Una analitica Tool-box per la valutazione completa biochimici, strutturali e trascrittoma di biofilm orale mediata da Mutans Streptococchi

I biofilm formati sulle superfici dentali sono altamente complessi e strutturati. Comunità microbiche intrappolate in una matrice extracellulare, esposte a sfide ambientali costanti. L'obiettivo generale è illustrare due componenti specifiche di un insieme di strumenti analitici progettati per facilitare studi strutturali e molecolari, tenendo conto della natura complessa dei biofilm orali, combinando una nuova tecnica di imaging a fluorescenza con un software personalizzato per l'elaborazione e l'analisi dei dati.

Questo viene realizzato selezionando innanzitutto saggi specifici per l'analisi di biofilm, trascrittoma e struttura, inclusi un nuovo approccio di imaging confocale per la visualizzazione simultanea di EPS e batteri. Il secondo passaggio della procedura consiste nel raccogliere i dati grezzi dai saggi biologici. Il terzo passaggio prevede l'elaborazione dei dati grezzi mediante software specifici, inclusi il nuovo duo stat sviluppato per l'analisi di colocalizzazione.

L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare i dati del processo, inclusi l'utilizzo di software per il data mining e l'organizzazione dei dati da microarray, il visualizzatore di dati da microarray o MDV. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano come i patogeni orali modificano il loro trascrittoma e l'architettura dei biofilm in risposta a una dieta complessa e alle interazioni ospite-microbiche, grazie al nostro strumento analitico unico e integrato, fornendo un'analisi dei biofilm e un'interpretazione dei dati più completa. Ciao, mi chiamo Michelle Kuh, sono professoressa associata presso il centro di biologia orale qui al Medical Center dell'Università di Rochester.

Oggi presentiamo un insieme di strumenti analitici per l'analisi dei biofilm. Questo insieme di strumenti può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sui biofilm, come la struttura delle cellule del biofilm, il loro assetto all'interno della matrice extracellulare e come rispondono a complesse sfide ambientali a livello trascrittomico. Mi chiamo Jean, lei, sono una ricercatrice postdottorato nel laboratorio del Dott. K.

Oggi illustrerò la parte relativa all'imaging del nostro set di strumenti. Ciao, sono Aise Klein. Sono ricercatrice assistente presso il laboratorio del Dottor Ks.

Oggi presenterò il software MDV per l'analisi dei dati di microray. In questa procedura, dischi di idrossiapatite rivestiti con saliva vengono utilizzati come surrogati della superficie dentale su cui coltivare i biofilm. Per prima cosa, aggiungere 2,8 millilitri di mezzo di coltura inoculato con S. mutants in ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, proteggendo la piastra dalla luce, aggiungendo il colorante LOR 647 coniugato con destrina in ogni pozzetto fino a una concentrazione finale di un micromolare ed eseguendo diverse aspirazioni e dispersioni con la pipetta per mescolare il colorante nel mezzo di coltura.

Successivamente, utilizzando pinzette sterili, immergere e lavare due volte i dischi di idrossiapatite ricoperti di saliva sterile in tampone AB sterile per rimuovere l'eccesso di saliva o componenti salivari non legati. Quindi posizionare i dischi verticalmente nel mezzo di coltura supplementato con colorante, assicurandosi che ogni disco sia completamente immerso. Coprire la piastra con pellicola di alluminio e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore con 5% di anidride carbonica per 20 ore, in modo da permettere la formazione dei biofilm e l'incorporazione della texture coniugata nei polisaccaridi extracellulari prodotti dalle cellule batteriche.

Per etichettare prima le cellule batteriche, preparare una piastra a 24 pozzetti con 2,8 millilitri di acqua sterile milli Q per pozzetto. Aggiungere 1,5 microlitri di colorante cyto nine in ogni pozzetto per ottenere una concentrazione finale di un micromolare e proteggere la piastra dalla luce. Una volta formato il biofilm, rimuovere la piastra contenente i dischetti dall'incubatore e immergerla.

Lavare ogni disco in una soluzione di cloruro di sodio allo 0,89%. Successivamente trasferirli nella nuova piastra contenente il colorante citochina. Coprire la piastra con carta d'alluminio e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver colorato le cellule, immergere, lavare i biofilm e il cloruro di sodio come in precedenza. Quindi, utilizzando pinzette, staccare i biofilm dal filo e trasferirli in una piastra di Petri contenente cloruro di sodio. Avvolgere la piastra di Petri con carta d'alluminio.

I biofilm sono ora pronti per essere visualizzati mediante microscopia confocale utilizzando un microscopio confocale a scansione laser. Scansionare ciascun biofilm in cinque-dieci posizioni selezionate casualmente e generare serie in Z in ogni posizione. Per consentire ricostruzioni tridimensionali, aprire le immagini confocali ed elaborarle utilizzando un software apposito.

Questa rappresentazione tridimensionale di immagini confocali prodotta utilizzando il programma Amira mostra un biofilm di ceppi mutanti S formato su una superficie apatica mediante la procedura dimostrata. Le cellule batteriche e le microcolonie sono visibili in verde e sono incorporate nella matrice del biofilm contenente esopolisaccaridi. In rosso, può essere generata una vista ingrandita di un'area selezionata, che illustra la relazione strutturale specifica tra batteri ed EPS a livello microscopico.

Utilizzare il programma duos stat per quantificare la quantità di codistribuzione di componenti separati del biofilm, come i batteri e i polisaccaridi esocellulari. Innanzitutto, impostare il percorso del programma duos stat appena sviluppato nella versione 5.1 di MATLAB e aprire le cartelle delle immagini contenenti le serie Z delle due componenti del biofilm. Successivamente, scegliere due canali che verranno correlati e analizzati.

I due stack di immagini devono avere dimensioni dei pixel identiche in tutte le dimensioni e lo stesso numero di immagini in ciascuno stack. Impostare le soglie per ogni canale e seguire le istruzioni nell'interfaccia software, quindi inserire i dati nel file di elaborazione per l'analisi. Questa figura mostra come lo stack doppio interpreti quantitativamente la relazione spaziale tra batteri e DBS.

All'interno del biofilm, Duo Stack calcola la distribuzione verticale di batteri ed EPS dalla superficie del disco alla fase fluida, come mostrato dalla linea verde per i batteri e dalla linea rossa per l'EPS. Calcola inoltre la codistribuzione (colocalizzazione) di batteri ed EPS lungo lo spessore del biofilm. Come indicato dalla linea gialla, i dati mostrano proporzioni maggiori di EPS rispetto ai batteri lungo tutta la profondità del biofilm e la maggior parte delle cellule batteriche è associata all'EPS, in particolare negli strati intermedi e superiori. Duo Stat, con la rappresentazione tridimensionale, consente una migliore comprensione dell'organizzazione strutturale e delle interazioni tra batteri ed EPS nei biofilm.

Per garantire l'ottenimento di RNA di alta qualità dai biofilm, si raccomanda di eseguire l'estrazione dell'RNA seguendo il protocollo specifico per biofilm descritto nell'articolo di Curian KU pubblicato nel 2007. Nella rivista, vengono utilizzati protocolli standard di biochimica analitica per la preparazione di microarray di DNA e per saggi di PCR quantitativa in tempo reale. Per facilitare l'analisi dei grandi insiemi di dati generati dagli esperimenti con microarray, abbiamo progettato un software per l'analisi e l'organizzazione dei dati, chiamato microarray data visualizer o MDV, disponibile online all'indirizzo www.oralgen.anl.gov.

Prima di inviare i dati a MDV, eseguire un'analisi statistica come un test T accoppiato con modello di varianza casuale utilizzando il software BRB Array Tools disponibile online, con un valore di soglia P di 0,001 per il confronto tra classi. In questo esempio, è stata effettuata l'analisi di biofilm di S. mutans coltivati in tre diverse concentrazioni di zucchero e in quattro punti temporali. Sono stati eseguiti confronti accoppiati, generando tre file BRB: condizione A, 0,5% saccarosio più 1% amido versus 1% saccarosio; condizione B, 0,5% saccarosio più 1% amido versus 0,5% saccarosio; e condizione C, 0,5% saccarosio versus 1% saccarosio.

Questo pannello rappresenta il numero di geni rilevati come differenzialmente espressi in ciascuna condizione e in ciascun punto temporale valutato mediante un'analisi comparativa standard utilizzando lo strumento BRB array, che produce un elevato numero di geni denominati dati grezzi BRB. Per la dimostrazione di MDV, ci concentreremo sul punto temporale di 30 ore utilizzando Excel. Convertire i dati grezzi BRB in file di testo con tabulazioni come separatori per MDV.

Assicurarsi di rimuovere tutte le lettere che accompagnano il numero del tab del locus genico, ad esempio nel nome SMU dot 1432 C. Eliminare la lettera C, aprire MDV. Aprire il menu file e scegliere seleziona fonte annotazione. Selezionare l'opzione file flat quando appare una finestra di dialogo.

Utilizzare i pulsanti di navigazione per selezionare i file che contengono annotazioni per il numero di ontologia genica, dati di classificazione funzionale del percorso e nome del gene. Andare al file e importare ciascuno dei file convertiti nel formato MDV. Ogni file rappresenta una condizione sperimentale.

Confrontare i geni espressi in ciascuna condizione sperimentale A rispetto a B rispetto a C. In questo esempio, si utilizza la funzione del diagramma di Venn. Per questa dimostrazione, ci concentriamo sui geni differenzialmente espressi che sono unicamente associati agli effetti combinati di saccarosio e amido. La funzione basata sul diagramma di Venn viene utilizzata per visualizzare il numero di geni unici e condivisi espressi in queste diverse condizioni e ci aiuta a identificare quelli da selezionare per ulteriori analisi.

Qui selezioniamo soltanto i geni espressi in modo differenziale che sono unici nella condizione A e/o B, ma non quelli rilevati in C, mostrati in grigio come illustrato qui. MDV ha notevolmente ridotto il numero totale di geni da analizzare, filtrando al contempo i geni non rilevanti per il caso sperimentale. Dal menu file, scegliere l'opzione di esportazione per salvare i dati.

Come file con limiti di tabulazione, i file possono quindi essere aperti in Excel, dove l'output dei dati può essere organizzato e convertito nelle rappresentazioni grafiche desiderate. L'organizzazione dei dati in Excel consente la visualizzazione grafica dell'output MDV. Questo grafico mostra una panoramica dell'espressione differenziale di sottoinsiemi funzionali unici di geni che sono influenzati dalla combinazione di amido e saccarosio in diverse fasi dello sviluppo del biofilm.

Gli effetti sul trascrittoma dei mutanti S sono più marcati a 30 ore di sviluppo del biofilm rispetto ad altri punti temporali. I risultati ottenuti ci hanno permesso di identificare con precisione specifici sottoinsiemi funzionali di geni rilevanti per la nostra ipotesi di lavoro, tenendo conto degli effetti temporali che hanno facilitato la selezione genica e il successivo processo di validazione. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti anche metodi biochimici e proteomici per rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio quali sono le specifiche risposte fisiologiche e metaboliche degli organismi all'interno dei biofilm.

Un'analisi così completa e integrata contribuirebbe certamente a comprendere meglio come i biofilm modulano la patogenicità nella cavità orale, un ambiente altamente dinamico e complesso. Per ulteriori dettagli, si prega di consultare il file PDF allegato a questo articolo video.