Name: Studiare lintegrazione degli adulti nati Neuroni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Impara l'integrazione funzionale dei neuroni granulari del dente neoformati nell'ippocampo adulto utilizzando marcatura retrovirale ed elettrofisiologia patch-clamp. Questo metodo consente di analizzare la maturazione sinaptica in vivo.

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Questo lavoro è stato finanziato dal NINDS e American Heart Association a S.Ge. Questo approccio è stato originariamente stabilito e sviluppato dall&#39;autore nel laboratorio del Dr. Hongjun Song nel Johns Hopkins University. Vorremmo ringraziare il Dott. Hongjun canzone per il suo orientamento e sostegno.

1. Virus iniezione Alto titolo retrovirus ingegnerizzati (1 × 10 9 unità / ml) è prodotto da co-trasfezione di vettori retrovirali e VSVG in cellule HEK293T, seguita da ultracentrifugazione di supernatante virale. Per le fonti e metodi di produzione, vedere la dimostrazione eccellente Giove (3). Nota: Giovani adulti (4-6 settimane) femminile C57BL / 6 topi (Charles River) si trovano in condizioni standard. Tutte le procedure seguite la Guida Consiglio Nazionale delle Ricerche per la cura e l'uso di animali da laboratorio in un protocollo approvato dalla Stony Brook University IACUC. <ol><li> 2ul disgelo dei retrovirus congelati per animale sul ghiaccio. </li><li> Anestetizzare (100 ketamina xylazina mcg + 10 mcg per grammo di peso corporeo) e montare l'animale su un telaio stereotassico (Steolting). Rimuovere i capelli sulla testa e pulire la pelle con il 70% di etanolo. </li><li> Esporre il cranio e quattro fori poco profondi con un trapano odontoiatrico (punta 0,6 millimetri) alle seguenti coordinate: <ul><li> anterioposterior = -2 mm dal bregma; laterale = ± 1,6 mm; ventrale = 2,5 mm; anterioposterior = mm -3 dal bregma; laterale = ± 2,6 mm; ventrale = 3,2 mm. </li><li> anterioposterior = -2 mm dal bregma; laterale = ± 1,6 mm; ventrale = 2,5 mm; anterioposterior = mm -3 dal bregma; laterale = ± 2,6 mm; ventrale = 3,2 mm. </li></ul></li><li> Montare un Hamilton 1ml, piatto punta della siringa e iniettare 0,5 microlitri retrovirus per sito ad un tasso di 0,25 microlitri / min nel giro dentato. (Vedi le coordinate sopra per profondità ventrale.) Pausa 2 minuti dopo ogni iniezione prima di ritirarsi lentamente la siringa per evitare il riflusso del fluido. Tra le iniezioni, brevemente risciacquare la superficie esterna della punta della siringa con PBS sterile e un applicatore per eliminare tracce di sangue. </li><li> Chiudere la ferita con materiale di sutura chirurgico sterile (tipo P-1; Dimensione 6-0) e rispedire l'animale verso condizioni abitative standard fino a quando le fasi di tempo desiderato dopo l'iniezione. </li></ol> 2. Fetta di preparazione Per ottenere fettine acute di alta qualità da topi adulti, si usa una soluzione di taglio per la preparazione modificato slice (vedi sotto). <ol><li> Pre-chill soluzione di taglio di 0-4 ° C su ghiaccio e bolla con il 95% O 2 -5% di CO 2 per almeno 30 minuti. </li><li> Anestetizzare e transcardially profumato un animale con ghiaccio-freddo di ossigeno soluzione satura di taglio. </li><li> Rimuovere rapidamente il cervello in una petri-piatto con carta da filtro pre-bagnate con il freddo, la soluzione ossigenata di taglio. Tagliare il cervelletto e tagliare una superficie di montaggio anteriore di almeno 1 mm a il (visibile) coordina iniezione. Incollare il cervello su un palco vibrotome e montarlo nella camera di taglio pieno di freddo e ossigenato soluzione di taglio. </li><li> Preparare le fette coronali o orizzontale (300-350μm) e trasferirli con un grosso pipetta ad una camera di incubazione contenente temperatura ambiente ACSF bollito con il 95% O 2 / 5% di CO 2. </li><li> Incubare le fette, bolle continuamente, a 32 ° C per 30-60 minuti. Ritorna la camera a temperatura ambiente per tutta la durata della registrazione. </li></ol> 3. Esperimenti di elettrofisiologia <ol><li> Fette sono trasferito nella camera di registrazione che viene continuamente perfuso con l'ossigeno-saturi ACSF a 32 ° C - 34 ° C. </li><li> Un elettrodo di tungsteno bipolare di stimolazione è collocato nello strato molecolare del giro dentato utilizzando un microscopio a bassa obiettivo ingrandimento (10X). </li><li> DGCS neonato nella sub-zona granulare / strato di cellule granulari sono identificati mediante l'espressione di GFP o dTomato. A cellula intera registrazione patchclamp viene eseguita su neuroni neonati sotto forte ingrandimento (40X). </li><li> Le proprietà di cottura delle cellule registrate sono ottenute mediante iniezione di una serie di correnti in current-clamp mode. </li><li> Stimoli elettrici sono forniti da stimolazione l'elettrodo attraverso un isolatore stimolazione controllata dal software di registrazione, e le correnti post-sinaptiche evocate nella DGCS neonati sono registrati. </li></ol> 4. Analisi dei dati Ampiezze delle risposte evocate postsinaptici sono analizzate a differenti stadi di sviluppo degli adulti nati neuroni. 5. Rappresentante Risultati Utilizzando il protocollo di cui sopra, l'espressione della GFP in neuroni neonati giro dentato simile alla figura 1 è comune. Si noti che i neuroni neonati sono facilmente visibili ed entrambi i dendriti e degli assoni sono robustamente etichettati. Espressione in sottili assoni DGC e piccole spine dipende dalla qualità e titolo del virus, il promotore utilizzato e la lunghezza di espressione in vivo. Nelle nostre mani, le cellule neonato e sub-organelli cellulari sono di solito visibili in pochi giorni dopo l'iniezione, e l'espressione della colonna vertebrale possono essere rintracciate fin dai primi stadi dello sviluppo. Wbuco celle registrazioni da neuroni neonati in fasi di tempo diversi permettono lo studio delle uniche proprietà delle celle neonato, potenziali d'azione ad esempio (Figura 2a), così come il processo di integrazione sinaptica esistente in circuiti neurali durante la maturazione (Figura 2b). <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 2-fotone immagine confocale dei neuroni neonati in una sezione orizzontale giro dentato di un topo adulto. Le cellule verdi sono 21dpi (giorni dopo l'iniezione) GFP che esprimono DGCS neonato etichettato con pUX-GFP retrovirus. <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 a) Azione potenziale cottura proprietà di un neonato DGC a 21 dpi. B) rappresentante evocato eccitatorio correnti post-sinaptiche (EPSCs) registrati su un DGC neonato a 21 dpi.

<ol><li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functional+implications+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li>
<li>Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+regulates+synaptic+integration+of+newly+generated+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain.</a> Nature. 439, 589-593 (2006).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Continua neurogenesi nell&#39;ippocampo del cervello dei mammiferi adulti fornisce un sistema unico modello sperimentale per lo studio dello sviluppo neuronale e di integrazione nel cervello maturo. Il protocollo presentato qui combina etichettatura retrovirali e metodi elettrofisiologici per studiare l&#39;integrazione del neonato neuroni granulari dentato nel cervello dei topi adulti. Per garantire che gli esperimenti hanno avuto successo, si raccomanda quanto segue durante le fasi critiche della procedura: Per evitare l&#39;infezione indesiderati e l&#39;infiammazione, tutti gli strumenti devono essere sterilizzati (in autoclave, qualsiasi tipo di sterilizzatore, o etanolo al 70%) prima dell&#39;intervento chirurgico. Usa PBS sterile per lavare la punta di un ago della siringa prima dell&#39;iniezione. Per l&#39;iniezione del virus, gli animali devono essere ben montato sul dispositivo stereotassico e le fonti di movimenti inutili deve essere minimizzato durante l&#39;iniezione. Assicurarsi che la testa è ben fisso e fermo, e regolare la posizione naso del mouse per livello bregma e lambda prima del calcolo delle coordinate di iniezione. Estratto del virus nella siringa rapidamente per ridurre al minimo l&#39;esposizione a temperature ambiente - i retrovirus sono particolarmente sensibili alla temperatura. Iniettare lentamente virus al tasso raccomandato per minimizzare i danni di pressione. Utilizzando la raccomandata a punta piatta siringa (vs comune punta smussata) assicurerà un uniformemente distribuita zona infezione giro dentato. Prima di preparare le fette, il taglio e la incubazione ACSF soluzione deve essere bollito con il 95% di CO O 2 -5% 2 per almeno 30 minuti per consentire l&#39;ossigeno per saturare le soluzioni. Gli animali devono essere perfusi rapidamente e il tessuto mantenuto a freddo, soluzione satura di ossigeno per una migliore qualità fetta. Per la registrazione, aumentare l&#39;intensità dello stimolo a poco a poco fino a quando c&#39;è una risposta postsinaptica. Cambiare la posizione degli elettrodi di stimolazione all&#39;interno dello strato molecolare del giro dentato, se necessario. In sintesi, l&#39;approccio raccomandato offre un modo per esplorare le proprietà distinte e possibili ruoli funzionali di neuroni adulti, nato durante la fase iniziale di integrazione in attivo, circuito maturo.

<ul><li> Taglio soluzione (in mm): 110 cloruro di colina, 2.5 KCl, 1.3 KH 2 PO 4, 25,0 NaHCO 3, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 10 destrosio, 1,3 ascorbato di sodio, 0,6 piruvato di sodio, 5,0 acido kynurenic. </li><li> Artificiale liquido cerebro-spinale (ACSF, in mm): 125,0 NaCl, 25,0 NaHCO 3, 2.5 KCl, 2 CaCl 2, 1,3 KH 2 PO 4, 1.3 MgCl2, 1,3 ascorbato di sodio, 0,6 di sodio piruvato, 10 destrosio. </li><li> Soluzione interna per intero a cellule patchclamp (in mm): 120 gluconato di potassio, 15 KCl, 4 MgCl 2, 0,1 EGTA, HEPES 10,0, 4 MgATP, 0,3 Na 3 GTP, 7 fosfocreatina (pH 7.4, 300 mOsm). </li></ul>

studiare l&#39;integrazione degli adulti nati neuroni

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesi si verifica nel cervello adulto dei mammiferi nella zona sub-ventricolare (SVZ) del ventricolo laterale e nella zona sub-granulare (SGZ) del giro dentato dell&#39;ippocampo tutta la vita. Rapporti precedenti hanno mostrato che la neurogenesi ippocampale adulta è associata a disturbi cerebrali diverse, quali l&#39;epilessia, la schizofrenia, depressione e ansia (1). Decifrare il processo di normale e aberrante adulti nati integrazione neurone può mettere in luce l&#39;eziologia di queste malattie e informare lo sviluppo di nuove terapie. Neurogenesi adulta SGZ specchi embrionale e post-natale sviluppo neuronale, comprese le fasi di specificazione destino, migrazione, integrazione sinaptica, e la maturazione. Tuttavia, l&#39;integrazione avviene su un prolungato periodo di 6 settimane. Iniziale di ingresso sinaptico per adulti nati in granuli SGZ dentato (DGCS) è GABAergici, seguita da ingresso glutammatergica a 14 giorni (2). I fattori specifici che regolano la formazione circuito di adulti nati neuroni nel giro dentato sono attualmente sconosciute. Il nostro laboratorio utilizza una replica con deficit vettore retrovirale basato sul virus della leucemia murina Moloney per fornire proteine ​​fluorescenti e ipotizzato geni regolatori a queste cellule proliferanti. Questa tecnica fornisce virale elevata specificità e la risoluzione per l&#39;analisi di data cellula nascita, lignaggio, morfologia e sinaptogenesi. Un tipico esperimento utilizza spesso due o tre virus che contiene un&#39;etichetta unica, transgene, promotore e gli elementi per cella singola analisi di un processo di sviluppo desiderato in vivo. Il seguente protocollo descrive un metodo per l&#39;analisi funzionale integrazione neonato utilizzando un unico neurone verde (GFP) o rosso (dTomato) retrovirus proteina fluorescente e patch-clamp elettrofisiologia.

Un modo per studiare l&#39;integrazione del neonato granuli dentato negli animali adulti è descritto. Questa tecnica utilizza un retrovirus progettato per etichettare i neuroni neonati, seguita da registrazioni elettrofisiologiche in vivo per determinare integrazione funzionale.

Studiare l&#39;integrazione degli adulti nati Neuroni

La neurogenesi avviene nei cervelli di mammiferi adulti nella zona sottoventricolare (SVZ) del ventricolo laterale e nella zona sottogranulare (SGZ) del...

L'obiettivo generale di questa procedura è introdurre un metodo per studiare l'integrazione funzionale delle cellule granulari del giro dentato nate nell'adulto. Questo viene raggiunto innanzitutto mediante iniezione stereotassica di retrovirus nel giro dentato di topi adulti per etichettare le nuove cellule granulari del giro dentato. Il secondo passaggio della procedura consiste nel perfondere i topi in determinati stadi temporali con soluzione fredda per il taglio ed estrarre il cervello.Il terzo passaggio della procedura consiste nel preparare sezioni cerebrali acute con un vibratomo. Il quarto passaggio della procedura consiste nell'eseguire registrazioni in modalità whole cell patch clamp su cellule granulari dentate neonate e nel stimolare lo strato molecolare di sezioni cerebrali acute. Infine, è possibile ottenere risultati che mostrano l'integrazione sinaptica funzionale dei neuroni neonati mediante la registrazione e l'analisi delle correnti postsinaptiche evocate nei neuroni granulari dentati neonati.I principali vantaggi di questa tecnica sono la marcatura retrovirale dei neuroni neonati nel cervello adulto e la preparazione acuta di sezioni cerebrali da animali adulti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurogenesi adulta, come la perdita funzionale dei neuroni neonati nel cervello adulto. Prepararsi per l'iniezione virale rimuovendo il retrovirus per la proteina fluorescente verde GFP o per la proteina fluorescente rossa D tomato dal congelatore e scongelandolo sul ghiaccio Scongelare.Due microlitri di retrovirus per animale anestetizzano un topo femmina di quattro a sei settimane. Verificare l'anestesia pizzicando la pianta del piede, fissare il topo su un telaio stereotassico, rasare i peli sulla testa e pulire la pelle con etanolo al 70%. Utilizzare un bisturi per tagliare la pelle ed esporre il cranio.Regolare la posizione del naso del topo in modo che bgma e lambda si trovino sullo stesso piano orizzontale utilizzando un trapano dentale con una punta da 0,6 millimetri. Praticare quattro fori attraverso il cranio alle coordinate mostrate qui. Riempire rapidamente una siringa Hamilton da un microlitro con la punta piatta con il retrovirus scongelato.Posizionarla sopra uno dei fori creati a meno due millimetri bgma per iniettare il retrovirus nel giro dentato. Abbassare la siringa fino a una profondità verticale di 2,5 millimetri. Iniettare 0,5 microlitri di retrovirus a una velocità di 0,25 microlitri al minuto per prevenire il reflusso del liquido.Attendere due minuti dopo ogni iniezione prima di ritirare lentamente la siringa. Sciacquare brevemente la superficie esterna della punta della siringa con PBS sterile e un applicatore per rimuovere tracce di sangue. Utilizzare lo stesso procedimento per iniettare 0,5 microlitri di retrovirus negli altri tre siti a profondità ventrali di 2,5 o 3,2 millimetri.Chiudere la ferita con materiale di sutura chirurgica sterile e restituire l'animale al suo alloggio fino a quando i neuroni neonati non abbiano raggiunto l'età di maturità desiderata. Dopo 21 giorni, prepararsi al taglio del cervello del topo preparando le soluzioni necessarie. Raffreddare la soluzione di taglio in ghiaccio a zero-quattro gradi Celsius e saturarla con una miscela di 95%ossigeno e 5%anidride carbonica per almeno 30 minuti.Posizionare il liquido cerebrospinale artificiale o A CSF a temperatura ambiente e saturarlo con una miscela di 95% ossigeno e 5% anidride carbonica per almeno 30 minuti. Dopo 30 minuti sul ghiaccio, preparare la soluzione di taglio ghiacciata chiamata soluzione saturata di ossigeno per la perfusione cardiaca. Dopo aver anestetizzato il topo, eseguire la perfusione cardiaca.Quindi rimuovere rapidamente il cervello e posizionarlo in una piastra di Petri contenente soluzione di taglio e un pezzo di carta da filtro nella piastra. Rimuovere il cervelletto e quindi eseguire un taglio coronale uno o due millimetri anteriormente ai siti di iniezione per ottenere una superficie piana. Per il montaggio super.Incollare il cervello su una piattaforma del vibram. Montare la piattaforma nella camera di taglio del vibram riempita con soluzione di taglio ossigenata. Abbassare la lama e impostare la finestra di taglio sul Vibram.Iniziare a tagliare il tessuto. Dividere ogni fetta in due metà lungo la linea mediana. Utilizzare una pipetta a largo diametro per trasferire queste fette in una camera di incubazione contenente aria ambiente.Temperatura A CSF bubbato con 95% ossigeno e 5% anidride carbonica. Continuare il taglio fino a quando non è visibile l'estremità anteriore dell'ippocampo. Incubare le sezioni mantenendo la bolla continua nel bagnomaria a 32 gradi Celsius per 30-60 minuti.Riportare la camera di incubazione alla temperatura del bordo per tutta la durata della registrazione. I taglierini sono ora pronti per la registrazione. Iniziare perfundendo la camera di registrazione con A CSF saturato di ossigeno a 32-34 gradi Celsius a circa due millilitri al minuto.Utilizzare un pinzetta per grandi animali per trasferire una sezione nella camera di registrazione. Posizionare un filo di platino a forma di U con sottili fili di nylon sopra la sezione per fissarla in posizione sotto basso ingrandimento. Identificare il livello molecolare del giro dentato.Quindi abbassare l'elettrodo di stimolazione nel livello molecolare del giro dentato. In condizioni di alta. Identificare le cellule granellari dentate neonate nella zona subgranulare o nel livello granulare mediante l'espressione della proteina fluorescente verde o rossa marcata.Individuare neuroni neonati che esprimono GFP o D tomato passando tra i filtri DIC e quelli a fluorescenza. Selezionare una cellula con fluorescenza relativamente intensa e un corpo cellulare sano per la registrazione con tecnica del patch clamp in configurazione whole cell. Inserire una micropipetta di vetro con una resistenza del capillare compresa tra tre e sei megaohm, riempita con la soluzione interna appropriata, in un supporto per micropipetta montato sullo stadio dell'amplificatore, sotto l'obiettivo ad alta ingrandimento del microscopio.Abbassare la micropipetta mediante un micromanipolatore fino alla cellula granulare dentata selezionata ed effettuare una registrazione in configurazione whole cell. Iniettare una serie di correnti in modalità clamp di corrente e registrare le proprietà di scarica del neurone neonato. Applicare impulsi elettrici singoli o doppi tramite l'elettrodo di stimolazione e registrare le correnti postsinaptiche evocate.Se non c'è alcuna risposta post-sinaptica, spostare l'elettrodo di stimolazione in un'altra posizione nel livello molecolare e tentare di registrare le correnti post-sinaptiche evocate dalla nuova posizione di stimolo. Al termine dell'esperimento, utilizzare l'adattamento in regime di blocco per misurare l'ampiezza delle risposte post-sinaptiche evocate nei neuroni neonati. Questa figura mostra l'espressione di GFP in neuroni neonati nel giro dentato di un topo adulto a 21 giorni dall'iniezione del retrovirus GFP.Notare che i neuroni neonati sono facilmente visibili e che sia i dendriti sia gli assoni sono marcati in modo robusto. I dendriti sono le prolunghe che si estendono dal soma nel livello molecolare del giro dentato, e gli assoni sono visibili anche nell'ilo e nell'area CA3. Questa figura mostra registrazioni in modalità clamp di corrente su cellule intere di una nuova cellula granulare del giro dentato a 21 giorni dall'iniezione del retrovirus P-U-X-G-F-P in un topo adulto.La traccia superiore mostra i potenziali d'azione eliciti da iniezione di corrente. Questa figura mostra le correnti post-sinaptiche elicite in una cellula granulare del giro dentato neonatale 21 giorni dopo l'iniezione del virus. Stimolando nello strato molecolare.L'esistenza della risposta post-sinaptica dimostra che il neurone appena formato si è già integrato nei circuiti neurali esistenti e riceve input sinaptici da ENT di diverse origini dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurogenesi adulta per esplorare l'integrazione funzionale dei neuroni neonati nel cervello adulto.

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 Imaging in tempo reale e tracciamento di singole cellule per monitorare il lignaggio neurale nelle cellule staminali neurali adulte

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