Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM

L'obiettivo generale di questa procedura è profilare l'espressione di micro RNA in modo efficiente, economico e con quantità minime di materiale iniziale, combinando la R-T-P-C-R quantitativa multiplex con una piattaforma microfluidica. Questo processo inizia con la concentrazione dell'RNA estratto, seguita da trascrizione inversa multiplex e preamplificazione multiplex. Il passaggio successivo consiste nel purificare via i primer in eccesso.

Infine, l'espressione di micro RNA monocanale viene profilata mediante una piattaforma microfluidica. Il risultato consiste in livelli di espressione di micro RNA precisi e altamente riproducibili tra i campioni di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che il passaggio aggiuntivo di purificazione dopo l'amplificazione pre-EMP migliora l'accuratezza e la riproducibilità del metodo di Q-R-T-P-C-R multiplex.

Iniziare con l'RNA estratto dal siero. Utilizzando un kit di purificazione dell'RNA o un metodo di estrazione a base di fenolo-cloroformio da tessuti omogeneizzati come il triolo, tutte le estrazioni devono essere seguite da un passaggio di lavaggio e il campione deve essere conservato a meno 80 gradi Celsius. Concentrare la soluzione di RNA.

Se si parte da una quantità limitata di campione, ad esempio da siero, inserire un serbatoio campione MicroCon in un vial, quindi pipettare la soluzione di RNA nel serbatoio, avendo molta cura a non toccare la membrana con la punta della pipetta. Posizionare ora il vial e il filtro nella centrifuga con la fascia di cricca rivolta verso il rotore ed eseguire la centrifugazione per circa tre ore. Dopo tre ore, l'RNA sarà completamente concentrato sulla membrana per l'eluzione dell'RNA.

Aggiungere una quantità desiderata di acqua priva di RNA alla membrana, capovolgere il serbatoio e posizionarlo in un nuovo vial. Quindi centrifugare per tre minuti a quattro gradi Celsius con un massimo di 3000 ×g. Conservare l'RNA concentrato a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Dopo aver eseguito una reazione di RT sull'RNA utilizzando primer xpl reverse stem loop, seguita da 12 a 18 cicli di PCR, i microRNA sono rappresentati da filamenti di CD NA.

Questo viene chiamato prodotto pre PCR. In riferimento al QPCR successivo. Il prodotto pre PCR deve essere purificato su un gel di poliacrilammide al 10% insieme a un marcatore di DNA a 10 paia di basi, caricando ogni corsia con 5,5 microlitri di arancio G 6x combinati con 27,5 microlitri di prodotto pre PCR.

Eseguire l'elettroforesi a 150 volt per 55-60 minuti. Il fenolo blu Romo migra in questa gel nella regione di 20 paia di basi. Al termine dell'elettroforesi, colorare la gel con cyber gold per 25 minuti, al buio e in agitazione, partendo dalla gel colorata.

Tagliare la banda del prodotto pre-PCR compresa tra 60 e 80 paia di basi e trasferire il frammento di gel in provette etichettate. Se la concentrazione del prodotto è bassa, potrebbe non essere visibile, ma sarà comunque presente nel gel. Ora frantumare la banda di gel mediante centrifugazione con provetta dentro provetta e aggiungere 300 microlitri di buffer TEN.

Incubare la miscela di gel tampone per quattro ore a 37 gradi Celsius con agitazione. Dopo quattro ore, trasferire il liquido in un nuovo tubo e aggiungere altri 300 microlitri di tampone TEN. Incubare questa miscela tutta la notte a quattro gradi Celsius con agitazione.

Il giorno successivo, trasferire nuovamente il contenuto del tubo e procedere con una precipitazione alcolica del prodotto pre-PCR. Quando una chip viene aperta dal suo imballaggio, deve essere condizionata entro 24 ore e quindi caricata entro 60 minuti dal condizionamento. Iniziare il condizionamento dell'array iniettando 150 microlitri di fluido di controllo in ciascuno degli accumulatori sul chip.

Attenzione a non versare alcun liquido sul chip o sugli ingressi, altrimenti il chip diventerà inutilizzabile. Quindi posizionare il chip nel circuito fluidico integrato o nel controller IFC ed eseguire lo script di inizializzazione del controller. Non appena il programma inizia, iniziare a preparare i campioni.

Iniziare preparando la miscela per il campione pres. Mescolare una combinazione di tack man, miscela master universale e reagenti per il caricamento. Successivamente, utilizzando il formato di caricamento a 96 pozzetti, combinare 2,25 microlitri di ogni campione con 2,75 microlitri di miscela pres per raccogliere il fluido caricato. Vortexare brevemente e centrifugare rapidamente la piastra a quattro gradi Celsius.

La piastra del campione è ora pronta. Utilizzare ora una nuova piastra a 96 pozzetti per preparare 13 concentrazioni dell'ammontare del mix per il saggio. Questo viene fatto mescolando in ogni pozzetto un primer universale, un primer forward e una sonda TaqMan specifica per il gene.

Le concentrazioni di X sono di un micromolare per l'innesco universale e diretto e di 0,2 micromolare per la sonda TaqMan. Quindi aggiungere quantità sufficiente di Tween per ottenere una concentrazione finale dello 0,25% di Tween in un volume finale di cinque microlitri per pozzetto. Mescolare bene evitando bolle ed effettuare una breve centrifugazione della piastra per raccogliere il liquido.

Questa è la piastra del saggio. Iniziare la Q-R-T-P-C-R 96.96 caricando il chip. Caricare prima i campioni e poi i saggi, con un volume finale di cinque microlitri per ogni ingresso nell'IFC.

In secondo luogo, eseguire lo script di caricamento della miscela per caricare i campioni e i saggi nel chip. Al termine dello script, rimuovere con cura il film protettivo dal chip caricato ed eliminare eventuali particelle di polvere o detriti dalla superficie del chip utilizzando del nastro adesivo. A questo punto, configurare il programma di amplificazione del sistema biologico.

Caricare il chip nel sistema ed eseguire il programma. I risultati possono essere analizzati con il software fluid dime per ottenere curve di amplificazione, mappe termiche dell'intero chip e valori CT per ciascun pozzetto, utilizzando prodotti pre-PCR purificati mediante separazione per dimensione su gel di poliacrilamide nativi, DGCR8 di tipo selvaggio e mutante nullo per ER.

L'RNA è stato preparato in modo diverso rispetto ai protocolli precedenti. Un maggior numero di microRNA e una riduzione dei segnali falsi positivi si verificano sia in contesti privi di DGCR8 sia in quelli privi di ER, grazie al passaggio di purificazione. Inoltre, l'approccio modificato di QR TPCR R consente la corretta classificazione di rari RNA piccoli, indipendenti da D gcr8 e dipendenti da Dicer.

Qui, 48 campioni di cerume provenienti da pazienti e soggetti di controllo sono stati analizzati per rilevare variazioni nell'espressione di 384 diversi microRNA. I dati sono stati normalizzati per ciascun campione sottraendo la mediana corrispondente, senza l'uso di un controllo aggiunto nei campioni di riferimento. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come la Q-R-T-P-C-R multiplex su una piattaforma flu line possa essere utilizzata per profilare simultaneamente centinaia di microRNA in numerosi campioni, anche a partire da quantità molto limitate di RNA iniziale.