, la perdita di protoni e la respirazione massima o capacità respiratoria di riserva. Ciò si ottiene aggiungendo in sequenza modulatori specifici della respirazione mitocondriale alle cellule C due mioblasti C 12 e misurando la variazione del tasso di consumo di ossigeno, o OAR, un indicatore della respirazione, la conversione del glucosio in lattato, che genera un TP attraverso la glicolisi.

L'altra principale via energetica nelle cellule è anche misurata come ECAR o tasso di acidificazione extracellulare. Si possono ottenere risultati di profilazione mitocondriale che forniscono informazioni sul ruolo centrale che la funzione mitocondriale svolge nel determinare la durata della vita delle cellule. Ciao, mi chiamo David Nichols.

Sono stato un artista mitocondriale per tutta la mia carriera e l'attrezzatura più importante che ho usato nei miei studi è stato l'elettrodo di ossigeno. Se si riesce a misurare il tasso di assorbimento di ossigeno in diverse condizioni con mitocondri isolati, si ottengono informazioni molto importanti. Quando si passa alle cellule, in particolare alle cellule che vengono coltivate in una piastra a più pozzetti o su un vetrino coprioggetti, i metodi classici non funzionano.

Si tratta di un problema importante, che è stato superato alcuni anni fa con lo sviluppo di un test su piastra multipozzetto che ci consente di studiare la respirazione delle cellule in parallelo in un formato di piastra multipozzetto. Quello che vedrete oggi è un esperimento molto semplice ma ricco di informazioni, che abbiamo ideato per monitorare la funzione bioenergetica mitocondriale di base nelle cellule in coltura To Begin seed cells. In XF 96 piastre per colture cellulari con 10.000 cellule per pozzetto in 100 microlitri di crescita, terreno e posto in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 10% di anidride carbonica.

Le cellule possono essere analizzate nell'XF 96, 24 ore dopo la semina con il saggio. La procedura guidata genera un modello con il seguente layout di gruppo. Le colonne da uno a 12 contengono tutte 10.000 celle C due C 12.

Il gruppo uno in blu viene utilizzato come celle di controllo. Il secondo gruppo in rosso verrà somministrato i farmaci oligo micina, FCCP e roone. Successivamente, preparare i composti nel terreno di saggio X-F-D-M-E-M come descritto nella parte scritta del protocollo.

Oligo micina, FCCP, marcio noto. Questi composti sono predosati nel kit per stress test XF cell MIT. Utilizzando la stazione di preparazione XF, sostituire il terreno di coltura con il mezzo di scorrimento DMEM.

Infine, incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica per 60 minuti per consentire alle cellule di pre-equilibrarsi con il terreno di analisi prima di aggiungere i composti iniettabili nella cartuccia del sensore per formare i composti a 37 gradi Celsius. Quindi caricarli nelle porte dell'iniettore come segue. Per le colonne da uno a quattro, caricare 16, 18 e 20 microlitri di terreno di prova XF o DMEM rispettivamente nelle porte A, B e C.

Per le colonne da cinque a 12, caricare 16 microlitri di tutta la micina liga nella porta A, 18 microlitri di FCCP nella porta B e 20 microlitri di marciume noto nella porta C.Successivamente, definire il protocollo I comandi impostano il ciclo su tre volte. Mescolare a tre minuti e misurare a tre minuti. Quindi, fai clic su Avvia.

Seguire le istruzioni sullo schermo che indicheranno all'utente quando caricare la cartuccia al termine della calibrazione. Segui le istruzioni dell'utente e aggiungi la piastra cellulare per l'esperimento. Quindi fare clic su continua e consentire l'esecuzione del test.

Rimuovere la piastra al termine dell'esperimento. Questo saggio è derivato dal classico esperimento per profilare la funzione mitocondriale e funge da quadro di riferimento per costruire esperimenti più complessi volti a comprendere vari effetti dei composti sul metabolismo cellulare, sulla funzione mitocondriale e sulle attività bioenergetiche complessive. Qui abbiamo osservato la risposta attesa nel tasso di consumo di ossigeno quando le cellule sono state trattate con ogni successo del composto.

Per la liga, la micina di Oard è diminuita a causa del blocco di una sintesi di TP al complesso mitocondriale cinque. Poiché le cellule non erano in grado di sintetizzare un TP tramite fosforilazione ossidativa dopo un trattamento con migina liga, sono tornate alla glicolisi per soddisfare la loro domanda di un TP. Pertanto, abbiamo osservato un aumento dell'ECAR, il tasso di acidificazione extracellulare, un indicatore della glicolisi come mostrato in precedenza. FCCP agisce come agente di disaccoppiamento e rimuove la limitazione del rientro del protone.

La respirazione accelera ed è ora limitata dal trasporto di elettroni. Infine, la meccanica nota inibisce il complesso mitocondriale uno, che provoca la cessazione del flusso di elettroni nella catena di trasporto degli elettroni, e quindi il consumo di ossigeno è stato drasticamente ridotto. Qui si ottengono informazioni sulla respirazione basale delle cellule, la percentuale di consumo di ossigeno dedicata alla produzione di TP, nonché la quantità dedicata al mantenimento del gradiente protonico dovuto alla perdita di protoni.

Inoltre, possiamo ottenere la frequenza respiratoria massima in condizioni di respirazione non accoppiata, a volte indicata come capacità respiratoria di riserva. E infine, possiamo determinare la quantità di consumo di ossigeno non dovuto a processi mitocondriali. L'hai appena visto con il cavalluccio marino.

XF 96, una serie di esperimenti che forniscono un'enorme quantità di informazioni sull'energetica BIE dei mitocondri nella cellula. L'esperimento di base, che è così importante, lo chiamiamo esperimento numero uno, fornisce informazioni sulla respirazione basale, un turnover TP, la perdita di protoni mitocondriali e la capacità respiratoria di riserva. Questi parametri forniscono queste informazioni fondamentali sullo stato bioenergetico dei mitocondri nella cellula.