Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di profilare l'espressione del micro RNA in modo efficiente, economico e con un materiale di partenza minimo, combinando il multiplex quantitativo R-T-P-C-R con una piattaforma microfluidica. Questo inizia con la concentrazione dell'RNA estratto, seguita dalla trascrizione inversa multiplex e dalla preamplificazione multiplex. Il passo successivo è quello di purificare i primer in eccesso.

Infine, l'espressione del micro RNA singleplex viene profilata utilizzando una piattaforma microfluidica. Il risultato sono livelli di espressione di micro RNA accurati e altamente riproducibili su campioni di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che la fase di purificazione aggiuntiva dopo l'amplificazione pre-EMP migliora l'accuratezza e la riproducibilità del metodo multiplex Q-R-T-P-C-R.

Inizia con l'RNA che è stato estratto dal siero. Utilizzando un kit di purificazione dell'RNA o un metodo di RNA basato su cloroformio fenolico da tessuto omogeneizzato come il triolo, tutte le estrazioni devono essere seguite da una fase di lavaggio e tutta la conservazione viene eseguita a meno 80 gradi Celsius. Concentrare la soluzione di RNA.

Se si inizia con una quantità limitata di campione, ad esempio dal siero, inserire un serbatoio di campione MicroCon in una fiala, quindi pipettare la soluzione di RNA nel serbatoio, facendo molta attenzione a non toccare la membrana con la punta della pipetta. Posizionare ora la fiala e il filtro nella centrifuga con la banda di crack rivolta verso il rotore e far funzionare la centrifugazione per circa tre ore. Dopo tre ore, l'RNA sarà completamente concentrato sulla membrana per eluire l'RNA.

Aggiungere la quantità desiderata di acqua priva di RNA alla membrana, capovolgere il serbatoio e metterlo in una nuova fiala. Quindi centrifugare per tre minuti a quattro gradi Celsius con un massimo di 3000 volte G.Store'RNA concentrato a meno 80 gradi Celsius fino a quando non è necessario Dopo aver eseguito una reazione RT sull'RNA utilizzando i primer xpl reverse stem loop, seguita da 12-18 cicli di cicli PCR. I microRNA sono rappresentati da filamenti di CD NA.

Questo è chiamato prodotto pre PCR. Riferendosi al prossimo QPCR. Il prodotto pre PCR deve essere purificato su un gel di poliacrilammide al 10% insieme a un carico a scala di DNA accoppiato a 10 basi per corsia con 5,5 microlitri di sei x G arancioni combinati con 27,5 microlitri di prodotto pre PCR.

Far funzionare il gel a 150 volt per 55-60 minuti. Il blu fenolo Romo scorre su questo gel nella regione delle 20 coppie di basi. Dopo che il gel è colato, macchiarlo con oro cibernetico per 25 minuti, non esposto alla luce e su uno shaker dal gel colorato.

Ritagliare la banda del prodotto pre PCR da 60 a 80 paia di basi e trasferire il blocco di gel nelle provette etichettate. Se la concentrazione del prodotto è bassa, potrebbe non essere visibile, ma sarà comunque nel gel. Ora schiacciare la banda di gel utilizzando la centrifugazione tubo in tubo e aggiungere 300 microlitri di tampone TEN.

Incubare la miscela di gel tampone per quattro ore a 37 gradi Celsius agitando. Dopo quattro ore, trasferire il fluido in una nuova provetta e aggiungere altri 300 microlitri di tampone TEN. Incubare questa miscela per una notte a quattro gradi Celsius con agitazione.

Il giorno successivo, trasferire nuovamente il contenuto della provetta e procedere con una precipitazione con etanolo del prodotto pre PCR. Quando un chip viene aperto dalla sua confezione, deve essere innescato entro 24 ore e quindi caricato entro 60 minuti dall'adescamento. Inizia a innescare l'array iniettando 150 microlitri di fluido della linea di controllo in ciascuno degli accumulatori sul chip.

Fare attenzione a non versare alcun liquido sul chip o sugli ingressi, altrimenti il chip diventerà inutilizzabile. Quindi posizionare il chip nel circuito fluidico integrato o nel controller IFC ed eseguire lo script di priming del controller. Non appena il programma inizia, inizia a preparare i campioni.

Iniziare preparando il campione pres Mescolare una combinazione di tack man, universal master mix e reagenti di caricamento. Quindi, utilizzando il formato di caricamento a 96 pozzetti, combinare 2,25 microlitri di ciascun campione con 2,75 microlitri di miscela di campioni pres per raccogliere il fluido caricato. Agitare brevemente e centrifugare rapidamente la piastra a quattro gradi Celsius.

La piastra del campione è ora pronta. Ora utilizzare una nuova piastra a 96 pozzetti per preparare 13 concentrazioni della miscela del saggio. Questo viene fatto mescolando un primer universale, un primer diretto e una sonda tac man specifica per gene per pozzetto.

Le concentrazioni di uno X sono un micromolare per il primer universale e in avanti e 0,2 micromolari per la sonda tac man. Quindi aggiungere abbastanza interpolazione per una concentrazione finale dello 0,25% in un volume finale di cinque microlitri. Mescolare bene evitando bolle e girare brevemente la piastra per raccogliere il liquido.

Questa è la piastra di analisi. Inizia il 96.96 Q-R-T-P-C-R caricando il chip. Caricare prima i campioni e poi i saggi con il volume finale di cinque microlitri per ingresso all'IFC.

In secondo luogo, eseguire lo script di miscelazione del carico per caricare i campioni e i saggi nel chip. Al termine dello script, staccare la pellicola protettiva dal chip caricato e rimuovere eventuali particelle di polvere o detriti dalla superficie del chip utilizzando del nastro adesivo. Ora impostate il programma di amplificazione del biosistema.

Carica il chip nel sistema ed esegui il programma. I risultati possono essere analizzati con il software fluid dime per fornire curve di amplificazione, mappe termiche dell'intero chip e valori CT per ciascuno. Bene utilizzando prodotti pre PCR, purificati mediante separazione dimensionale su gel di poliacrilammide nativi, DG CR eight wild type e ER null mutant.

L'RNA è stato preparato rispetto ai protocolli precedenti. Più microRNA e una perdita di falsi segnali positivi si verificano sia negli otto sfondi nulli DGCR che in quelli nulli ER grazie alla fase di purificazione. Inoltre, l'approccio QR TPCR R modificato consente la corretta categorizzazione dei piccoli RNA rari D gcr otto indipendenti dipendenti dal dicero.

Qui, 48 cera di pazienti e controlli sono stati sottoposti a screening per il cambiamento di espressione di 384 diversi microRNA. I dati sono stati normalizzati per ciascun campione sottraendo la mediana corrispondente e senza utilizzare un picco nei controlli. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come il multiplex Q-R-T-P-C-R su una piattaforma di linee antinfluenzali possa essere utilizzato per profilare simultaneamente centinaia di micronasi su molti campioni, anche quando si inizia con un input molto limitato, l'RNA.