Dissezione e colorazione di Drosophila Larvali ovaie

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare ovaie isolate da larve di drosophila del terzo stadio tardivo al microscopio confocale. Ciò si ottiene selezionando prima le larve femminili da una popolazione sincronizzata. Il secondo passo della procedura consiste nel sezionare un corpo grasso intatto, separarlo dall'intestino e dalla cuticola e metterlo sul ghiaccio.

Il terzo passo della procedura è riparare la macchia e lavare il corpo grasso con le ovaie incorporate. La fase finale della procedura consiste nel separare le ovaie dal corpo grasso durante il montaggio. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la colorazione specifica della cellula attraverso la microscopia a immunofluorescenza.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché le dissezioni fini e il montaggio richiedono una grande quantità di pratica. Cinque giorni prima della dissezione, aggiungere il lievito a una fiala fresca da 25 millimetri di cibo per mosche. Metti da sette a 16 moscerini della frutta femmina accoppiati nella fiala.

Lasciare che le femmine depongano le uova per due o quattro ore o fino a quando non ci sono circa 30 uova per fiala. Incubare l'uovo contenente le fiale a 25 gradi Celsius con un minimo del 70% di umidità. Dopo cinque giorni, le larve hanno raggiunto la fine del terzo stadio.

Riempi una pirofila di vetro a nove pozzetti con il mezzo di suoneria. Successivamente, preparare stampi appositamente realizzati dotati di una rete di nylon nella capsula di Petri contenente suoneria. Medio. Mettere il piatto sul ghiaccio usando una pinza fine.

Raccogli da 10 a 15 larve dalle pareti della fiala e mettile nel piatto di dissezione. Posizionare il piatto di dissezione al microscopio per la selezione e la dissezione femminile. Le larve femminili possono essere distinte dai maschi per i loro pungoli.

I testicoli maschili sono facilmente identificabili come ovali grandi e chiari incorporati nel terzo posteriore del corpo adiposo. Le ovaie femminili situate nella stessa parte del corpo adiposo possono essere identificate come sfere rotonde molto più piccole e chiare. Se le ovaie non sono visibili, le larve femminili sono identificate dall'assenza di testicoli.

Trasferire una larva femmina in un pozzo pulito Per iniziare la dissezione, utilizzare una pinza per tenere le larve verso il basso appena dietro il cervello. Rimuovere la testa con un secondo paio di pinze. Posizionare la parte posteriore rimanente delle larve sul lato dorsale con la trachea rivolta verso il basso.

Tenere le larve per le sferiche posteriori con un paio di pinze. Quindi spingere lentamente la pinza verso l'interno allo stesso tempo, utilizzare l'altro paio di pinze per far scorrere la cuticola posteriormente fino a quando circa la metà del corpo adiposo larvale emerge saldamente. Tenere l'estremità posteriore della cuticola con un paio di pinze e tenere liberamente il resto della cuticola con l'altro paio delicatamente e tirare via lentamente l'estremità posteriore in modo che la cuticola e l'intestino attaccato scivolino attraverso la fessura.

Alla fine di questo processo, scollegare l'intestino e la cuticola dalla parte anteriore del corpo adiposo. Bagnare accuratamente una pipetta da pascolo con un terreno ringer da un pozzetto contenente larve sezionate. Utilizzare la pipetta per pascoli per trasferire il corpo adiposo nel mezzo di suoneria ghiacciato nel colino cellulare.

Il passo successivo consiste nel fissare e colorare il preparato al 5% di formaldeide nel terreno di ringer e incubare il corpo grasso per 20 minuti con una leggera agitazione su uno shaker orbitale. Se non diversamente specificato, tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente. Lavare il corpo grasso tre volte con l'1% di PBT, la prima volta per cinque minuti, la seconda volta per 10 minuti e la terza volta per 45 minuti.

Bloccare con 0,3% PBTB per un'ora con una leggera agitazione. Dopo l'agitazione. Trasferire il corpo grasso in un tubo da 0,2 millilitri.

Rimuovere il liquido in eccesso e aggiungere il primo anticorpo desiderato diluito in PBTB allo 0,3% e incubare per una notte a quattro gradi Celsius con una leggera agitazione su un rullo. Il giorno successivo, trasferisci il corpo grasso nello stampo. Successivamente, lavare il corpo grasso tre volte per 30 minuti ciascuna con 0,3% di PBTB con una leggera agitazione.

Quindi bloccare con 0,3% di PBTB integrato con il 5% di siero d'asino normale per un'ora. Con una leggera agitazione, trasferire il corpo adiposo in una provetta da 0,2 millilitri e aggiungere un anticorpo fluorescente secondario appropriato diluito nella soluzione bloccante. Posizionare la provetta in un rack e posizionare il rack su un rullo, incubare per due ore agitando delicatamente.

Se l'anticorpo è fluorescente, incubare al buio da questo punto in poi. Dopo due ore, trasferire il corpo adiposo nello stampo e lavare tre volte per 30 minuti ciascuna con 0,3% di PBT con una leggera agitazione per sezionare e montare le ovaie. Trasferire il corpo grasso in un tubo di einor pulito con molta attenzione.

Rimuovere tutti i liquidi con una pipetta per pascoli e coprire immediatamente con il supporto di montaggio Vector Shield. Tagliare l'estremità di un puntale per pipetta e aspirare con cura il corpo adiposo con un volume minimo di terreno di montaggio. Trasferire il corpo grasso su un vetrino da microscopio.

Il passo successivo consiste nell'utilizzare due portaperni nichelati che tengono perni di 0,1 millimetri di diametro per stendere il corpo adiposo sotto uno stereomicroscopio, localizzare le ovaie guardando nel terzo posteriore del corpo adiposo. Il corpo grasso ha una forma a fiore dove circonda le ovaie. Seziona i fiori dal resto del corpo grasso e scarta la scala.

Rimuovi il corpo grasso che circonda la gonade incrociando attentamente i due spilli attorno ad essa e allontanandola dall'ovaio. Posizionare la gonade isolata sul vetrino lontano dal residuo corporeo adiposo e scartare il residuo corporeo adiposo. Copri il vetrino con il coperchio.

Scivolare e sigillare con lo smalto. Visualizzare l'ovaio direttamente utilizzando un microscopio confocale. Queste cifre provengono da due e tre ovaie colorate con diverse combinazioni di anticorpi.

Nella prima immagine, un anticorpo delinea le cellule somatiche e le colora. I fusi fusi indicati dalle frecce sono organelli intracellulari. All'interno delle cellule germinali primordiali, mostrate in verde, ci sono il filamento terminale e le cellule del cappuccio, che insieme formano le cellule somatiche della nicchia, la punta della freccia punta verso le celle del cappuccio.

Questa figura mostra le cellule mescolate in magenta, che entrano direttamente in contatto con le cellule germinali raffigurate in blu. Le cellule somatiche dell'ovaio sono delineate in verde dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule staminali per esplorare la formazione di nicchie e l'insediamento di cellule staminali nell'ovaio di Tezo.