Name: Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Impara l'assay Virochip per rilevare virus noti e nuovi in campioni clinici. Questo metodo di microarray pan-virale migliora la diagnosi di infezioni respiratorie acute e patogeni emergenti.

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Ringraziamo David Wang, Anatoly Urisman, Amy Kistler, Kael Fischer, Patrick Tang, e Alexander Greninger per lo sviluppo iniziale e l&#39;ottimizzazione del protocollo Virochip. Questo lavoro è supportato da un K08 NIH concessione e Abbott Discovery Award (per CC) e l&#39;Howard Hughes Medical Institute (a JLD).

I passi del saggio Virochip includono (1) l'estrazione degli acidi nucleici da campioni clinici, (2) trascrizione inversa di RNA estratto e 2 ° fili sintesi di cDNA, (3) amplificazione di cDNA a caso innescato, (3) Cy3 incorporazione colorante fluorescente (4), l'ibridazione dei materiali marcati al microarray Virochip, e (5) scansione e analisi (Figura 1). Il protocollo illustrato di seguito dimostrerà l'uso del test Virochip su un campione di tampone nasale da un bambino con una malattia simil-influenzale. Primer Sequenze Primer Una 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N 9) -3 ' Primer B-GTTTCCCAGTCACGATA 5'-3 ' 1. Estrazione acido nucleico <ol><li> Estrazione degli acidi nucleici da campioni clinici deve essere eseguita sotto livello di biosicurezza 2 (BSL-2) o più condizioni, in quanto questi campioni sono potenzialmente infetti. </li><li> Il campione tampone nasale viene trasportato in media tenendo virale. Aliquota 200 ml di campione in un tubo da microcentrifuga 1,5 ml Eppendorf. </li><li> Opzionale: passare campione attraverso un filtro a 0,22 micron (per purificare per particelle virali) </li><li> Opzionale: campione pretrattare con DNAsi (a degradare DNA genomico di accoglienza e per purificare protette, encapsidated nucleico virale) utilizzando il kit Turbo DNAsi (Ambion) secondo le istruzioni del costruttore </li><li> Estrarre l'esempio utilizzando il Zymo ZR Viral RNA Extraction Kit o kit Qiagen Virus Ultrasens secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 2. Trascrizione inversa e 2 ° filamento sintesi CDNA ("Round A") <ol><li> Aggiungere 1 uL 40 pmol / mL Primer A a 4 uL estratto RNA. Di calore a 65 ° C per 5 min in un termociclatore (ad esempio GeneAmp PCR System 9700) e poi lasciate raffreddare a temperatura ambiente x 5 min. </li><li> Aggiungere 5 ml di una master mix composto da 2 microlitri di buffer 5X RT, 1 microlitri 12,5 mm dNTP, 1 microlitri di acqua, 0,5 microlitri 0,1 M DTT, e 0,5 microlitri SSIII RT (Invitrogen). Incubare a 42 ° C x 60 minuti. </li><li> In un termociclatore programmabile, il calore a 94 ° C x 2 min (per interrompere la reazione della trascrittasi inversa), raffreddare a 10 ° C, centrifuga impulso, e poi aggiungere 5 microlitri Sequenase mix costituito da 1 tampone microlitri Sequenase 5X, 3,8 microlitri di acqua, e 0,15 Sequenase microlitri (USB Corporation). Per 2 ° filone sintesi, rampa di salita da 10 ° C a 37 ° C oltre 8 minuti, per 8 minuti, poi il calore a 94 ° C x 2 min (per inattivare Sequenase) e raffreddare a 10 ° C (in attesa). </li><li> Optional: Rd Un campione di cDNA possono essere conservati a questo punto a -20 ° C. </li></ol> 3. Amplificazione PCR di primer CDNA casuale ("Rotonda B") <ol><li> Aggiungere 5 uL di Rd Un campione a 45 ml di una master mix composto da 5 microlitri di buffer 10X PCR, 1 microlitri 12,5 mm dNTP, 1 ml 100 pmol / mL B primer, 1 ml KlenTaq LA (Sigma), e 37 microlitri di acqua. </li><li> Esegui Protocollo PCR come segue: 94 ° C, 2 min → (25 cicli di 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( attesa) </li><li> Controllare il campione Rd B su un 1,5% gel di agarosio. Uno striscio da circa 200 - 1000 bp dovrebbe essere visualizzate (Figura 2A) </li></ol> 4. Cy3 incorporazione colorante fluorescente <ol><li> Opzionale: un altro campione può essere etichettato con il colorante fluorescente Cy5 e ibridizzato al microarray stesso. </li><li> Per incorporare aa-dNTP, aggiungere 5 uL di campione Rd B a 45 uL di una master mix composto da 5 uL tampone 10X PCR, 1 uL 12,5 mm aa-dNTP (Invitrogen), 1 uL 100 pmol / uL Primer B, 1, 1 uL KlenTaq LA (Sigma), e 37 uL acqua. Esegui Protocollo PCR come segue: 94 ° C, 2 min → (15 cicli di 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( attesa) </li><li> Pulire il campione Rd C con il DNA Pulire e Concentratore-5 Kit (Zymo ricerca) secondo le istruzioni del produttore. Eluire in 10 L. </li><li> Aggiungere 1 uL di bicarbonato 1M (Sigma) e 1 uL Cy5 (GE Healthcare) per il campione C Rd. </li><li> Incubare x 1 ora al buio. </li><li> Pulire il campione Cy3-etichettato con il DNA Pulire e Concentratore-5 Kit (Zymo ricerca) secondo le istruzioni del produttore. Eluire in 12 microlitri. </li></ol> 5. Ibridazione di Virochip Microarray <ol><li> Optional: usare 1,5 microlitri per verificare la concentrazione cDNA e la quantità di colorante incorporato in uno spettrofotometro NanoDrop (per la normalizzazione dei campioni) </li><li> In un tubo striscia PCR aggiungere 1 microlitri frammentazione tampone 25X, 5 microlitri di buffer 5X blocco, 9,5 microlitri (o la quantità di normalizzare) di Cy3-etichettati campione, e l'acqua ad un volume totale di 25 microlitri (Agilent) </li><li> Aggiungere 25 ml di tampone 2X ibridazione Gex (Agilent). Spin down brevemente per rimuovere le bolle. </li><li> Carico massimo di 40 ml di campione sul vetrino guarnizione. </li><li> Luogo Agilent stampato Virochip array (Università di California, San Francisco / Agilent) (lato marcato "Agilent" verso il basso) sulla parte superiore della diapositiva guarnizione e fissare stringere. </li><li> Ibridare la notte in forno a 65 ° C, impostazione della velocità a 10 giri. </li><li> Per lavare gli array, preriscaldare tampone 2 (Agilent) a 37 ° C. Smontare guarnizioni scivolo / array subacquea panino in un tampone 1 (Agilent). Lavare in buffer di 1 x 1 min. Lavare in tampone preriscaldato 2 x 1 min. Rimuovere lentamente scivolare dal buffer 2, facendo attenzione ad evitare le bolle (uso kimwipe per favorire l'umidità in più facendo attenzione ad evitare di toccare direttamente lato attivo della matrice) </li><li> Luogo scivolare in supporto diapositive e inserire scanner array. </li></ol> 6. Virochip di scansione e analisi <ol><li> Scansione Cy3 marcato serie a 5 micron o 2 micron secondo il protocollo standard di scansione dello strumento (Figura 2B). </li><li> Analizzare microarray Virochip mediante ispezione visiva, cluster analysis, o il programma di analisi automatica Virochip, E-Predict 11. Da ciascuno di questi tre metodi, il virus dell'influenza sta prontamente rilevate nel campione tampone nasale (da un bambino con sindrome simil-influenzale) (Figura 2C) </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Quando il protocollo è fatto correttamente, uno striscio dovrebbe essere visto su elettroforesi su gel di agarosio dopo la fase di Rd B (Figura 2A). I microarray Virochip sulla piattaforma Agilent sarà difficile da analizzare visivamente (Figura 2B), ma se un virus è presente dovrebbe essere facilmente identificabili mediante ispezione visiva, cluster analysis, e / o E-Previsione (Figura 1C). I campioni possono essere addizionati con quantità determinata di acido nucleico da un virus conosciuto (ad esempio virus del mosaico del tabacco; batteriofago MS2) per servire come controllo positivo per il test. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Schematica del trattamento Virochip microarray e analisi. Estratta acidi nucleici da campioni clinici sono amplificati in modo casuale, etichettato con tinture fluorescenti e ibridato al microarray Virochip. Microarray sono state scansionate ad una risoluzione di 2 micron e analizzati utilizzando una varietà di strumenti di calcolo, tra cui E-prevedere. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Passi nel saggio Virochip Dopo l'amplificazione di PCR random, una macchia di 200 -. 1000 bp possono essere visualizzati mediante elettroforesi su gel (A) (B) Tre microarray Virochip su 8 array / vetrino vengono mostrati, con una piccola regione. di un microarray soffiato nella inserto nell'angolo in basso a destra. (C) di analisi automatizzata microarray virale con E-Prevedere rivelare la presenza del virus A nel campione clinico. Il punteggio di somiglianza elevata (s = 0,55) corrisponde ad un valore-p che è vicino a zero, rendendo questa una previsione estremamente significativa.

<ol><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+detection+and+genotyping+of+viral+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).</li>
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<li>Kistler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-viral+screening+of+respiratory+tract+infections+in+adults+with+and+without+asthma+reveals+unexpected+human+coronavirus+and+human+rhinovirus+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity.</a> J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).</li>
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<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Predict%3A+a+computational+strategy+for+species+identification+based+on+observed+DNA+microarray+hybridization+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns.</a> Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo Virochip come descritto qui è complessa e richiede un tecnico di ricerca meticolosa e competente. Concentrazioni dei reagenti corrette e le condizioni per la PCR, l&#39;etichettatura, e l&#39;ibridazione sono critici. Il protocollo Virochip può essere facilmente modificato per ospitare l&#39;analisi dei tessuti malati con l&#39;uso di un metodo di estrazione dei tessuti come TRIzol (Invitrogen) per l&#39;estrazione degli acidi nucleici. Sonde possono essere aggiunti o eliminati come necessario per ottenere lo spettro desiderato e l&#39;ampiezza di copertura, per esempio, sonde per la rilevazione di bersagli non virali come batteri e funghi possono essere progettati e ha aggiunto &quot;on-the-fly&quot;. Alcune applicazioni del test Virochip attualmente in fase di sviluppo includono ampio spettro diagnostica virale nel laboratorio clinico, focolaio, lo screening della purezza di farmaci e vaccini, e la scoperta di nuovi agenti patogeni virali.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente / materiale </th><th> Nome del reagente / materiale </th></tr><tr><td> Primera </td><td> 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9) -3 &#39; </td></tr><tr><td> Primer B </td><td> 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA-3 &#39; </td></tr><tr><td rowspan="5"> RT Master Mix (5 mL) </td><td> 2 microlitri di buffer RT 5X </td></tr><tr><td> 1 microlitri 12,5 mm dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 acqua microlitri </td></tr><tr><td> 0,5 microlitri 0.1M DTT </td></tr><tr><td> 0,5 microlitri SSIII RT (Invitrogen) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sequenase Mix (5 mL) </td><td> Buffer di 1 microlitri Sequenase 5X </td></tr><tr><td> 3,8 microlitri di acqua </td></tr><tr><td> 0,15 Sequenase microlitri (USB Corporation) </td></tr><tr><td rowspan="5"> Rd B PCR Master Mix (45 mL) </td><td> 5 microlitri di buffer PCR 10X </td></tr><tr><td> 1 microlitri 12,5 mm dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 ml 100 pmol / mL Primer B </td></tr><tr><td> 1 ml KlenTaq LA (Sigma) </td></tr><tr><td> 37 microlitri di acqua </td></tr><tr><td rowspan="5"> ° C PCR Master Mix (45 mL) </td><td> 5 uL Buffer PCR 10X </td></tr><tr><td> 1 microlitri 12,5 mm dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 ml 100 pmol / mL Primer B </td></tr><tr><td> 1 ml KlenTaq LA (Sigma) </td></tr><tr><td> 37 microlitri di acqua </td></tr><tr><td rowspan="4"> Ibridazione del buffer (25 mL) </td><td> Buffer di 1 microlitri frammentazione 25X (Agilent) </td></tr><tr><td> 5 microlitri di buffer 5X blocco (Agilent) </td></tr><tr><td> 9,5 microlitri (o la quantità di normalizzare) di Cy3 marcato campione </td></tr><tr><td> Aggiungere acqua al volume totale di 25 microlitri </td></tr><tr><td> Agilent Virochip microarray </td><td> in attesa di licenza, disponibile da Chiu laboratorio, UCSF </td></tr></tbody></table>

utilizzando un pan-virale assay microarray (virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

La diagnosi di cause virali di molte malattie infettive è difficile a causa della intrinseca diversità sequenza di virus così come l&#39;emergere continuo di nuovi agenti patogeni virali, come la SARS coronavirus e il 2009 pandemia di H1N1 virus dell&#39;influenza, che non sono rilevabili con i metodi tradizionali. Per affrontare queste sfide, abbiamo precedentemente sviluppato e validato un pan-virale piattaforma microarray chiamato Virochip con la capacità di rilevare tutti i virus conosciuti così come le varianti romanzo sulla base di omologia di sequenza conservati 1. Utilizzando il Virochip, abbiamo identificato l&#39;intero spettro dei virus associati con infezioni respiratorie, compresi i casi di inspiegabili malattia critica nei pazienti ospedalizzati, con una sensibilità pari o superiore a 05/02 convenzionali test clinici. Il Virochip è stato utilizzato anche per identificare nuovi virus, tra cui il coronavirus della SARS 6,7, un clade rinovirus romanzo 5, XMRV (un retrovirus collegato al cancro della prostata) 8, bornavirus aviaria (la causa di una malattia devastante in pappagalli) 9, e un cardiovirus romanzo in bambini con malattie respiratorie e diarrea 10. La versione attuale del Virochip è stato portato su una piattaforma microarray Agilent ed è costituito da ~ 36.000 sonde derivanti da più di ~ 1.500 virus in GenBank a partire dal dicembre del 2009. Qui mostriamo i passaggi necessari per l&#39;elaborazione di un saggio Virochip dall&#39;inizio alla fine (i tempi di consegna ~ 24 ore), tra cui l&#39;estrazione degli acidi nucleici del campione, amplificazione PCR con primer random, incorporazione colorante fluorescente, e l&#39;ibridazione microarray, scansione e analisi.

Il Virochip è un pan-virale microarray progettati per rilevare contemporaneamente tutti i virus conosciuti e nuovi virus sulla base di omologia di sequenza conservati. Qui mostriamo come eseguire un test Virochip per analizzare i campioni clinici per la presenza di virus noti e sconosciuti.

Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

La diagnosi delle cause virali di molte malattie infettive è difficile a causa della diversità di sequenza intrinseca dei virus, nonché della continua emersione...

Questa procedura utilizza il Viro chip, un saggio microarray panvirale, per analizzare campioni clinici alla ricerca di virus noti e sconosciuti. In primo luogo, gli acidi nucleici vengono estratti dai campioni clinici. Successivamente, l'RNA estratto viene retrotrascritto utilizzando primer random.Viene eseguita la sintesi del secondo filamento di CD NA e la libreria di CD NA viene amplificata mediante PCR casuale. Successivamente, il cd NA amplificato viene marcato con coloranti fluorescenti e ibridato su un microarray virale. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare e scansionare il microarray.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la presenza o l'assenza di un virus o di diversi virus attraverso l'analisi del microarray su chip. Metodi di rilevamento a spettro ampio, come il microarray virale su chip, sono necessari nella microbiologia diagnostica poiché le sindromi cliniche comuni, come la polmonite, non sono specifiche per un singolo agente patogeno, e a causa della continua minaccia emergente di nuovi agenti patogeni virali, come il Coronavirus SARS e il virus dell'influenza H1N1 del 2009. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della microbiologia diagnostica, ad esempio quale percentuale di infezioni non diagnosticate in ambito clinico potrebbe essere causata da nuovi virus ancora non identificati. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una migliore diagnosi delle malattie cliniche acute in ambito ospedaliero, poiché stiamo testando contemporaneamente centinaia o migliaia di potenziali agenti patogeni.L'idea iniziale di questo metodo risale al 2002, quando decidemmo di applicare la tecnologia appena sviluppata dei microarray, ideata nel laboratorio del dottor Joseph DeRisi presso l'UCSF, al rilevamento dei virus. Il nostro primo caso reale fu l'utilizzo del chip virale per identificare un nuovo coronavirus responsabile della SARS nel 2003. In questo video, una tecnica del mio laboratorio illustrerà l'intero procedimento, dalla A alla Z, dimostrando l'uso del saggio con chip virale su un campione di tampone nasale prelevato da una bambina per diagnosticare la causa della sua malattia respiratoria acuta. I campioni di tampone nasofaringeo vengono raccolti in contenitori sterili contenenti mezzo liquido di trasporto virale e conservati congelati in un congelatore a meno 80 gradi Celsius.In una cappa di sicurezza biologica, lasciare scongelare il tubo contenente il campione e agitare brevemente il tampone nel mezzo prima di smaltire il tampone in un contenitore per rifiuti biologici pericolosi. Quindi, aliquotare 200 microlitri del campione in un tubo da 1,5 millilitro. Far passare il campione attraverso un filtro spin da 0,22 micron per purificare le particelle virali e raccoglierlo in un nuovo tubo da 1,5 millilitro.Successivamente, utilizzare il kit Turbo DNA di Ambien seguendo le istruzioni del produttore per degradare il DNA genomico dell'ospite e purificare l'acido nucleico virale protetto e incapsulato. Procedere quindi con l'estrazione dell'RNA, utilizzando il kit di estrazione dell'RNA virale XMO ZR o il kit per virus di Qiagen ultrasound seguendo le istruzioni del produttore. Misurare la concentrazione dell'RNA estratto mediante uno spettrofotometro per acidi nucleici NanoDrop.La concentrazione di RNA dovrebbe essere preferibilmente di almeno 10 nanogrammi per microlitro, ma può variare da campione a campione utilizzando un tubo da 200 microlitri a pareti sottili. Aggiungere un microlitro del primer A a una concentrazione di 40 PICA moli per microlitro a quattro microlitri di RNA estratto. Riscaldare il campione a 65 gradi Celsius per cinque minuti in un termociclatore, quindi lasciare raffreddare il tubo a temperatura ambiente per cinque minuti.Successivamente, aggiungere cinque microlitri di una miscela madre contenente due microlitri di tampone RT 5X, un microlitro di dNTP 12,5 millimolare, un microlitro di acqua, 0,5 microlitri di DTT 0,1 molare e 0,5 microlitri di superscript three, retrotrascrittasi, in un termociclatore. Incubare il tubo a 42 gradi Celsius per 60 minuti. Successivamente, riscaldare il campione a 94 gradi Celsius per due minuti.Per interrompere la reazione della trascrittasi inversa, portare a 10 gradi Celsius per due minuti e centrifugare brevemente per cinque secondi. Successivamente, aggiungere cinque microlitri di mix quease costituito da un microlitro di buffer quease 5x, 3,8 microlitri di acqua e 0,15 microlitri di enzima quease per la sintesi del secondo filamento. Aumentare la temperatura del termociclatore da 10 gradi Celsius a 37 gradi Celsius nell'arco di otto minuti.Mantenere a 37 gradi Celsius per otto minuti. Successivamente riscaldare a 94 gradi Celsius per due minuti per inattivare la quease e portare a 10 gradi Celsius a questo punto. Se desiderato, conservare il campione contenente 15 microlitri di CDNA a meno 20 gradi Celsius.Per prima cosa, aggiungere cinque microlitri di campione di CD NA a 45 microlitri di una miscela maestra composta da cinque microlitri di tampone PCR 10x, un microlitro di DNTP 12,5 millimolare, un microlitro di primer a 100 pomo per microlitro, B, un microlitro di Cleantech LA e 37 microlitri di acqua. Quindi eseguire il protocollo PCR come segue: 94 gradi Celsius per due minuti, seguiti da 25 cicli di 94 gradi Celsius per 30 secondi, 50 gradi Celsius per 45 secondi e 72 gradi Celsius per un minuto.Quindi, un passaggio di estensione a 72 gradi Celsius per cinque minuti, seguito da un mantenimento a 10 gradi Celsius dopo la PCR. Verificare il prodotto della PCR su un gel di elettroforesi al 1,5% AOSE. Dovrebbe essere visibile una striscia compresa tra circa 200 e 1000 paia di basi.Per incorporare il dNTP AAD, aggiungere cinque microlitri di prodotto PCR virale a 45 microlitri di una miscela master composta da cinque microlitri di tampone PCR 10x, un microlitro di A-A-D-N-T-P 12,5 millimolare, un microlitro di primer B a 100 pM/µL, un microlitro di ClinTech LA e 37 microlitri di acqua. Eseguire il protocollo PCR come segue: 94 °C per due minuti, 15 cicli di 94 °C per 30 secondi, 50 °C per 45 secondi.72 gradi Celsius per un minuto e un passaggio di estensione a 72 gradi Celsius per cinque minuti, quindi mantenere a 10 gradi Celsius. Successivamente, purificare il nuovo prodotto PCR utilizzando il kit DNA Clean and Concentrator-3 seguendo le istruzioni del produttore e riportarlo in sospensione in 10 microlitri di tampone di eluizione. Aggiungere un microlitro di bicarbonato da un molare e un microlitro di si tre ai 10 microlitri di prodotto PCR e incubare per un'ora al buio.Successivamente, pulire nuovamente il campione etichettato con S utilizzando il kit DNA Clean and Concentrator-5 ed eluire in 12 microlitri di tampone di eluizione. Utilizzare 1,5 microlitri di campione per verificare la concentrazione di cDNA e la quantità di colorante incorporato mediante spettrofotometro NanoDrop in una provetta PCR strip: 1 microlitro di tampone di frammentazione 25x, 5 microlitri di tampone di bloccaggio 5x, 9,5 microlitri o la quantità necessaria per ottenere una concentrazione finale normalizzata di 10 picco o moli per microlitro del campione etichettato SI-3 e acqua fino a un volume totale di 25 microlitri. Quindi aggiungere 25 microlitri di tampone di ibridazione GX 2x e centrifugare brevemente per rimuovere le bolle d'aria.Posizionare un nuovo vetrino con guarnizione nella camera di ibridazione. Caricare 40 microlitri del campione sul vetrino con guarnizione. Successivamente, posizionare l'array virale stampato da Agilent con il lato contrassegnato Agilent rivolto verso il basso sopra il vetrino con guarnizione e fissare saldamente la vite.Posizionare la camera di ibridazione in un forno a 65 gradi Celsius e ibridare per tutta la notte utilizzando una rotazione lenta di 10 rotazioni al minuto per lavare le matrici. Prima riscaldare il buffer due a 37 gradi Celsius. Riempire un contenitore di plastica da 500 millilitri con circa 250 millilitri di buffer uno.Rimuovere l'array dalla camera di ibridazione, immergere l'array e separarlo dallo slide con guarnizione. Trasferire l'array nel contenitore pulito e lavarlo nel buffer uno per un minuto. Quindi utilizzando un contenitore di plastica da 500 millilitri separato.Lavare l'array nel tampone due preriscaldato per un minuto. Dopo il lavaggio, rimuovere lentamente l'array dal tampone due, avendo cura di evitare bolle d'aria.Utilizzare un fazzoletto di carta kim per asportare l'umidità in eccesso, avendo cura di evitare di toccare direttamente il lato attivo dell'array. Infine, posizionare il vetrino nel portavetrino con il lato Agilent rivolto verso l'alto e inserirlo nello scanner per array. In questa procedura, utilizziamo uno scanner per microarray DNA Agilent da due micron.Scansionare l'array etichettato SI tre a cinque micron o due micron seguendo il protocollo di scansione standard dello strumento. Analizzare i microarray viral chipp mediante analisi cluster o con il programma automatico di analisi RO chipp e unpredic. Utilizzando il microarray Viro Chipp, il virus dell'influenza H1N1 del 2009 viene facilmente rilevato nel campione di tampone nasale ottenuto da un bambino con sintomi simil-influenzali.Inoltre, abbiamo dimostrato che il chip virale è in grado di identificare non solo virus respiratori, ma anche un'ampia gamma di virus provenienti da diversi tessuti e fluidi corporei. Alcuni esempi di rilevamento virale nel sangue intero e nel siero utilizzando il vichi sono mostrati qui. Questi sono richiami corrispondenti al micromatrici del chip virale ottenuti da campioni di sangue, sangue intero o siero prelevati da quattro pazienti; per ciascun campione, sono mostrate le prime due previsioni virali, con la previsione principale caratterizzata dal valore P più basso.Ad esempio, nel campione evidenziato in blu chiaro, la previsione principale per quel campione è il virus del dengue di tipo uno. Mentre la seconda previsione in ordine di importanza è il virus del dengue di tipo due, il virus effettivo presente in quel campione di sangue intero è stato effettivamente confermato essere il virus del dengue di tipo uno, in accordo con i risultati di dict. Un'altra applicazione del viro chip è nella scoperta di nuovi agenti patogeni.Alcuni esempi includono la scoperta del coronavirus SARS X-M-R-V-A, del retrovirus OME associato al cancro alla prostata e alla sindrome da affaticamento cronico negli esseri umani e dell'HTCV, un nuovo cardio virus umano associato a infezioni respiratorie e diarrea nei bambini. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 12 ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di garantire la disponibilità di tutte le attrezzature e i reagenti necessari seguendo questa procedura.Altri metodi, come l'amplificazione PCR specifica per virus e il sequenziamento profondo, possono essere eseguiti per confermare e monitorare pattern insoliti di ibridazione su chip virale o risultati di chip virale che suggeriscono la presenza di un virus sconosciuto dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'oncologia per esplorare l'associazione tra nuovi virus e cancro, nei settori della difesa biologica e della microbiologia clinica per sviluppare saggi microscopici condensati per una rapida diagnosi di patogeni, e nel campo della virologia per la caratterizzazione di nuovi virus e della loro associazione con malattie. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire tutti i passaggi del saggio con chip virale a micromatrice, un test di sorveglianza a spettro ampio per rilevare patogeni virali in campioni clinici, partendo dall'estrazione degli acidi nucleici da campioni clinici fino all'ibridazione e all'analisi sulla micromatrice.Non dimenticare che lavorare con campioni clinici è considerato un rischio biologico e l'estrazione degli acidi nucleici deve essere eseguita in laboratori classificati al livello di sicurezza biologica due o superiore.

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