Isolamento di mouse cellule epiteliali delle vie respiratorie ed esposizione al fumo di sigaretta Sperimentale interfaccia Air Liquid

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule epiteliali delle vie aeree al fine di studiare gli effetti tossici dell'esposizione al fumo di sigaretta. Questo viene ottenuto dapprima dissezionando le trachee di topo e successivamente digerendo le trachee in soluzione di pronasi. Il secondo passaggio della procedura consiste nel raccogliere le cellule epiteliali e propagare la coltura in sospensione.

Il terzo passaggio consiste nel differenziare le colture a un'interfaccia aria-liquido. L'ultimo passaggio della procedura è esporre le cellule epiteliali al fumo di sigaretta apicale all'interfaccia aria-liquido. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano un monocstrato completamente differenziato di cellule epiteliali mediante microscopia a fluorescenza immunologica.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della malattia polmonare ostruttiva cronica, come gli effetti dell'esposizione al fumo di sigaretta sulla morfologia delle CLIA e sui marcatori biochimici indotti dal fumo di sigaretta di danno cellulare. Iniziare i preparativi per questa procedura un giorno prima della dissezione preparando i mezzi hams. Mezzi F 12 contenenti antibiotici, mezzi hams F 12 contenenti antibiotici e 20%F-B-S-M-T-E-C, mezzo basale contenente antibiotici.

Mezzo MTEC con 5% di FBS, una soluzione di acido retinoico e soluzioni stock di mezzo di proliferazione MTEC secondo le istruzioni riportate nel protocollo scritto. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici da utilizzare nella dissezione nel giorno della dissezione. Assicurarsi che l'area di dissezione sia pulita e che tutti gli strumenti di dissezione siano a portata di mano.

Sterilizzare la cappa a flusso laminare. Quindi, lavorare nella cappa a flusso laminare. Preparare una soluzione di pronasi allo 0,15%.

Aggiungere 15 milligrammi di pronasi a 10 millilitri di mezzo Hams F12 contenente antibiotici in un tubo conico da 50 millilitri. Mantenere sul ghiaccio fino all'uso.

Le trachee di topo vengono dissezionate dai topi utilizzando procedure chirurgiche standard; disinfettare il tubo contenente le trachee e posizionarlo nell'incubatrice per colture cellulari. Trasferire il tessuto tracheale in una piastra di Petri da 100 millimetri con mezzo Ham's F12 contenente antibiotici. Utilizzare pinze chirurgiche sterili per rimuovere il tessuto connettivo dalle trachee.

Quindi trasferire le trachee pulite nella seconda piastra di Petri da 100 millimetri contenente mezzo Ham's F12 con antibiotici. Utilizzare forbici da dissezione per tagliare le trachee lungo l'asse verticale ed esporre il lume.

Trasferire le trachee nel tubo conico da 50 millilitri contenente 10 millilitri di soluzione di Pronase e collocare in frigorifero per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. Infine, preparare le piastre Transwell trattate con collagene tipo uno per l'uso. Il giorno seguente, aggiungere 50 milligrammi di collagene, uno per millilitro di acido acetico 0,02 N, e pipettare un millilitro di questa soluzione in ciascun pozzetto di una piastra da 12.

Piastra a pozzetti ben tras. Avvolgere la piastra con pellicola trasparente e lasciare in posa durante la notte a temperatura ambiente nell'incubatrice per colture cellulari. Il giorno successivo.

Rovesciare delicatamente il tubo contenente le trachee di topo da 10 a 12 volte. Lasciare quindi incubare il contenuto del tubo per ulteriori 30-60 minuti a quattro gradi Celsius. Nella cappa a flusso laminare, pipettare 10 millilitri di mezzo Hams F12 contenente antibiotici e 20% FBS nel tubo conico contenente il tessuto tracheale digerito e rovesciare il tubo 12 volte.

Quindi pipettare 10 millilitri di terreno Hams F12 contenente antibiotici in FBS al 20% in ciascuna delle tre provette coniche da 15 millilitri. Utilizzare una pipetta sterile per trasferire il tessuto tracheale dalla soluzione di pronasi alla prima delle provette contenente il terreno Hams F12 integrato.

Posizionare la soluzione di pronasi sul ghiaccio, chiudere il tubo contenente il tessuto tracheale e capovolgerlo delicatamente 12 volte per mescolare. Successivamente, utilizzando la pipetta Pasteur, trasferire il tessuto tracheale nel secondo tubo conico da 15 millilitri e capovolgere questo tubo 12 volte. Ripetere la procedura di trasferimento e capovolgimento utilizzando l'ultimo tubo conico da 15 millilitri.

Infine, utilizzare la pipetta per pasta per rimuovere e scartare il tessuto tracheale. Successivamente, recuperare la soluzione di pronasi dal ghiaccio e combinare i tre volumi da 15 millilitri di mezzo Hams F12 integrato con la soluzione di pronasi. Centrifugare il campione nella centrifuga refrigerata a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 1.400 giri al minuto; al termine della centrifugazione, scartare il sopernatante, quindi pipettare circa da 100 a 200 microlitri di soluzione DNAse I, una soluzione per trachea, sul pellet e risospendere.

Sospendere con leggeri colpetti. Incubare le cellule sul ghiaccio per cinque minuti. Centrifugare il tubo a 1.400 giri al minuto per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il soprannatante.

Quindi pipettare otto millilitri di mezzo MTEC contenente FBS al 10% sul pellet e risospendere la piastra. Incubare la sospensione cellulare su una piastra paria a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di 95% aria e 5% anidride carbonica per cinque-sei ore. Questo è un passaggio di selezione negativa per la rimozione dei fibroblasti.

Dopo l'incubazione, raccogliere la sospensione cellulare dalla piastra e trasferirla con una pipetta in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi risciacquare la piastra due volte con quattro millilitri di mezzo MTEC contenente il 10% di FBS. Trasferire entrambi i lavaggi nel tubo conico da 50 millilitri contenente la sospensione cellulare.

Trasferire con pipetta un millilitro della sospensione cellulare in un tubo einor. Conservare questo aliquota per l'analisi mediante citocentrifuga e il conteggio cellulare. Centrifugare il tubo conico da 50 millilitri contenente i rimanenti 15 millilitri di sospensione cellulare a 1.400 giri al minuto a 4 gradi Celsius per 10 minuti.

Durante la centrifugazione, rimuovere e scartare la soluzione di collagene dalla piastra transwell precedentemente preparata. Lasciare asciugare la piastra sotto la cappa per cinque minuti, quindi lavare due volte con PBS dopo l'ultimo lavaggio. Aspirare tutto il PBS e pipettare 1,5 millilitri di mezzo di proliferazione nel compartimento basale del transwell dopo la centrifugazione.

Eliminare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in un volume appropriato di mezzo di proliferazione per facilitare la semina di 7,5 × 10⁴ fino a 1 × 10⁵ cellule in 500 microlitri di sospensione per pozzetto. Pipettare 500 microlitri di sospensione cellulare sulla superficie apicale dell'inserto con membrana di policarbonato transwell. Incubare le colture MTEC immerse a 37 °C in un incubatore umidificato contenente 95% di aria e 5% di anidride carbonica per sette-dieci giorni, con cambi del mezzo ogni due giorni.

Misurare la resistenza transepiteliale utilizzando un intervallo metro. Quando la resistenza epiteliale raggiunge 1000 ohm per centimetro quadrato e le colture appaiono confluenti, passare a una coltura LI rimuovendo il mezzo apicale.

Sostituire anche il mezzo basale con il mezzo basale MTEC contenente siero nuovo al 2% e acido retinoico. Incubare le colture a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 10-14 giorni per consentire la differenziazione, con cambi del mezzo ogni due giorni. Per prima cosa, configurare la macchina per il fumo seguendo le istruzioni del produttore.

Registrare il peso di un filtro polifless nuovo. Quindi posizionare il filtro nel supporto in acciaio inossidabile in linea sul tubo di campionamento che va dal portello di campionamento della camera di fumatura alla pompa a flusso costante. Collegare l'unità di campionamento al misuratore di gas utilizzando un tubo di effluente con un sistema di esposizione a cella CS.

Esponi il lato apicale delle colture transworld al fumo di sigaretta convenzionale proveniente da tre sigarette di riferimento per la ricerca con filtro R4F. Esporre le cellule al fumo di una o due sigarette. Esporre le colture di controllo all'aria ambiente per un periodo di esposizione equivalente dopo l'acquisizione del campione gassoso e l'aumento di peso.

Il filtro pool flex viene normalizzato rispetto al materiale totale depositato sul filtro in milligrammi. Per il volume totale di aria campionata, il fumo di una o due sigarette produce tipicamente da 100 a 200 milligrammi per metro cubo di materiale particolato totale (TPM). Dopo l'esposizione alla sigaretta, raccogliere le cellule e il mezzo basale per ulteriori analisi.

Questo è un esempio di un monostrato sano di cellule epiteliali respiratorie di topo colorate per il marcatore nucleare delle cellule epiteliali e per i marcatori C. Un isolamento, proliferazione e differenziamento epiteliale di successo richiede un monostrato integro con una morfologia a selciato. Le colture sono essenzialmente prive di fibroblasti.

Queste immagini al microscopio elettronico sono rappresentative di colture sane di MTEC e mostrano l'ultrastruttura dei vari tipi cellulari e la morfologia delle CILIA. Questo video di imaging su cellule vive mostra la morfologia sana delle CILIA in colture MTEC. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare cellule epiteliali tracheali di topo, differenziarle in un'interfaccia aria-liquido ed esporle al fumo principale di sigaretta.