Una analitica Tool-box per la valutazione completa biochimici, strutturali e trascrittoma di biofilm orale mediata da Mutans Streptococchi

I biofilm formati sulle superfici dei denti sono altamente complessi e strutturati. Comunità microbiche intrappolate in una matrice extracellulare, che sono esposte a costanti sfide ambientali. L'obiettivo generale è quello di mostrare due componenti specifici di una cassetta degli attrezzi analitica progettata per facilitare gli studi strutturali e molecolari, considerando la natura complessa dei biofilm orali combinando una nuova tecnica di imaging a fluorescenza con un software personalizzato per l'elaborazione e l'analisi dei dati.

Ciò si ottiene selezionando prima saggi specifici per l'analisi del biofilm, del trascrittoma e della struttura, incluso un nuovo approccio di imaging confocale per la visualizzazione simultanea di EPS e batteri. La seconda fase della procedura consiste nel raccogliere i dati grezzi dai biosaggi. Il terzo passo consiste nell'elaborare i dati grezzi utilizzando un software specifico, tra cui il duo stat di nuova concezione per l'analisi di colocalizzazione.

Il passaggio finale consiste nell'analizzare i dati di processo, incluso l'uso di software di data mining e organizzazione di microarray, visualizzatore di dati o MDV. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano come i patogeni orali modificano il loro trascrittoma e l'architettura dei biofilm in risposta a una dieta complessa, alle interazioni microbiche dell'ospite utilizzando il nostro esclusivo toolbox analitico integrato, che fornisce un'analisi del biofilm e un'interpretazione dei dati più complete. Ciao, mi chiamo Michelle Kuh, professoressa associata presso il centro di biologia forale qui all'Universal of Rochester Medical Center.

Oggi presentiamo una cassetta degli attrezzi analitica per l'analisi dei biofilm. Questo toolbox può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul biofilm, come ad esempio come le cellule del biofilm sono strutturate, disposte con la matrice extracellulare e come rispondono a complesse sfide ambientali a livello trascrittomico. Mi chiamo Jean, lei, sono una borsista post-dottorato nel laboratorio Dr.Ks.

Oggi mostrerò la parte di imaging della nostra cassetta degli attrezzi. Ciao, sono Aise Klein. Sono professore assistente di ricerca presso il laboratorio Dr.Ks.

Oggi presenterò il software MDV per l'analisi dei dati a microraggio. In questa procedura, i dischi idrossiappetito rivestiti di saliva vengono utilizzati come surrogati della superficie del dente su cui vengono coltivati i biofilm. Innanzitutto, aggiungere 2,8 millilitri di terreno di coltura inoculato con mutanti S in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti proteggendo la piastra dalla luce con il colorante LOR 6 47 coniugato con destrina in ciascun pozzetto fino a una concentrazione finale di un micromolare e pipettare su e giù più volte per mescolare il colorante nel terreno di coltura.

Successivamente, utilizzando una pinza sterile, lavare due volte i dischi sterili di idrossiapatite rivestiti di saliva in tampone AB sterile per rimuovere la saliva in eccesso o i componenti salivari non legati. Quindi posizionare i dischi verticalmente nel terreno di coltura integrato con colorante, assicurandosi che ogni disco sia completamente sommerso. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubarla a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica per 20 ore per consentire la formazione dei biofilm e l'incorporazione della consistenza coniugata negli esopolisaccaridi prodotti dalle cellule batteriche.

Per etichettare prima le cellule batteriche, preparare una piastra a 24 pozzetti con 2,8 millilitri di acqua milli Q sterile per pozzetto. Aggiungere 1,5 microlitri di colorante cyto nine a ciascun pozzetto fino a una concentrazione finale di un micromolare e proteggere la piastra dalla luce. Una volta formato il biofilm, rimuovere la piastra contenente i dischi dall'immersione dell'incubatrice.

Lavare ogni disco in una soluzione di cloruro di sodio allo 0,89%. Quindi trasferirli nella nuova piastra contenente il colorante cyto nine. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubarla per 30 minuti a temperatura ambiente.

Una volta che le cellule sono state colorate, lavare i biofilm e il cloruro di sodio come prima. Quindi, utilizzando una pinza, rilasciare i biofilm dal filo in una piastra di Petri contenente cloruro di sodio. Avvolgere la capsula di Petri con un foglio di alluminio.

I biofilm sono ora pronti per la visualizzazione mediante microscopia confocale utilizzando un microscopio confocale a scansione laser. Scansiona ogni biofilm da cinque a 10 posizioni selezionate casualmente e genera serie Z in ogni posizione. Per consentire le ricostruzioni 3D, aprire le immagini confocali ed elaborarle utilizzando un software a specchio.

Questo rendering tridimensionale di immagini confocali prodotte utilizzando il programma, Amira mostra un biofilm di mutanti S formato sulla superficie apatica utilizzando la procedura dimostrata. Le cellule batteriche e le microcolonie sono visibili in verde e sono incorporate nella matrice del biofilm contenente esopolisaccaridi. In rosso, è possibile generare una vista ravvicinata di un'area selezionata, che illustra la relazione strutturale specifica dell'EPS dei batteri su scala micrometrica.

Utilizzare il programma duos stat per quantificare la quantità di colocalizzazione di componenti separati del biofilm come i batteri e gli esopolisaccaridi. Innanzitutto, imposta il percorso del duo stat di nuova concezione in MATLAB versione 5.1 e apri le cartelle di immagini contenenti le immagini della serie Z dei due componenti del biofilm. Quindi, scegli due canali che verranno correlati e analizzati.

Le due pile di immagini devono avere dimensioni in pixel identiche in tutte le dimensioni e lo stesso numero di immagini in ciascuna pila. Impostare le soglie per ciascun canale e seguire le istruzioni nell'interfaccia del software e inserire i dati nel file di elaborazione dati per l'analisi. Questa figura mostra come duo stack interpreta quantitativamente la relazione spaziale tra batteri e DBS.

All'interno del biofilm, Duo stack calcola la distribuzione verticale dei batteri e del DPS dalla superficie del disco alla fase fluida, come si vede qui nella linea verde per i batteri e nella linea rossa per l'EPS. Calcola anche la colocalizzazione di batteri e DPS attraverso lo spessore del biofilm. Come mostrato nella linea gialla, i dati mostrano proporzioni più elevate di EPS rispetto ai batteri in tutta la profondità del biofilm e la maggior parte delle cellule batteriche sono associate all'EPS, in particolare dagli strati intermedi e verso l'alto Duo stat con rendering 3D fornisce una migliore comprensione dell'organizzazione strutturale e dell'interazione di batteri e DPS nei biofilm.

Al fine di garantire che l'RNA di alta qualità sia ottenuto dai biofilm, si raccomanda che l'estrazione dell'RNA venga eseguita secondo il protocollo specifico del biofilm descritto nell'articolo di Curian KU pubblicato nel 2007. Nella rivista, i protocolli standard di biochimica analitica vengono utilizzati per la preparazione di microarray CD NA e per i saggi quantitativi di PCR in tempo reale. Al fine di facilitare l'analisi dei grandi set di dati generati dagli esperimenti di microarray, abbiamo progettato un software di data mining e organizzazione, il visualizzatore di dati di microarray o MDV, disponibile online all'indirizzo www.oralgen.anl.gov.

Prima di inviare i dati a MDV, eseguire analisi statistiche come un test T accoppiato con un modello di varianza casuale utilizzando il software BRB array tool disponibile online con un valore P di cutoff di 0,001 per il confronto delle classi. In questo esempio di analisi del montone, sono stati eseguiti biofilm cresciuti in tre distinte concentrazioni di zucchero e quattro punti temporali. Sono stati eseguiti confronti accoppiati originando tre file BRB: condizione a 0,5% di saccarosio più 1% di amido contro 1%, condizione B 0,5% di saccarosio più 1% di amido contro 0,5% di saccarosio e condizione C 0,5% di saccarosio contro 1% di saccarosio.

Questo pannello rappresenta il numero di geni rilevati come espresso in modo differenziale in ciascuna condizione e punto temporale valutato mediante il confronto di classi standard utilizzando lo strumento di array BRB, che si traduce in un gran numero di geni denominati dati grezzi BRB. Per la dimostrazione di MDV, ci concentreremo sul punto temporale 30 ore utilizzando Excel. Converti i dati grezzi BRB in file di testo limitati alla scheda MDV.

Assicurati di rimuovere tutte le lettere che vengono con il numero della scheda del locus del gene, ad esempio nel nome SMU dot 1432 C.Elimina la lettera C, apri MDV. Apri il menu file e scegli Seleziona origine annotazione. Selezionare l'opzione file flat quando viene visualizzata una finestra di dialogo.

Utilizzare i pulsanti Sfoglia per scegliere i file che contengono annotazioni per il numero di ontologia genetica, il percorso, i dati di classificazione funzionale e il nome del gene. Vai su file e importa ciascuno dei file convertiti nel formato MDV. Ogni file rappresenta una condizione sperimentale.

Confronta i geni espressi in ciascuna condizione sperimentale A rispetto a B rispetto a C.In questo esempio, utilizzando la funzione del diagramma di Venn. Per questa dimostrazione, ci concentriamo su geni differenzialmente espressi che sono correlati in modo univoco alle influenze di saccarosio e amido in combinazione. La funzione basata sul diagramma di Venn viene utilizzata per visualizzare il numero di geni unici e condivisi espressi in queste diverse condizioni e ci aiuta a identificare quelli da selezionare per ulteriori analisi.

Qui selezioniamo solo i geni espressi in modo differenziale che sono unici nella condizione A e/o B, ma non quelli rilevati in C come mostrato in grigio come mostrato qui. MDV ha ridotto notevolmente il numero totale di geni da analizzare, e allo stesso tempo ha filtrato i geni non rilevanti per il caso sperimentale. Dal menu File, scegli l'opzione di esportazione per salvare i dati.

Come file a schede limitate, i file possono quindi essere aperti in Excel, dove l'output dei dati può essere organizzato e convertito nelle visualizzazioni grafiche desiderate. L'organizzazione dei dati in Excel consente la visualizzazione grafica dell'output MDV. Questo grafico mostra una panoramica dell'espressione differenziale di sottoinsiemi funzionali unici di geni che sono influenzati dalla combinazione di amido e saccarosio in fasi distinte dello sviluppo del biofilm.

Le influenze sul trascrittoma dei mutanti S sono più pronunciate a 30 ore di sviluppo del biofilm rispetto ad altri punti temporali. I risultati ci hanno aiutato a identificare con precisione specifici sottoinsiemi funzionali di geni che sono rilevanti per la nostra ipotesi di lavoro, considerando gli effetti temporali che hanno facilitato la selezione genica e l'ulteriore processo di convalida. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti anche metodi biochimici e proteomici per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali sono le risposte fisiologiche e metaboliche specifiche degli organismi all'interno dei biofilm.

Un'analisi così completa e integrata aiuterebbe sicuramente a comprendere ulteriormente come i biofilm modulano la patogenicità nelle cavità indoor, un ambiente altamente dinamico e complesso. Per maggiori dettagli, consulta il file PDF allegato a questo articolo video.