Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

Questa procedura utilizza il chip Viro, un test di microarray virale pan per analizzare campioni clinici di virus noti e sconosciuti. I primi acidi nucleici vengono estratti da campioni clinici. Successivamente, l'RNA estratto viene trascritto al contrario utilizzando primer casuali.

Viene eseguita la sintesi del CD NA del secondo filamento e la libreria del CD NA viene amplificata con PCR casuale. Quindi il cd NA amplificato viene marcato con coloranti fluorescenti e ibridato in un microarray di chip virali. Il passaggio finale consiste nella scansione e nell'analisi del microarray.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la presenza o l'assenza di un virus o di più virus attraverso l'analisi del microarray di chip. I metodi di rilevamento ad ampio spettro come un microarray di chipp virale sono necessari nella microbiologia diagnostica perché le sindromi cliniche comuni come la polmonite non sono specifiche per alcun singolo agente patogeno e a causa della continua minaccia emergente di nuovi agenti patogeni virali come il coronavirus SARS e il nuovo virus dell'influenza H one N one del 2009, Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia diagnostica, Ad esempio, quale percentuale di infezioni non diagnosticate in ambito clinico può essere causata da nuovi virus non ancora identificati. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una migliore diagnosi della malattia clinica acuta in ospedale, perché stiamo testando centinaia o migliaia di potenziali agenti patogeni contemporaneamente.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta nel 2002, quando abbiamo deciso di applicare la nuova tecnologia di microarray, sperimentata nel laboratorio del Dr.Joseph DeRisi presso l'UCSF, al rilevamento dei virus. Il nostro primo caso di test nel mondo reale è stato l'utilizzo del chip virale per identificare un nuovo coronavirus responsabile della SARS nel 2003, dimostrando la procedura dall'inizio alla fine sarà un tecnico del mio laboratorio che dimostrerà l'uso del test del chip virale su un campione di tampone nasale di un bambino per diagnosticare la causa della sua malattia respiratoria acuta. I campioni di tampone nasofaringeo vengono raccolti in contenitori sterili contenenti trasporto virale, terreni liquidi e conservati congelati in un congelatore a meno 80 gradi Celsius.

In una cappa di biosicurezza, lasciare scongelare la provetta contenente il campione e mescolare brevemente il tampone nel terreno prima di smaltire il tampone in un cestino a rischio biologico. Quindi aliquotare 200 microlitri di campione in una provetta da 1,5 millilitri. Passare il campione attraverso un filtro rotante da 0,22 micron per purificare le particelle virali e in una nuova provetta da 1,5 millilitri.

Successivamente, utilizzare il kit Turbo DNA di Ambien secondo le istruzioni del produttore per degradare il DNA genomico dell'ospite e purificare l'acido nucleico virale incapsulato protetto. Segui questo con l'estrazione dell'RNA, utilizzando il kit di estrazione dell'RNA virale XMO ZR o il kit virale di Qiagen Ultrasound secondo le istruzioni del produttore. Misurare la concentrazione dell'RNA estratto utilizzando uno spettrofotometro per acidi nucleici NanoDrop.

concentrazione di RNA è preferibilmente di almeno 10 nanogrammi per microlitro, ma varierà da campione a campione utilizzando una provetta da 200 microlitri a parete sottile. Aggiungere un microlitro di primer A a una concentrazione di 40 moli di PICA per microlitro a quattro microlitri di RNA estratto. Riscaldare il campione a 65 gradi Celsius per cinque minuti in un termociclatore, quindi lasciare raffreddare la provetta a temperatura ambiente per cinque minuti.

Successivamente, aggiungere cinque microlitri di una miscela master contenente due microlitri di tampone RT cinque volte, un microlitro 12,5 millimolare, DNTP un microlitro di acqua 0,5 microlitri, 0,1 molare DTT e 0,5 microlitri di apice tre, trascrittasi inversa in un termociclatore. Incubare la provetta a 42 gradi Celsius per 60 minuti. Quindi riscaldare il campione a 94 gradi Celsius per due minuti.

Per interrompere la reazione della trascrittasi inversa, chiamare a 10 gradi Celsius per due minuti e centrifugare a impulsi per cinque secondi. Successivamente, aggiungere cinque microlitri di miscela di quease composta da un microlitro di tampone cinque volte, 3,8 microlitri di acqua e 0,15 microlitri di sintesi del secondo filamento. Aumentare il termociclatore da 10 gradi Celsius a 37 gradi Celsius in otto minuti.

Mantieni la temperatura a 37 gradi Celsius per otto minuti. Quindi riscaldare a 94 gradi Celsius per due minuti per inattivare la nausea e chiamare a 10 gradi Celsius a questo punto. Se lo si desidera, conservare il campione contenente 15 microlitri di CDNA a meno 20 gradi Celsius.

Innanzitutto, aggiungere cinque microlitri di campione CD NA a 45 microlitri di una miscela master composta da cinque microlitri di tampone PCR 10 volte, un microlitro 12,5 millimolare, DNTP un microlitro 100 pomo per microlitro primer, B un microlitro cleantech LA e 37 microlitri di acqua. Quindi eseguire il protocollo PCR come segue, 94 gradi Celsius per due minuti, seguiti da 25 cicli di 94 gradi Celsius per 30 secondi. 50 gradi Celsius per 45 secondi e 72 gradi Celsius per un minuto.

Poi un passo in ginocchio di 72 gradi Celsius per cinque minuti, seguito da una presa a 10 gradi Celsius dopo la PCR. Controllare il prodotto PCR e un gel per elettroforesi AOSE all'1,5%. Dovrebbe essere visualizzato uno striscio da circa 200 a 1000 paia di basi.

Per incorporare AAD DNTP, aggiungere cinque microlitri di prodotto PCR virale a 45 microlitri di una miscela master composta da cinque microlitri di tampone PCR 10 volte, un microlitro da 12,5 millimolari, A-A-D-N-T-P un microlitro da 100 p di primer multiplo da microlitri, B un microlitro ClinTech LA e 37 microlitri di acqua. Eseguire il protocollo PCR come segue, 94 gradi Celsius per due minuti, 15 cicli di 94 gradi Celsius per 30 secondi. 50 gradi Celsius per 45 secondi.

72 gradi Celsius per un minuto e un passo in ginocchio di 72 gradi Celsius per cinque minuti e mantenere la posizione a 10 gradi Celsius. Quindi pulire il nuovo prodotto PCR con il kit DNA clean e concentratore tre secondo le istruzioni del produttore e versare 10 microlitri di tampone di eluizione. Aggiungere un microlitro di un molare di bicarbonato e un microlitro si tre ai 10 microlitri di prodotto PCR e incubare per un'ora al buio.

Quindi, di nuovo, pulire il campione marcato S con il kit DNA clean e concentratore cinque ed eluire in 12 microlitri di tampone di eluizione. Utilizzare 1,5 microlitri di campione per controllare la concentrazione di CDNA e la quantità di colorante incorporato su uno spettrofotometro NanoDrop in una provetta a strisce PCR a un microlitro, 25 volte il tampone di frammentazione, cinque microlitri, cinque microlitri, cinque volte il tampone bloccante, 9,5 microlitri o la quantità necessaria per una concentrazione finale normalizzata di 10 picchi o moli per microlitro di campione marcato SI tre e acqua per un volume totale di 25 microlitri. Quindi aggiungere 25 microlitri di tampone di ibridazione GX due volte e girare brevemente per rimuovere le bolle.

Posizionare una nuova slitta della guarnizione nella camera di ibridazione. Caricare 40 microlitri di campione sul vetrino della guarnizione. Quindi, posizionare l'array virale stampato con Agilent con il lato contrassegnato con Agilent verso il basso sopra il vetrino della guarnizione e serrare saldamente la vite.

Posizionare la camera di ibridazione in un forno a 65 gradi Celsius e ibridare durante la notte utilizzando una rotazione lenta di 10 rotazioni al minuto per lavare gli array. Per prima cosa preriscaldare il tampone da due a 37 gradi Celsius durante il riscaldamento. Riempi un contenitore di plastica da 500 millilitri con circa 250 millilitri di tampone. Uno.

Rimuovere l'array dalla camera di ibridazione, immergere l'array e separarlo dal vetrino della guarnizione. Trasferire l'array nel contenitore pulito e lavarlo nel tampone uno per un minuto. Quindi utilizzando un contenitore di plastica separato da 500 millilitri.

Lavare l'array nel tampone due preriscaldato per un minuto. Dopo il lavaggio, rimuovere lentamente l'array dal buffer. Due, facendo attenzione a evitare bolle.

Usa una salvietta kim per eliminare l'umidità in eccesso facendo attenzione a evitare di toccare direttamente il lato attivo dell'array. Infine, posizionare il vetrino nel supporto per vetrini con il lato Agilent rivolto verso l'alto e inserirlo nello scanner array. In questa procedura, utilizziamo uno scanner di microarray di DNA da due micron Agilent.

Scansiona l'array marcato SI three a cinque micron o due micron secondo il protocollo di scansione standard dello strumento. Analizza i microarray di chipp virali mediante analisi cluster o il programma di analisi automatizzato RO chipp e senza predizioni. Utilizzando il microarray Viro Chipp 2009, il nuovo virus dell'influenza H one N one è prontamente rilevato nel campione di tampone nasale ottenuto da un bambino con malattia simil-influenzale.

Inoltre, abbiamo dimostrato che il chip virale è in grado di identificare non solo i virus respiratori, ma anche un'ampia gamma di virus provenienti da una varietà di tessuti e fluidi corporei diversi. Alcuni esempi di rilevamento di virus nel sangue intero e nel siero utilizzando il vichi come mostrato qui. Queste sono le chiamate che corrispondono alla microraggia del chip viro da campioni di sangue, sangue intero o siero prelevato da quattro pazienti per ciascun campione, le prime due previsioni del virus sono mostrate con la previsione del virus superiore che ha il valore P più basso.

Ad esempio, nel campione evidenziato in azzurro, la previsione principale per quel campione è il virus della dengue di tipo uno. Mentre la seconda previsione classificata è il virus della dengue di tipo due, il virus effettivo in quel campione di sangue intero è stato effettivamente confermato essere il virus della dengue di tipo uno in accordo con i risultati del dict. Un'altra applicazione del chip viro è la scoperta di nuovi agenti patogeni.

Alcuni esempi includono le scoperte del coronavirus SARS X-M-R-V-A, il retrovirus OME legato al cancro alla prostata e alla sindrome da stanchezza cronica nell'uomo e l'HTCV, un nuovo virus cardiaco umano associato a infezioni respiratorie e diarroiche nei bambini Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in 12 ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di garantire la disponibilità di tutte le attrezzature e i reagenti necessari dopo questa procedura.

Altri metodi, come l'amplificazione specifica della PCR virale e il sequenziamento profondo, possono essere eseguiti per confermare e seguire modelli di ibridazione di chip virali insoliti o risultati di chip virali che suggeriscono la presenza di un nuovo virus dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'oncologia per esplorare l'associazione di nuovi virus con il cancro nei campi della biodifesa e della microbiologia clinica per sviluppare micro test condensati per la diagnosi rapida dei patogeni e nel campo della virologia per la caratterizzazione di nuovi virus e la loro associazione con la malattia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire tutte le fasi del test a microraggi su chip virale, un test di sorveglianza ad ampio spettro per rilevare agenti patogeni virali in campioni clinici, dall'estrazione dell'acido nucleico, dai campioni clinici all'ibridazione e all'analisi dei microraggi.

Non dimenticare che lavorare con campioni clinici è considerato a rischio biologico e l'estrazione dell'acido nucleico deve essere eseguita in laboratori classificati con un livello di biosicurezza due o superiore.