Name: Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Scopri il profiling di microRNA ad alto throughput con qRT-PCR multiplex ottimizzato su piattaforma microfluidica. Questo metodo migliora accuratezza e riproducibilità con campioni di RNA limitati.

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Vorremmo ringraziare il laboratorio Blelloch per commentare il testo. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di RB dal NIH (K08 NS48118 e R01 NS057221), California Institute of Regenerative Medicine (CIRM) (semi di Grant RS1-00161, Premio Facoltà di New RN2-00906) e Pew Charitable Trust e FM dal Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.

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</ol>

Alan Mir è un dipendente di Fluidigm Corporation. Altrimenti, non abbiamo interessi finanziari di rivelare.

miRNA sono brevi (18-24 nucleotidi) non codificanti miRNA RNA, che regolano l&#39;espressione genica post-trascrizionale di RNA messaggero sia destabilizzante (mRNA) e inibendo la loro traduzione. 6 Il fatto che almeno un terzo dei geni umani contengono conservato vincolanti nei loro siti-3&#39;UTR e le interazioni evidenti dei miRNA con i geni per la pluripotenza, la proliferazione e l&#39;apoptosi suggerisce un contributo critico nelle decisioni il destino della cellula, omeostasi dei tessuti e malattie come il cancro. 6,7 Quindi precisa profili di espressione di microRNA sono di ampio interesse. Per testare la multisala pubblicato qRT-PCR l&#39;espressione protocollo miRNA profiling 2 abbiamo usato piccoli Mesc carente RNA come controlli negativi. DGCR8 - / - cellule sono carenti di tutti i microRNA canonica, mentre Dicer - / -. Cellule mancanza micoRNAs sia canoniche e non canoncial 8,9 Confrontando i livelli di tipo selvatico MES-to DGCR8 - / - cellule, abbiamo scoperto la mancanza di precisione, come espresso più 10 microRNA non sono stati rilevati nel wild-type cellule 11. Alcuni addirittura hanno mostrato livelli di espressione più bassi rispetto alle cellule ad eliminazione diretta (Figura 3). Abbiamo ipotizzato che la mancanza di precisione potrebbe essere causato dal fondo massiccia riporto di due multiplex fasi consecutive (RT e Pre-PCR) prima singleplex RT-quantificazione. Tuttavia, multiplex di pre-amplificazione è necessaria per migliorare la potenza del segnale, soprattutto quando la concentrazione di partenza di RNA è limitata. Purificando via pre-PCR prodotti da primer di selezione del formato in gel di poliacrilammide nativo (Figura 2), abbiamo potuto dimostrare un sostanziale miglioramento della precisione rilevando più microRNA e una perdita di falsi segnali positivi in entrambi i Dgcr8 - / - e Dicer - / - sfondi (Figure 3a e 3b) Oltre la modifica qRT-PCR approccio ha permesso per la categorizzazione corretta di rara Dgcr8 RNA dipendente indipendente / Dicer di piccole dimensioni (Figura 3b) 11. Quindi un ulteriore passo per purificare primer eccessiva distanza dalla pre-PCR prodotto è chiaramente vantaggioso, soprattutto quando si utilizzano grandi multiplex fondo set per campione. Il numero ottimale di pre-amplificazione dei cicli è determinata dalla concentrazione di RNA di ingresso. Il saldo di non sottovalutare o overamplify dovrebbe essere guidato da indicazioni specifiche dell&#39;esperimento. Con oltre un migliaio di microRNA noto, l&#39;uso di standard di 384 pozzetti potrebbe non essere ottimale per il profiling microRNA ampia, soprattutto quando si confrontano campioni multipli. L&#39;IFC Fluidigm Array dinamico consente, con una diminuzione significativa di passi pipettaggio e della chimica necessari, i test fino a 96 campioni individuali contro 96 differenti microRNA in un singolo esperimento (9216 reazioni) a scala nanolitri (6,7 nL). Per ogni esecuzione il software di analisi fornisce le curve di amplificazione, colori mappe di calore e dei valori del ciclo soglia (Ct). Il simultaneo su larga scala profilazione riduce le variazioni sperimentali e consente la normalizzazione valore medio di espressione, che fuori effettua strategie di normalizzazione altri che fanno uso di piccoli controlli RNA 12. Rispetto al commercio 384 piattaforme bene con pre-assegnato sonde TaqMan, la combinazione di un elevato throughput piattaforma profilatura con misura set di primer offre un&#39;elevata flessibilità di sperimentazione. La ottimizzato multiplex qRT-PCR approccio in combinazione con la piattaforma di array dinamici con successo ci ha permesso di schermo contemporaneamente 48 cancro alla prostata sieri dei pazienti per le alterazioni dei livelli di 384 miRNA (Figura 4) e per normalizzare i dati senza picchi nei controlli (cioè sintetici microRNA). 11 Nonostante l&#39;aumento dei passaggi dalla preparazione dei campioni ai risultati profilazione, l&#39;approccio descritto è un tempo-e conveniente metodo throughput elevato per set di profilo ampio campione per i livelli di espressione di miRNA, anche con limitata materiale di partenza.

alta microrna profiling throughput: multiplex ottimizzato qrt-pcr a scala nanoliter sul fluidigm dinamica ifcs arraytm

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Un ampio coinvolgimento dei miRNA nei processi critici di fondo dello sviluppo, dell&#39;omeostasi dei tessuti e la malattia ha portato ad un interesse in aumento fra le comunità di ricerca e farmaceutica. Per studiare miRNA, è essenziale che la quantificazione dei livelli di microRNA è preciso e robusto. Confrontando wild-type di piccoli RNA deficienti cellule staminali embrionali di topo (Mesc), ci ha rivelato una mancanza di precisione e robustezza nelle precedenti pubblicati qRT multiplex-PCR tecniche. Qui, descriviamo un metodo ottimizzato, anche purificare lontano primer eccessivo passi multiplex precedente prima rilevazione singleplex tempo reale, che aumenta notevolmente la precisione e la solidità della tecnica. Inoltre, abbiamo spiegato come eseguire la tecnica su un chip microfluidica a volumi nanoliter riduce significativamente i costi dei reagenti e il tempo lo permette efficace ad alta velocità miRNA profili di espressione.

Qui descrivere un ottimizzato trascrittasi inversa multiplex PCR quantitativa (QRT-PCR) protocollo in combinazione con una piattaforma microfluidica come un efficace costi e tempi high-throughput screening per microRNA (miRNA) livelli di espressione, soprattutto quando si lavora con quantità limitate di campione.

Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM

L'ampio coinvolgimento dei miRNA nei processi critici alla base dello sviluppo, dell'omeostasi tissutale e delle patologie ha portato a un crescente interesse tra i...

L'obiettivo generale di questa procedura è profilare l'espressione di micro RNA in modo efficiente, economico e con quantità minime di materiale iniziale, combinando la R-T-P-C-R quantitativa multiplex con una piattaforma microfluidica. Questo processo inizia con la concentrazione dell'RNA estratto, seguita da trascrizione inversa multiplex e preamplificazione multiplex. Il passaggio successivo consiste nel purificare via i primer in eccesso.Infine, l'espressione di micro RNA monocanale viene profilata mediante una piattaforma microfluidica. Il risultato consiste in livelli di espressione di micro RNA precisi e altamente riproducibili tra i campioni di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che il passaggio aggiuntivo di purificazione dopo l'amplificazione pre-EMP migliora l'accuratezza e la riproducibilità del metodo di Q-R-T-P-C-R multiplex.Iniziare con l'RNA estratto dal siero. Utilizzando un kit di purificazione dell'RNA o un metodo di estrazione a base di fenolo-cloroformio da tessuti omogeneizzati come il triolo, tutte le estrazioni devono essere seguite da un passaggio di lavaggio e il campione deve essere conservato a meno 80 gradi Celsius. Concentrare la soluzione di RNA.Se si parte da una quantità limitata di campione, ad esempio da siero, inserire un serbatoio campione MicroCon in un vial, quindi pipettare la soluzione di RNA nel serbatoio, avendo molta cura a non toccare la membrana con la punta della pipetta. Posizionare ora il vial e il filtro nella centrifuga con la fascia di cricca rivolta verso il rotore ed eseguire la centrifugazione per circa tre ore. Dopo tre ore, l'RNA sarà completamente concentrato sulla membrana per l'eluzione dell'RNA.Aggiungere una quantità desiderata di acqua priva di RNA alla membrana, capovolgere il serbatoio e posizionarlo in un nuovo vial. Quindi centrifugare per tre minuti a quattro gradi Celsius con un massimo di 3000 ×g. Conservare l'RNA concentrato a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Dopo aver eseguito una reazione di RT sull'RNA utilizzando primer xpl reverse stem loop, seguita da 12 a 18 cicli di PCR, i microRNA sono rappresentati da filamenti di CD NA.Questo viene chiamato prodotto pre PCR. In riferimento al QPCR successivo. Il prodotto pre PCR deve essere purificato su un gel di poliacrilammide al 10% insieme a un marcatore di DNA a 10 paia di basi, caricando ogni corsia con 5,5 microlitri di arancio G 6x combinati con 27,5 microlitri di prodotto pre PCR.Eseguire l'elettroforesi a 150 volt per 55-60 minuti. Il fenolo blu Romo migra in questa gel nella regione di 20 paia di basi. Al termine dell'elettroforesi, colorare la gel con cyber gold per 25 minuti, al buio e in agitazione, partendo dalla gel colorata.Tagliare la banda del prodotto pre-PCR compresa tra 60 e 80 paia di basi e trasferire il frammento di gel in provette etichettate. Se la concentrazione del prodotto è bassa, potrebbe non essere visibile, ma sarà comunque presente nel gel. Ora frantumare la banda di gel mediante centrifugazione con provetta dentro provetta e aggiungere 300 microlitri di buffer TEN.Incubare la miscela di gel tampone per quattro ore a 37 gradi Celsius con agitazione. Dopo quattro ore, trasferire il liquido in un nuovo tubo e aggiungere altri 300 microlitri di tampone TEN. Incubare questa miscela tutta la notte a quattro gradi Celsius con agitazione.Il giorno successivo, trasferire nuovamente il contenuto del tubo e procedere con una precipitazione alcolica del prodotto pre-PCR. Quando una chip viene aperta dal suo imballaggio, deve essere condizionata entro 24 ore e quindi caricata entro 60 minuti dal condizionamento. Iniziare il condizionamento dell'array iniettando 150 microlitri di fluido di controllo in ciascuno degli accumulatori sul chip.Attenzione a non versare alcun liquido sul chip o sugli ingressi, altrimenti il chip diventerà inutilizzabile. Quindi posizionare il chip nel circuito fluidico integrato o nel controller IFC ed eseguire lo script di inizializzazione del controller. Non appena il programma inizia, iniziare a preparare i campioni.Iniziare preparando la miscela per il campione pres. Mescolare una combinazione di tack man, miscela master universale e reagenti per il caricamento. Successivamente, utilizzando il formato di caricamento a 96 pozzetti, combinare 2,25 microlitri di ogni campione con 2,75 microlitri di miscela pres per raccogliere il fluido caricato. Vortexare brevemente e centrifugare rapidamente la piastra a quattro gradi Celsius.La piastra del campione è ora pronta. Utilizzare ora una nuova piastra a 96 pozzetti per preparare 13 concentrazioni dell'ammontare del mix per il saggio. Questo viene fatto mescolando in ogni pozzetto un primer universale, un primer forward e una sonda TaqMan specifica per il gene.Le concentrazioni di X sono di un micromolare per l'innesco universale e diretto e di 0,2 micromolare per la sonda TaqMan. Quindi aggiungere quantità sufficiente di Tween per ottenere una concentrazione finale dello 0,25% di Tween in un volume finale di cinque microlitri per pozzetto. Mescolare bene evitando bolle ed effettuare una breve centrifugazione della piastra per raccogliere il liquido.Questa è la piastra del saggio. Iniziare la Q-R-T-P-C-R 96.96 caricando il chip. Caricare prima i campioni e poi i saggi, con un volume finale di cinque microlitri per ogni ingresso nell'IFC.In secondo luogo, eseguire lo script di caricamento della miscela per caricare i campioni e i saggi nel chip. Al termine dello script, rimuovere con cura il film protettivo dal chip caricato ed eliminare eventuali particelle di polvere o detriti dalla superficie del chip utilizzando del nastro adesivo. A questo punto, configurare il programma di amplificazione del sistema biologico.Caricare il chip nel sistema ed eseguire il programma. I risultati possono essere analizzati con il software fluid dime per ottenere curve di amplificazione, mappe termiche dell'intero chip e valori CT per ciascun pozzetto, utilizzando prodotti pre-PCR purificati mediante separazione per dimensione su gel di poliacrilamide nativi, DGCR8 di tipo selvaggio e mutante nullo per ER.L'RNA è stato preparato in modo diverso rispetto ai protocolli precedenti. Un maggior numero di microRNA e una riduzione dei segnali falsi positivi si verificano sia in contesti privi di DGCR8 sia in quelli privi di ER, grazie al passaggio di purificazione. Inoltre, l'approccio modificato di QR TPCR R consente la corretta classificazione di rari RNA piccoli, indipendenti da D gcr8 e dipendenti da Dicer.Qui, 48 campioni di cerume provenienti da pazienti e soggetti di controllo sono stati analizzati per rilevare variazioni nell'espressione di 384 diversi microRNA. I dati sono stati normalizzati per ciascun campione sottraendo la mediana corrispondente, senza l'uso di un controllo aggiunto nei campioni di riferimento. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come la Q-R-T-P-C-R multiplex su una piattaforma flu line possa essere utilizzata per profilare simultaneamente centinaia di microRNA in numerosi campioni, anche a partire da quantità molto limitate di RNA iniziale.

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Dimostreremo la configurazione e l'analisi di pre-microRNA 96-array e per QPCR usando un robot così come a mano con una pipetta multicanale Thermo Scientific Matrix.

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Descriviamo un protocollo di PCR in tempo reale al profilo microRNA nel fluido cerebrospinale (CSF). Con l'eccezione di protocolli di estrazione di RNA, la procedura può essere estesa a RNA estratto da altri fluidi corporei, cellule coltivate, ei campioni di tessuto.

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Molecular segnalazione sia attraverso gli estrogeni e microRNA sono fondamentali nello sviluppo del cancro al seno e la crescita. Estrogeni attiva i recettori degli estrogeni, che sono fattori di trascrizione. Molti fattori di trascrizione in grado di regolare l'espressione dei microRNA, e microRNA regolati dagli estrogeni possono essere profilato utilizzando diverse tecniche su larga scala.

Profiling di microRNA regolati dagli estrogeni in cellule di carcinoma mammario

MicroRNA circolanti sono recentemente emersi come biomarcatori promettenti e innovativi per vari tipi di cancro e di altre malattie. L'obiettivo di questo articolo è quello di discutere di tre diverse piattaforme di PCR real-time sonda-based e metodi che sono disponibili per quantificare e determinare l'abbondanza dei microRNA circolanti.

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test high-throughput di DNA e RNA patogeni a base di nanoscala PCR è descritto con un cane sindromica e equini pannello PCR respiratorio.

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Questo protocollo descrive come valutare l'espressione di una vasta gamma di geni a livello clonale. Single-cell RT-qPCR produce risultati altamente affidabili con una forte sensibilità per le centinaia di campioni e geni.

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Qui viene presentato un protocollo quantitativo basato sulla reazione a catena della polimerasi in tempo reale per la determinazione del contenuto di micro-RNA nativo (assoluto/relativo) delle particelle di lipoproteina. Inoltre, è dimostrato un metodo per aumentare il livello di micro-RNA, nonché un metodo per determinare il tasso di captazione cellulare delle particelle di lipoproteina.

Arricchimento delle particelle di lipoproteina nativa con microRNA e successiva determinazione del loro contenuto di microRNA assoluto/relativo e della loro velocità di trasferimento cellulare

In questo articolo viene descritto un protocollo ad alta produttività per una determinazione rapida e affidabile dei livelli di espressione genica in campioni C. elegans singoli o sfusi. Questo protocollo non richiede l'isolamento dell'RNA e produce cDNA direttamente dai campioni. Può essere utilizzato insieme a piattaforme qPCR multiplexate ad alta produttività in tempo reale.

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Scopri il profiling di microRNA ad alto throughput con qRT-PCR multiplex ottimizzato su piattaforma microfluidica. Questo metodo migliora accuratezza e riproducibilità con campioni di RNA limitati.

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