Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

Questa procedura utilizza il Viro chip, un saggio microarray panvirale, per analizzare campioni clinici alla ricerca di virus noti e sconosciuti. In primo luogo, gli acidi nucleici vengono estratti dai campioni clinici. Successivamente, l'RNA estratto viene trascritto a ritroso utilizzando primer casuali.

Viene effettuata la sintesi del secondo filamento di CD NA e la libreria di CD NA viene amplificata mediante PCR casuale. Successivamente, il cd NA amplificato viene marcato con coloranti fluorescenti e ibridato su un microarray virale. L'ultimo passaggio consiste nello scansionare e analizzare il microarray.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la presenza o l'assenza di un virus o di diversi virus attraverso l'analisi del microarray su chip. Metodi di rilevamento a spettro ampio, come il microarray su chip virale, sono necessari nella microbiologia diagnostica poiché le sindromi cliniche comuni, come la polmonite, non sono specifiche per un singolo agente patogeno, e a causa della continua minaccia emergente di nuovi agenti patogeni virali, come il Coronavirus SARS e il virus dell'influenza H1N1 del 2009. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della microbiologia diagnostica, ad esempio quale percentuale di infezioni non diagnosticate in ambito clinico potrebbe essere causata da nuovi virus ancora non identificati. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una migliore diagnosi delle malattie cliniche acute in ambito ospedaliero, poiché stiamo testando contemporaneamente centinaia o migliaia di potenziali agenti patogeni.

L'idea per questo metodo è nata nel 2002, quando decidemmo di applicare la tecnologia appena sviluppata dei microarray, ideata nel laboratorio del dottor Joseph DeRisi presso l'UCSF, al rilevamento dei virus. Il nostro primo caso reale di test fu l'utilizzo del chip virale per identificare un nuovo coronavirus responsabile della SARS nel 2003. In questa dimostrazione, che illustra l'intero procedimento dalla A alla Z, un tecnico del mio laboratorio mostrerà l'utilizzo del saggio con chip virale su un campione di tampone nasale prelevato da una bambina per diagnosticare la causa della sua malattia respiratoria acuta. I campioni di tampone nasofaringeo vengono raccolti in contenitori sterili contenenti mezzo liquido di trasporto virale e conservati congelati in un congelatore a meno 80 gradi Celsius.

In una cappa di sicurezza biologica, lasciare scongelare il tubo contenente il campione e agitare brevemente il tampone nel mezzo prima di smaltire il tampone in un contenitore per rifiuti biologici. Quindi, aliquotare 200 microlitri del campione in un tubo da 1,5 millilitro. Far passare il campione attraverso un filtro spin da 0,22 micron per purificare le particelle virali e raccoglierlo in un nuovo tubo da 1,5 millilitro.

Successivamente, utilizzare il kit Turbo DNA di Ambien seguendo le istruzioni del produttore per degradare il DNA genomico dell'ospite e purificare l'acido nucleico virale protetto e incapsulato. Procedere quindi con l'estrazione dell'RNA, utilizzando il kit XMO ZR per l'estrazione dell'RNA virale o il kit virus di Qiagen ultrasound seguendo le istruzioni del produttore. Misurare la concentrazione dell'RNA estratto mediante uno spettrofotometro per acidi nucleici NanoDrop.

La concentrazione di RNA dovrebbe essere preferibilmente di almeno 10 nanogrammi per microlitro, ma può variare da campione a campione utilizzando un tubo da 200 microlitri a pareti sottili. Aggiungere un microlitro di primer A a una concentrazione di 40 PICA moli per microlitro a quattro microlitri di RNA estratto. Riscaldare il campione a 65 gradi Celsius per cinque minuti in un termociclatore, quindi lasciare raffreddare il tubo a temperatura ambiente per cinque minuti.

Successivamente, aggiungere cinque microlitri di una miscela master contenente due microlitri di tampone RT 5X, un microlitro di DNTP 12,5 millimolare, un microlitro di acqua, 0,5 microlitri di DTT 0,1 molare e 0,5 microlitri di superscript three, reverse transcriptase, in un termociclatore. Incubare il tubo a 42 gradi Celsius per 60 minuti. Quindi riscaldare il campione a 94 gradi Celsius per due minuti.

Per interrompere la reazione della trascrittasi inversa, portare a 10 gradi Celsius per due minuti e centrifugare brevemente per cinque secondi. Successivamente, aggiungere cinque microlitri di mix quease costituito da un microlitro di buffer quease 5x, 3,8 microlitri di acqua e 0,15 microlitri di enzima quease per la sintesi del secondo filamento. Aumentare la temperatura del termociclatore da 10 gradi Celsius a 37 gradi Celsius nell'arco di otto minuti.

Mantenere a 37 gradi Celsius per otto minuti. Successivamente riscaldare a 94 gradi Celsius per due minuti per inattivare la quease e portare a 10 gradi Celsius a questo punto. Se desiderato, conservare il campione contenente 15 microlitri di CDNA a meno 20 gradi Celsius.

Per prima cosa, aggiungere cinque microlitri di campione di CD NA a 45 microlitri di una miscela maestra composta da cinque microlitri di tampone PCR 10 volte, un microlitro di DNTP 12,5 millimolare, un microlitro di primer a 100 pomo per microlitro, B un microlitro di cleantech LA e 37 microlitri di acqua. Quindi eseguire il protocollo PCR come segue: 94 gradi Celsius per due minuti, seguiti da 25 cicli di 94 gradi Celsius per 30 secondi, 50 gradi Celsius per 45 secondi e 72 gradi Celsius per un minuto.

Quindi, un passaggio di estensione a 72 gradi Celsius per cinque minuti, seguito da un mantenimento a 10 gradi Celsius dopo la PCR. Verificare il prodotto della PCR su un gel di elettroforesi al 1,5% AOSE. Dovrebbe essere visibile una striscia compresa approssimativamente tra 200 e 1000 paia di basi.

Per incorporare il dNTP AAD, aggiungere cinque microlitri di prodotto PCR virale a 45 microlitri di una miscela madre composta da cinque microlitri di tampone PCR 10x, un microlitro di A-A-D-N-T-P 12,5 millimolare, un microlitro di primer B a 100 p di microlitro multiplo, un microlitro di ClinTech LA e 37 microlitri di acqua. Eseguire il protocollo PCR come segue: 94 gradi Celsius per due minuti, 15 cicli di 94 gradi Celsius per 30 secondi, 50 gradi Celsius per 45 secondi.

72 gradi Celsius per un minuto e un passo di estensione a 72 gradi Celsius per cinque minuti, quindi mantenere a 10 gradi Celsius. Successivamente, purificare il nuovo prodotto PCR utilizzando il kit DNA Clean and Concentrator-3 seguendo le istruzioni del produttore e risospendere in 10 microlitri di tampone di eluizione. Aggiungere un microlitro di bicarbonato uno molare e un microlitro di si tre ai 10 microlitri di prodotto PCR e incubare per un'ora al buio.

Successivamente, pulire nuovamente il campione etichettato con S utilizzando il kit DNA Clean and Concentrator-5 ed eluire in 12 microlitri di tampone di eluizione. Utilizzare 1,5 microlitri di campione per verificare la concentrazione di cDNA e la quantità di colorante incorporato mediante spettrofotometro NanoDrop in una provetta PCR a striscia: 1 microlitro di tampone di frammentazione 25×, 5 microlitri di tampone di bloccaggio 5×, 9,5 microlitri o la quantità necessaria per ottenere una concentrazione finale normalizzata di 10 picco o moli per microlitro del campione etichettato SI-3 e acqua fino a un volume totale di 25 microlitri. Quindi aggiungere 25 microlitri di tampone di ibridazione 2× GX e centrifugare brevemente per rimuovere le bolle d'aria.

Posizionare un nuovo vetrino con guarnizione nella camera di ibridazione. Caricare 40 microlitri del campione sul vetrino con guarnizione. Successivamente, posizionare l'array virale stampato da Agilent con il lato contrassegnato Agilent rivolto verso il basso sopra il vetrino con guarnizione e fissare saldamente la vite.

Posizionare la camera di ibridazione in un forno a 65 gradi Celsius e ibridare per tutta la notte utilizzando una rotazione lenta di 10 rotazioni al minuto per lavare le matrici. Riscaldare preventivamente il buffer due a 37 gradi Celsius durante il riscaldamento. Riempire un contenitore di plastica da 500 millilitri con circa 250 millilitri di buffer uno.

Rimuovere l'array dalla camera di ibridazione, immergere l'array e separarlo dallo slide della guarnizione. Trasferire l'array nel contenitore pulito e lavarlo nel buffer uno per un minuto. Successivamente, utilizzando un contenitore di plastica da 500 millilitri separato.

Lavare l'array nel buffer preriscaldato due per un minuto. Dopo il lavaggio, rimuovere lentamente l'array dal buffer due, avendo cura di evitare bolle d'aria.

Utilizzare un fazzoletto di carta kim per asportare l'umidità in eccesso, avendo cura di evitare di toccare direttamente il lato attivo dell'array. Infine, posizionare il vetrino nel portavetrino con il lato Agilent rivolto verso l'alto e inserirlo nello scanner dell'array. In questa procedura, utilizziamo uno scanner per microarray DNA Agilent da due micron.

Scansionare l'array etichettato SI tre a cinque micron o a due micron secondo il protocollo di scansione standard dello strumento. Analizzare i microarray viral chipp mediante analisi cluster o con il programma automatico di analisi RO chipp e unpredic. Utilizzando il microarray Viro Chipp, il virus dell'influenza H1N1 del 2009 viene facilmente rilevato nel campione di tampone nasale ottenuto da un bambino con sintomi simil-influenzali.

Inoltre, abbiamo dimostrato che il chip virale è in grado di identificare non solo virus respiratori, ma anche un'ampia gamma di virus provenienti da diversi tessuti e fluidi corporei. Alcuni esempi di rilevamento virale nel sangue intero e nel siero utilizzando il vichi sono mostrati qui. Si tratta di chiamate ere corrispondenti al microray del viro chip ottenuti da campioni di sangue, sangue intero o siero prelevati da quattro pazienti; per ciascun campione, sono mostrate le prime due previsioni virali, con la previsione principale caratterizzata dal valore P più basso.

Ad esempio, nel campione evidenziato in blu chiaro, la previsione principale per quel campione è il virus del dengue di tipo uno. Mentre la seconda previsione in ordine di importanza è il virus del dengue di tipo due, il virus effettivamente presente in quel campione di sangue intero è stato confermato essere il virus del dengue di tipo uno, in accordo con i risultati del dict. Un'altra applicazione del viro chip è nella scoperta di nuovi agenti patogeni.

Alcuni esempi includono la scoperta del coronavirus SARS X-M-R-V-A, del retrovirus OME associato al cancro alla prostata e alla sindrome da affaticamento cronico negli esseri umani e dell'HTCV, un nuovo cardio virus umano associato a infezioni respiratorie e diarrea nei bambini. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 12 ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di garantire la disponibilità di tutte le attrezzature e i reagenti necessari seguendo questa procedura.

Altri metodi, come l'amplificazione PCR specifica per virus e il sequenziamento profondo, possono essere eseguiti per confermare e approfondire insoliti profili di ibridazione su chip virale o risultati dello stesso che suggeriscano la presenza di un virus sconosciuto dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'oncologia per esplorare l'associazione tra nuovi virus e cancro, nei settori della difesa biologica e della microbiologia clinica per sviluppare saggi microscopici condensati per una rapida diagnosi di agenti patogeni, e nel campo della virologia per la caratterizzazione di nuovi virus e della loro associazione con malattie. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire tutti i passaggi del saggio con chip virale a micromatrici, un test di sorveglianza a spettro ampio per rilevare agenti patogeni virali in campioni clinici, partendo dall'estrazione degli acidi nucleici dai campioni clinici fino all'ibridazione e all'analisi sulla micromatrice.

Ricordare che il lavoro con campioni clinici è considerato a rischio biologico e l'estrazione degli acidi nucleici deve essere eseguita in laboratori classificati al livello di sicurezza biologica due o superiore.