Name: Una strategia per identificare le mutazioni de novo nei disturbi comuni come autismo e schizofrenia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Scopri una strategia computazionale per identificare mutazioni de novo in disturbi comuni come autismo e schizofrenia utilizzando sequenziamento dell'esoma e strumenti bioinformatici.

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Ringraziamo le nostre fonti di finanziamento Genome Canada e Québec Genoma, e Université de Montréal, nonché i finanziamenti dalla Fondazione canadese per l&#39;innovazione per il finanziamento nostro &#39;Synapse di malattia&#39; (S2D) del progetto.

1. Selezione di malattia che può essere causata da mutazioni de novo Una malattia che corrisponde ai seguenti criteri può andare bene con la mutazione de novo ipotesi: <ol><li> Il fitness riproduttiva è ridotta. </li><li> La frequenza della malattia è relativamente elevata e costante, nonostante le più diverse ambienti. </li><li> La malattia è associata con un'età superiore paterna. </li><li> Il legame classica e studi di associazione non è riuscito a spiegare una frazione significativa della ereditarietà della malattia. </li><li> I dati di concordanza gemelli sostenere un modello ex novo. </li></ol> L'analisi del rischio che una malattia comune in cui mutazioni de novo può in parte spiegare la base genetica è un primo passo fondamentale. 2. Selezione dei casi e campioni di DNA Selezione dei campioni necessari è fondamentale per il successo della identificazione di mutazioni de novo. Per massimizzare la possibilità di trovare mutazioni de novo, si raccomanda quanto segue: <ol><li> Selezionare i casi con età precoce di insorgenza, fenotipo grave, con genitori non affetti, anziani padri e senza storia famiglia allargata della malattia. </li><li> Scegli pazienti il ​​cui DNA disponibili sono sufficienti per condurre lo studio. Particolarmente critica è la disponibilità di DNA da una fonte cellula primaria che non è stato sottoposto a coltura (ad esempio il DNA del sangue o DNA della saliva), </li><li> La disponibilità di entrambi i genitori del DNA è fondamentale al fine di determinare lo stato di trasmissione mutazione (ereditato vs de novo). Disponibilità di ulteriori coorti interessate e controlli normali è necessario per gli studi di convalida genetici una volta geni candidati sono identificati. </li><li> Stimare la dimensione del campione sulla base del tasso mutazioni, la quantità di geni per essere sottoposti a screening e la stima della frazione di casi che possono derivare da una mutazione de novo. </li></ol> 3. Gene risequenziamento; due approcci principali <ol><li> Un elevato throughput di sequenziamento di bassa qualità Questo approccio si basa su approcci candidato geni. <ol><li> Selezione dei geni candidati (s) Selezionare i geni miglior candidato sulla base di un sistema di punteggio che si basa su 6 criteri principali. Poi calcolare il totale che corrispondeva alla somma di tutti i punti attribuiti utilizzando i sei criteri elencati nella Tabella 1. Vedi l'esempio del nostro progetto in figura 1 selezionati e non selezionati distribuzione geni. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534table1.jpg" alt="Tabella 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabella 1"> Criteri Tabella 1. Utilizzati per la selezione gene candidato <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Grafico mostra la distribuzione dei geni selezionati e non selezionati per il sequenziamento del nostro progetto. Abbiamo ottenuto una distribuzione di geni classificati in base alle proprietà candidato da geni ordinamento in base al loro valore di punteggio. Per esempio, SHANK3 e NRXN1 geni, due geni che abbiamo scoperto la mutazione de novo, avevano un punteggio rispettivamente di 7 e 6 (il massimo è 12). </li><li> Primer di progettazione utilizzando il software attraverso Primers3 Exonprimer. Solo codifica regione e giunzione giunzione devono essere coperti anche un extra di 50 coppie di basi su ogni lato della esone. </li><li> Ottimizzare le condizioni di PCR per la scelta di Taq, volume di reazione, ecc </li><li> Ottimizzare tutti i frammenti di PCR </li><li> Amplifica 5 ng di DNA genomico estratto da campioni di sangue secondo le procedure standard </li><li> Prima di inviare per il sequenziamento, hanno il controllo di qualità dei vostri prodotti PCR caricando un gel di agarosio al 2%. Selezionato in modo casuale campioni. </li><li> Sequenza i prodotti di PCR su un analizzatore di DNA su un filo. Un frammento è considerato sequenziato con successo se l'analisi di oltre il 90% delle tracce è possibile. Questo è applicabile per uno screening su larga scala. </li><li> Varianti di rilevamento <ol><li> Utilizzare strumenti per la rilevazione e la genotipizzazione delle varianti genomiche come PolyPhred, Polyscan e Surveyor mutazione. Una combinazione di più di 2 strumenti di rilevazione è l'ideale. Per esempio, PolyPhred v.5 e PolyPhred v.6 con le impostazioni predefinite non rilevano le stesse variazioni. V.3 Polyscan ha un più alto tasso di mutazione falsi positivi per SNP (96%) e meno per il indel (93%). PolyPhred v.6 non ha rilevato la maggioranza delle indel vero, ma hanno un tasso di falsi positivi mutazione (per indel) inferiore Polyscan complessivo v.3 (90%). Dobbiamo rimuovere l'opzione di rilevamento SNPs per v.3 Polyscan e mantenere entrambi PolyPhred v.5 e PolyPhred v.6 per il rilevamento di variante. Geometra mutazione e Polyscan sono migliori per la rilevazione indel. Nota: l'opzione di rilevamento SNP non dovrebbero essere applicate per l'uso Polyscan. Solo l'opzione "Indel" dovrebbe essere accesa. Polyscan generato a molti falsi positivi per la rilevazione di SNP. </li><li> Per ogni uniche varianti exonic romanzo rilevato, confermare manualmente reamplifying il frammento e resequteleconferenza del probando ed entrambi i genitori con primer reverse e l'ora di eliminare qualsiasi artefatto tecnico. </li></ol></li></ol></li><li> Tutto exome sequenziamento Questo approccio è una sequenza ad alto rendimento mira la maggior parte delle regioni codificanti del genoma umano. Ora siamo attualmente usando questo nuovo approccio nel nostro laboratorio, accelerando l'individuazione di geni candidati potenziali. <ol><li> Ordina "SureSelect Umano Tutti Exon" intese a promuovere l'regione codificante di oltre 16.000 geni (50 MB del genoma) progettato da Agilent o qualsiasi altro prodotto simile da altri come Roche. Prima di ordinare il kit di cattura, le piattaforme di sequenziamento dovrebbe essere stabilire (Illumina vs solido). </li><li> La cattura secondo il protocollo Agilent </li><li> Sequenza del prodotto sul Vostro rispettivi disponibili piattaforma di nuova generazione </li><li> Rilevamento delle varianti dal sequenziamento tutto exome: Diversi strumenti bioinformatici per la rilevazione e la genotipizzazione delle varianti genomiche dalla prossima generazione della piattaforma di sequenziamento sono disponibili come BWA, Bfast, Bioscope che eseguirà l'allineamento. Dopo di che strumenti aggiuntivi liberamente disponibili a valle (ad esempio strumenti SAM, Varscan, Annovar) sarebbero necessari per chiamare e annotare le varianti. Software commerciale che incorpora allineamento di sequenza e la chiamata variante e annotazioni sono disponibili anche come, NextGEN (Softgenetics), CLC Bio, e altri </li></ol></li></ol> 4. Varianti genomiche priorità Varianti individuate sono poi la priorità per il follow up in base alla loro probabilità di essere de novo e deleteri per la funzione delle proteine ​​e mRNA e / o la struttura. La variante di follow-up priorità per il rilevamento della variante de novo dovrebbe essere come segue: <ol><li> Variazioni unica (osservata una volta in un caso singolo) </li><li> Variazioni non presenti nei genitori </li><li> Proteina tronca varianti: una sciocchezza, indel porta a frameshift e mutazioni di splicing. </li><li> Variazione missenso e silenziosa previsto per essere funzionalmente dirompenti (ad esempio, influenzare lo splicing). Usa Polyphen, SIFT e PANTHER per effetto previsione funzionali sulla proteina. </li></ol> Se si utilizza il sequenziamento intero exome, la selezione di geni candidati può essere usato come una strategia di varianti priorità per ulteriori studi. 5. Convalida genetica <ol><li> Resequence l'intero gene nei casi ulteriore paziente (per identificare altre mutazioni causali) e nei controlli. I campioni di controllo saranno utilizzati per valutare le frequenze alleliche di varianti priorità. Ogni gene contiene almeno due diverse mutazioni de novo deleterie (nonsense, splicing, mutazione, e previsto missenso dannose) si trovano in diversi pazienti (ma non nei campioni di controllo o banche dati pubbliche) dovrebbero essere altamente prioritario per gli studi di ulteriore validazione. Ciò include: 1) l'analisi per un difetto di splicing potenziale in linee cellulari linfoblastoidi derivate dal paziente. Nella nostra esperienza, la maggior parte dei geni resa RT-PCR prodotti da linee cellulari linfoblastoidi, 2) indagare alterati livelli di espressione delle proteine ​​da parte quantitativa Western blot di estratti proteici dalle linee linfoblastoidi e 3) verificare ulteriormente la mutazione / gene a livello funzionale in animale (c elegans, Zebrafish) e modelli linea cellulare come precedentemente fatto dal nostro gruppo (es: 5,6). </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: A seguito di questo protocollo, siamo stati in grado di identificare nuovi geni per la schizofrenia e l'autismo. Un esempio è la recente scoperta del gene SHANK3 (Figura 2). Due diverse mutazioni de novo in SHANK3 gene, una mutazione nonsense trovati in tre fratello affetto e una mutazione missense in una femmina affetta. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. (A) segregazione della mutazione nonsense R1117X in tre fratelli affetti di famiglia PED 419. Il probando è indicato dalla freccia. (B) segregazione della mutazione missense R536W nel probando, ma non lei non colpite fratello in PED 56.

<ol><li>Bassett, A. S., Bury, A., Hodgkinson, K. A., Honer, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+fitness+in+familial+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Reproductive fitness in familial schizophrenia.</a> Schizophr Res. 21, 151-160 (1996).</li>
<li>Jablensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizophrenia%3A+manifestations%2C+incidence+and+course+in+different+cultures.+A+World+Health+Organization+ten-country+study%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med+Monogr%22%5BJournal%5D)">Schizophrenia: manifestations, incidence and course in different cultures. A World Health Organization ten-country study.</a> Psychol Med Monogr. , Suppl 20. 1-97 (1992).</li>
<li>Malaspina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizophrenia+risk+and+paternal+age%3A+a+potential+role+for+de+novo+mutations+in+schizophrenia+vulnerability+genes%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Spectr%22%5BJournal%5D)">Schizophrenia risk and paternal age: a potential role for de novo mutations in schizophrenia vulnerability genes.</a> CNS Spectr. 7, 26-29 (2002).</li>
<li>DeLisi, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+scan+for+linkage+to+chromosomal+regions+in+382+sibling+pairs+with+schizophrenia+or+schizoaffective+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A genome-wide scan for linkage to chromosomal regions in 382 sibling pairs with schizophrenia or schizoaffective disorder.</a> Am J Psychiatry. 159, 803-812 (2002).</li>
<li>Gauthier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+SHANK3+Mutations+in+Patients+Ascertained+for+Schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">De Novo SHANK3 Mutations in Patients Ascertained for Schizophrenia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Piton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+calcium-related+gene+IL1RAPL1+are+associated+with+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the calcium-related gene IL1RAPL1 are associated with autism.</a> Hum Mol Genet. 17, 3965-3974 (2008).</li>
<li>Krawczak, M., Ball, E. V., Cooper, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neighboring-nucleotide+effects+on+the+rates+of+germ-line+single-base-pair+substitution+in+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Neighboring-nucleotide effects on the rates of germ-line single-base-pair substitution in human genes.</a> Am J Hum Genet. 63, 474-488 (1998).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La procedura descritta qui si propone di individuare specifiche malattie comuni che probabile risultato, in parte, da mutazioni de novo, e per dimostrare questa ipotesi. Mutazioni de novo sono un meccanismo ben definito per lo sviluppo di una serie di malattie, per esempio il cancro sindromi ereditarie, ma è stato poco esplorato in malattie comuni. Questo in parte la conseguenza le sfide tecniche coinvolte nella identificazione di mutazioni de novo, che richiede il sequenziamento di grandi quantità di DNA, che ha solo molto recentemente diventato conveniente con l&#39;avvento di sequenziamento di nuova generazione. Inoltre, il tasso di mutazione de novo negli esseri umani è stato, fino a poco tempo fa, solo una stima. Solo molto recentemente ci sono stati rapporti direttamente determinare il tasso di mutazione negli esseri umani. Prima di queste misure, era difficile prevedere la dimensione del campione necessaria per questo tipo di studio e di determinare se la mutazione osservata de novo tasso è superiore al tasso di base. Sequenziamento geni candidati contro il genoma? Poiché la maggior parte delle mutazioni malattia riportati sono missenso / mutazioni nonsenso e sono mutazioni sito di splice (secondo il sito web HGMD) la nostra strategia di screening dovrebbe identificare oltre il 68% delle mutazioni note. Vi è anche una chiara relazione tra la gravità della sostituzione di aminoacidi e la probabilità di un fenotipo clinico. Rispetto ad una sostituzione conservativa aminoacido, un cambiamento senza senso è 9,0 volte più probabilità di presentare clinicamente 7. Così, in questo momento geni candidati sequenziamento è la strategia più conveniente. Il successo della procedura descritta dipende da diversi passaggi critici, che sono descritte in dettaglio e illustrata con due esempi, l&#39;autismo e la schizofrenia. Ci sono molti trabocchetti che devono essere evitati, come ad esempio che la malattia di scegliere, che i pazienti a schermo, fonte di DNA, e dettagli su come identificare in modo efficace le mutazioni de novo. Forniamo un metodo più efficiente per la determinazione della frazione di casi di una malattia che deriva da tali mutazioni spontanee.

una strategia per identificare le mutazioni de novo nei disturbi comuni come autismo e schizofrenia

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Ci sono diverse linee di prove a sostegno del ruolo delle mutazioni de novo come un meccanismo per malattie comuni, come l&#39;autismo e la schizofrenia. In primo luogo, il tasso di mutazione de novo negli esseri umani è relativamente alto, in modo da nuove mutazioni sono generati ad una frequenza elevata nella popolazione. Tuttavia, mutazioni de novo, non sono state riportate nella maggior parte delle malattie comuni. Le mutazioni nei geni che porta a malattie gravi dove vi è una forte selezione negativa contro il fenotipo, come ad esempio letalità embrionale o nelle fasi ridotta capacità riproduttiva, non saranno trasmessi a più membri della famiglia, e quindi non verranno rilevati dalla mappatura genetica linkage o associazione studi. L&#39;osservazione di concordanza molto elevata nei gemelli monozigoti e concordanza molto basso in gemelli dizigoti inoltre sostiene con forza l&#39;ipotesi che una frazione significativa di casi possono derivare da nuove mutazioni. Tale è il caso di malattie come l&#39;autismo e la schizofrenia. In secondo luogo, nonostante la riduzione di fitness riproduttiva 1 e fattori ambientali estremamente variabili, l&#39;incidenza di alcune malattie è mantenuta in tutto il mondo ad un tasso relativamente alto e costante. Questo è il caso per l&#39;autismo e la schizofrenia, con un&#39;incidenza di circa l&#39;1% in tutto il mondo. Carico mutazionale può essere pensato come un equilibrio tra scelta a favore o contro una mutazione deleteria e la sua produzione da mutazione de novo. Abbassare i tassi di riproduzione costituiscono un fattore negativo di selezione che dovrebbe ridurre il numero degli alleli mutanti nella popolazione, in ultima analisi porta alla prevalenza della malattia è diminuita. Queste pressioni selettive tendono ad essere di diversa intensità in ambienti diversi. Tuttavia, questi disturbi mentali gravi sono stati mantenuti con una prevalenza costante relativamente alta nella popolazione di tutto il mondo attraverso una vasta gamma di culture e paesi, nonostante una forte selezione negativa contro di loro 2. Questo non è ciò che si potrebbe prevedere in malattie con ridotta capacità riproduttiva, a meno che non vi era un alto tasso di mutazione. Infine, gli effetti dell&#39;età paterna: vi è un aumento significativo del rischio della malattia con l&#39;aumento dell&#39;età paterna, che potrebbe derivare dalla crescita legate all&#39;età paterna a mutazioni de novo. Questo è il caso per l&#39;autismo e la schizofrenia 3. Il maschio-femmina rapporto tra tasso di mutazione è stimato in circa 4-6:1, presumibilmente a causa di un maggior numero di cellule germinali divisioni con l&#39;età nei maschi. Pertanto, si potrebbe prevedere che mutazioni de novo sarebbe più frequentemente vengono da maschi, soprattutto maschi più anziani 4. Un alto tasso di nuove mutazioni possono in parte spiegare perché studi genetici non sono ancora riusciti a identificare molti geni predisponenti alle malattie complessi di geni, come l&#39;autismo e la schizofrenia, e perché le malattie sono state identificate per solo il 3% dei geni nel genoma umano . Identificazione di mutazioni de novo come causa di una malattia che richiede un approccio mirato molecolare, che comprende i genitori lo studio e soggetti affetti. Il processo per determinare se la base genetica di una malattia può risultare in parte da mutazioni de novo e l&#39;approccio molecolare per stabilire questo collegamento saranno illustrate, con l&#39;autismo e la schizofrenia come esempi.

Strategia di genetica molecolare per la ricerca di mutazioni de novo che causano malattie comuni come l&#39;autismo e la schizofrenia.

Una strategia per identificare le mutazioni de novo nei disturbi comuni come autismo e schizofrenia

Esistono diverse prove a sostegno del ruolo delle mutazioni de novo come meccanismo alla base di disturbi comuni, quali l'autismo e la schizofrenia. In primo luogo, ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di riuscire a identificare mutazioni de novo nei disturbi genetici comuni. Una volta identificata una malattia che corrisponde all'ipotesi di mutazione de novo, vengono applicati criteri fondamentali per la selezione dei casi paziente da analizzare alla ricerca di mutazioni de novo. Successivamente, si utilizza un sequenziamento di alta qualità e bassa produttività oppure il sequenziamento dell'esoma completo per identificare tali mutazioni mediante questa strategia.Sono state riscontrate mutazioni de novo nel gene Shank3 in soggetti affetti da schizofrenia. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui meccanismi genetici alla base della schizofrenia e dell'autismo, può anche essere utilizzato per studiare altre patologie comuni come il ritardo mentale.Non tutte le malattie corrispondono al profilo delle malattie de novo. Pertanto, prima di descrivere il protocollo, queste sono le caratteristiche essenziali che una malattia deve possedere per essere considerata una malattia da mutazione de novo. I pazienti affetti mostrano una riduzione della fitness.La malattia si riscontra frequentemente in ambienti altamente variabili. La malattia è talvolta associata a un'età paterna avanzata. Studi classici di linkage e di associazione non riescono a spiegare una frazione significativa dell'ereditabilità della malattia.Infine, i dati sulla concordanza nei gemelli devono supportare un modello de novo. Successivamente, applicare criteri per selezionare campioni con elevata probabilità di possedere una mutazione de novo. La mutazione de novo si correla con esordio precoce, fenotipi gravi, genitori non affetti e padri di età avanzata privi di sintomi della malattia.La disponibilità di DNA può limitare la selezione dei campioni. A meno che non siano disponibili campioni sia dal paziente che dai genitori del paziente, non è possibile escludere la trasmissione. Inoltre, sono necessari anche ulteriori cohorti di soggetti affetti e soggetti normali per la validazione di un gene candidato identificato.Quando viene raccolto un numero sufficientemente elevato di candidati e controlli, procedere con la selezione analitica del candidato migliore. La selezione dei geni si basa su un sistema di punteggio. Ad esempio, questo insieme di criteri può essere utilizzato per assegnare un punteggio ai geni associati a malattie neurocognitive.Le malattie neurologiche come la sclerosi laterale amiotrofica, ad esempio, utilizzerebbero criteri molto diversi. Questi includono evidenze di implicazione sinaptica, localizzazione sinaptica, evidenze, espressione tessutale, dati sul modello di espressione, modello animale, cognizione, dati, argomenti derivanti dall'analisi genetica e dal coinvolgimento. Dopo aver applicato questi criteri, molti geni possono essere esclusi dallo studio a favore di candidati migliori.Dopo il sequenziamento, per i geni candidati si applica una combinazione di due o più strumenti di analisi delle sequenze, poiché di solito funzionano in modo diverso. Ad esempio, il tasso di mutazioni falsi positivi per gli SMP calcolato dal software polys scan, come mostrato in questo grafico, è più elevato rispetto a quello calcolato dal software poly Fred. Il software polys scan mostra anche un tasso di mutazioni più basso per gli indel rispetto a poly Fred.Come passaggio finale per ciascuna nuova variante esonica, eliminare gli artefatti tecnici confermandoli mediante PCR e risequenziamento. La regione di interesse viene amplificata a partire dal DNA estratto da campioni di sangue del paziente e di entrambi i genitori; eseguire questo passaggio sul DNA di sangue è importante poiché alcune mutazioni potrebbero derivare da artefatti causati dalla divisione di linee cellulari di linfoblasti coltivati. Un'alternativa efficace al sequenziamento di geni candidati selezionati consiste nell'utilizzare il sequenziamento ad alto rendimento per analizzare le regioni codificanti di 16.000 geni.Sono ora disponibili kit per preparare campioni per il sequenziamento dell'intero esoma da diverse aziende commerciali. Quando queste sequenze vengono restituite al laboratorio, esistono diversi strumenti di bioinformatica per la rilevazione e il genotipaggio delle variazioni genomiche tra cui scegliere. Prima di stabilire una gerarchia alle mutazioni all'interno dell'intero esoma, selezionare le varianti dai geni candidati ordinati come spiegato in precedenza.Per tutte le varianti, ciascuna deve essere prioritizzata in base a due criteri. In primo luogo, la variante deve essere unica e non presente né nei genitori né nei database pubblici s e p. In secondo luogo, si prevede che le varianti influenzino la funzione del gene in base alla loro posizione nella sequenza, provocando una troncatura o una modifica.Il rivestimento. Programmi come PolyPhen, SIFT e PANTHER possono effettuare queste previsioni per identificare altre mutazioni causative e verificare che le mutazioni identificate non siano presenti in individui sani; è necessario eseguire il sequenziamento dell'intero gene in ulteriori casi pazienti e in controlli. Qualsiasi gene che contenga almeno una mutazione *de novo* predetta come dannosa dovrebbe essere sottoposto a ulteriori validazioni. Le varianti confermate dagli studi possono essere caratterizzate funzionalmente mediante analisi dell'mRNA e/o delle proteine su linee cellulari o modelli animali portatori delle mutazioni.Queste analisi funzionali potrebbero essere eseguite su linee cellulari o modelli animali utilizzando l'approccio del gene canida ad alta qualità e bassa resa. Un gene con due diverse mutazioni *de novo* è stato identificato in pazienti affetti da schizofrenia. Una mutazione nonsense è stata riscontrata in tre fratelli colpiti.In questa famiglia, la mutazione ha determinato un segnale di terminazione prematuro al codone 1.117 del gene shank.Three. In una famiglia diversa, è stata riscontrata in una femmina affetta una mutazione nonsenso nello stesso gene. Questa mutazione provoca la sostituzione dell'arginina con il triptofano, un amminoacido molto diverso, al codone 536.Dopo aver visionato questo video e utilizzato i metodi descritti, dovresti essere in grado di valutare la tua malattia di interesse per verificare se le mutazioni Novo svolgono un ruolo oppure no.

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