Name: Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) di fluorescenza proteine Tagged in spine dendritiche di colture di neuroni ippocampali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Impara la tecnica FRAP per studiare la mobilità di proteine EGFP nelle spine dendritiche di neuroni ippocampali di ratto. Questo metodo quantifica le frazioni mobile e immobile della proteina fluorescente.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute on Deafness e altri disturbi della comunicazione (dell&#39;NIDCD) Programma Intramural.

1. Neuron trasfezione <ol><li> Cultura embrionale i neuroni di ratto giorno 18 (E18) dell'ippocampo sulla poli-d-lisina rivestite MatTek da 35 mm con fondo di vetro piatti 1. Sul 16-18 giorni in vitro (DIV), i neuroni trasfezione utilizzando il kit CalPhos Transfection mammiferi Clontech. In primo luogo, sostituire il terreno di coltura con 1,5 ml <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Culture/Mammalian-Cell-Culture/Classical_Media/dmem.html">di coltura Dulbecco modificato Aquila Media</a> (DMEM) per 35 mm, piatto 0,5 ore prima della trasfezione. Salvare il supporto originale la cultura in un tubo sterile 15 ml per rivederlo (passo 1,6) uso. </li><li> Mix 10 mcg pEGFP-N1 DNA plasmidico con sterili H 2 O (Clontech) e 12,4 microlitri soluzione 2 M di calcio (Clontech) per un volume totale di 100 ul. </li><li> Aggiungere il composto a partire dal punto 1.2) a 100 l 2 × HBS goccia a goccia, mentre vortex 2 × HBS a velocità media. </li><li> Lasciate il composto a temperatura ambiente per 20 minuti e poi aggiungete il composto finale dal punto 1.3) in DMEM-incubate neuroni. </li><li> Mettete i neuroni indietro nel 37 ° C incubatore per 1-1,5 ore. </li><li> Rimuovere il fosfato contenenti calcio medio, quindi lavare le cellule con DMEM tre volte. Prima di restituire il piatto alla cultura, incubatore di cambio del mezzo DMEM con il terreno di coltura originale. </li></ol> 2. FRAP esperimento su una spina dorsale <ol><li> I neuroni sono utilizzati per l'esperimento FRAP 2-4 giorni dopo la trasfezione. </li><li> Sostituire il terreno di coltura da 35 mm con fondo di vetro piatto, da subito l'aggiunta di pre-riscaldato Soluzione Tyrode, che contiene (in mm) NaCl 145, KCl 5, HEPES 10, Glucosio 10, glicina 0,005, CaCl2 2.6, e MgCl 2 1.3 (pH regolato a 7,4 con NaOH). </li><li> Un Zeiss LSM 710 microscopio confocale è utilizzato per l'esperimento FRAP. Il sistema TempModule Zeiss è utilizzato per controllare la temperatura (37 ° C), l'umidità e la CO 2 (5%) del sistema di lavoro. Assicurarsi che la CO 2 del serbatoio è collegato e la bottiglia d'acqua, che viene utilizzato per bilanciare l'umidità, si riempie di acqua. </li><li> Trova un dendrite transfettate maturo con l'obiettivo × 100 (αplan-Apochromat 100 × / 1,46 olio). Se le cellule transfettate nel piatto sono sparse, ricerca di una cella desiderata con l'obiettivo 40 × (Plan-Neofluar 40 × / 1,3 olio), e poi passare alla 100 × obiettivo di catturare le immagini. </li><li> Utilizzare 5 × zoom ottico e di una risoluzione di 256 × 256 pixel per l'immagine di un breve brano di dendrite con spine diverse. Per catturare le immagini, utilizzare velocità nominale 9 (pixel tempo di sosta 3,15 msec) che prende 0,5 secondi per completare una scansione. Il foro stenopeico è impostato per 2μm di ottenere una forte fluorescenza. Quando si scattano immagini, tenta di utilizzare la trasmissione a bassa laser, per esempio 1-5%, per evitare photobleaching l'intera immagine. </li><li> Selezionare la colonna vertebrale di interesse. Nel nostro esperimento, abbiamo scelto spine di funghi con diametro della colonna vertebrale la testa di circa 1 micron. </li><li> Per fare un esperimento FRAP, prendere 5 immagini di controllo prima dello sbiancamento, poi candeggina la colonna vertebrale di interesse 10 volte al valore nominale di trasmissione laser 100% [La potenza argon laser è 30 mW, con il 50% (15 mW) in linea 488 laser, e mW circa 3-4 arriva al microscopio attraverso la linea 488 laser], e quindi acquisire una serie di immagini subito dopo lo sbiancamento. Per questo esperimento, le immagini vengono catturate ogni 1 secondo per 15 secondi dopo lo sbiancamento. L'intervallo di tempo dovrebbe essere regolata in base alle diverse proteine ​​target e diversi disegni sperimentali (Fig. 1). </li><li> Salvare le immagini. </li></ol> 3. Analisi dei dati <ol><li> Aprire le immagini con il software ImageJ. </li><li> Allineare la pila di immagini utilizzando lo strumento di allineamento ('plugins' → 'pile - mischiare' → 'allineare le fette in pila' → 'corpo rigido' 'traduzione' e / o) in ImageJ, in modo che la colonna vertebrale di interesse non galleggia , in altre parole - rimane nella stessa posizione sull'immagine. </li><li> Misura relativa intensità di fluorescenza della colonna vertebrale di interesse (F s), una regione transfettate ma greggi (controllo), e una regione di fondo (F b) nelle immagini lasso di tempo, utilizzando lo strumento 'intensità v Tempo Monitor' di ImageJ ('plugin '→' pile - mischiare '→' intensità v Tempo Monitor '). La regione di controllo potrebbe essere un pezzo di ben focalizzato dendrite distale. La regione sfondo è un non-fluorescente regione. </li><li> Calcolare il tasso photobleaching (r) confrontando la fluorescenza della regione di controllo prima (F c0) e dopo (F c) photobleaching. r = F c / F c0. </li><li> Normalizzare l'intensità di fluorescenza della colonna di destinazione (F) come segue: F = (F s - F b) / r. </li><li> Curva adatta l'intensità di fluorescenza della colonna vertebrale bersaglio con una sola fase equazione esponenziale del software Prism GraphPad (Fig. 2) o Other software simili. </li><li> Calcolare la frazione mobile (f m) e la frazione di immobile (f) dalle seguenti equazioni: f m = ∞ F / F 0, dove F ∞ è l'intensità di fluorescenza dopo il recupero completo, e F 0 è l'intensità di fluorescenza prima photobleaching. f i = 1 - lettera f m. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: In questo studio, noi dobbiamo fare un esperimento su FRAP maturo neuroni dell'ippocampo. A 18-22 DIV, spine funghi sono già formate. Utilizzando il nostro metodo, i cambiamenti dinamici della fluorescenza in una regione piccola, come una spina dorsale, può essere registrato. Per analizzare il processo di recupero di fluorescenza EGFP, prendiamo 5 immagini come controlli prima dello sbiancamento e poi 1 immagine ogni 1 secondo subito dopo lo sbiancamento per 15 secondi. La risoluzione dell'immagine è sufficiente per l'analisi quantitativa. I profili di recupero di fluorescenza di tag proteine ​​fluorescenza sono altamente riproducibili. Abbiamo anche brevemente illustrato come definire le frazioni mobile e immobile di una proteina a fluorescenza, utilizzando ImageJ e software Prism GraphPad. Il metodo FRAP e analisi mostriamo qui può essere ampiamente utilizzato nel campo delle neuroscienze, biologia cellulare e altri studi. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. FRAP misure di fluorescenza EGFP in una spina da un neurone dell'ippocampo colta. Le frecce rosse indicano il tempo di photobleaching. Fotografie rappresentano la stessa area prima (Pre) e 0, 1, 5, 10, 15 secondi dopo photobleaching. La regione del controllo della colonna vertebrale, e lo sfondo sono contrassegnate con le lettere S, C e B, rispettivamente. I neuroni sono stati mantenuti a 37 ° C durante l'esperimento. Scala bar, 1 micron. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Curve FRAP di fluorescenza EGFP nel corso di un periodo di 15 secondi. La linea verde mostra la curva originale, la linea rossa indica la curva normalizzata. I puntini sulle curve mostrano il FRAP ogni 1 secondo. Le curve sono stati montati da equazioni esponenziali monofase. La fluorescenza media prima photobleaching è stato contato come 100%. In questo esperimento, la frazione mobile (MF) è del 94% e la frazione di immobile (IF) è del 6%.

<ol><li>Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAP102+is+a+highly+mobile+MAGUK+in+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines.</a> J Neurosci. 30, 4757-4766 (2010).</li>
<li>Grati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+turnover+of+stereocilia+membrane+proteins%3A+evidence+from+the+trafficking+and+mobility+of+plasma+membrane+Ca%282%2B%29-ATPase+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2.</a> J Neurosci. 26, 6386-6395 (2006).</li>
<li>Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., Zhang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+on+Red+Alga+Reveals+the+Fluorescence+Recovery+Is+Ascribed+to+Intrinsic+Photoprocesses+of+Phycobilisomes+than+Large-Scale+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion.</a> PLoS ONE. 4, e5295-e5295 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+with+EosFP+and+other+photoactivatable+marker+proteins+of+the+GFP+family%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family.</a> Expert Rev Proteomics. 3, 361-374 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Sprague, B. L., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+analysis+of+binding%3A+proper+and+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FRAP analysis of binding: proper and fitting.</a> Trends Cell Biol. 15, 84-91 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Analisi FRAP è stato ampiamente utilizzato in vivo e in vitro 1-2 studi. Questa tecnica utilizza comunemente GFP <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Fusion_protein" title="Proteina di fusione">proteine ​​di fusione</a> , anche se potrebbe anche usare proteine ​​di fusione alga rossa 3. Questa analisi è sensibile e può essere utilizzato per caratterizzare la mobilità dei GFP-tagged proteine. Per produrre analisi significativa FRAP, è importante evitare inutili photobleaching prima e durante l&#39;esperimento FRAP. Ci sono due modi per raggiungere questo obiettivo. In primo luogo, la procedura per ricercare e osservare il neurone sperimentale dovrebbe essere veloce. In particolare, l&#39;osservazione di neuroni con un obiettivo 100X per lungo tempo schiarisce in modo significativo la fluorescenza. In secondo luogo, il potere e la scansione laser ad alta frequenza spesso aumentano la possibilità di photobleaching. Quindi, sarà necessario per calcolare il tasso photobleaching in una zona di controllo e poi normalizzare la curva FRAP nella regione sperimentale. Il metodo di normalizzazione è stato descritto nel protocollo (vedere il passaggio 3,3-3,5 per i dettagli). Il passo fotodecolorazione è inoltre fondamentale per garantire buoni risultati FRAP. In questo esperimento, abbiamo candeggina la colonna vertebrale di interesse 10 volte al 100% di trasmissione laser. Questa condizione è sufficiente per sbiancare la fluorescenza di una spina dorsale a livello di fondo in un preparato fisso. Così, abbiamo fissato l&#39;intensità di fluorescenza allo stesso numero da sfondo a 0 secondi dopo photobleaching. A seconda della velocità della prima scansione, una quantità significativa di recupero fluorescenza potrebbe essere già rilevato quando la proteina di interesse è molto mobile. Molte sonde proteina fluorescente sono stati sviluppati per studiare la dinamica delle proteine ​​con FRAP. Un approccio complementare è, per esempio, per utilizzare photoactivatable GFP (GFP-PA), o varianti photoconvertible. Insieme con la tecnica FRAP, questi strumenti stanno diventando indispensabile per gli studi di imaging cellulare dal vivo 4-6.

<table><tbody><tr><td>Piatti in vetro con fondo da 35 mm</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35GC-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trasfezione mammifero CalPhos</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide pEGFP-N1</td><td>Clontech Laboratories</td><td>6085-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale Zeiss</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Zeiss TempModule</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Software GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td>N.A.</td><td></td></tr></tbody></table>

recupero della fluorescenza dopo photobleaching (frap) di fluorescenza proteine ​​tagged in spine dendritiche di colture di neuroni ippocampali

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP è stato utilizzato per quantificare la mobilità dei GFP-tagged proteine. Utilizzando un laser forte eccitazione, la fluorescenza di una proteina GFP-tagged è sbiancato nella regione di interesse. La fluorescenza della regione recupera quando il greggio GFP-tagged proteine ​​al di fuori della regione diffonde nella regione di interesse. La mobilità della proteina viene poi analizzata misurando il tasso di fluorescenza di recupero. Questa tecnica potrebbe essere usata per caratterizzare la mobilità proteine ​​e tasso di turnover. In questo studio, esprimiamo la (enhanced green fluorescent protein) vettore EGFP in colture di neuroni dell&#39;ippocampo. Utilizzando il microscopio confocale Zeiss 710, abbiamo photobleach il segnale di fluorescenza della proteina GFP in una sola colonna vertebrale, e poi prendere le immagini lasso di tempo per registrare il recupero di fluorescenza dopo photobleaching. Infine, si stima la percentuale di frazioni mobile e immobile della GFP in spine, analizzando i dati di imaging con ImageJ e software GraphPad. Questo protocollo FRAP mostra come eseguire un esperimento di base FRAP e come analizzare i dati.

FRAP è stato utilizzato per quantificare la mobilità di Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteine ​​in cellule in coltura. Abbiamo esaminato le frazioni mobile / immobile della GFP, analizzando la percentuale di recupero di fluorescenza dopo photobleaching. In questo studio, FRAP è stato effettuato a dorso di neuroni dell&#39;ippocampo.

Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) di fluorescenza proteine ​​Tagged in spine dendritiche di colture di neuroni ippocampali

La tecnica FRAP è stata utilizzata per quantificare la mobilità di proteine taggate con GFP. Attraverso l'impiego di un laser di eccitazione ad alta intensità, la fluorescenza di una proteina taggata con GFP viene bleachata...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la mobilità della proteina fluorescente verde potenziata misurando il ripristino della fluorescenza dopo fotobleaching (FRAP) della proteina in una regione di interesse. Questo viene ottenuto innanzitutto trasfettando il vettore EGFP in neuroni ippocampali di ratto in coltura. Successivamente, viene effettuata la registrazione FRAP in una spina dendritica di interesse utilizzando un microscopio confocale Zeiss Seven 10.Il tasso di fotodegradazione può quindi essere calcolato utilizzando il software Image J e GraphPad Prism. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la mobilità di EGFP in una spina dendritica di un neurone ippocampale in coltura mediante microscopia confocale. Questo protocollo è stato sviluppato da Chazen in collaborazione con me stesso, Ronald Pet, nonché Ya, Wang Bahar Kisha, e l'autore senior del lavoro originale, Robert Ol, deceduto nel mese di ottobre 2009.Dedicamos questo video alla sua memoria. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della dinamica proteica, come ad esempio il tasso di turnover di una proteina di interesse in una regione di interesse. Iniziare questa procedura coltivando neuroni ippocampali di ratto al diciottesimo giorno embrionale su piatti MatTek da 35 millimetri con fondo in vetro rivestito con polilisina, mantenuti in coltura per 16-18 giorni; trasfettare i neuroni utilizzando il kit di trasfezione mammiferi CloneTech CalFectin prima di iniziare la trasfezione.Conservare il mezzo di coltura originale in un tubo sterile da 15 millilitri per un uso successivo. Riempire ogni piastra da 35 millimetri con 1,5 millilitri di mezzo di Eagle modificato DOL eco 30 minuti prima della trasfezione. Successivamente, combinare 10 microgrammi di DNA plasmidico P-E-G-F-P-N uno con 12,4 microlitri di soluzione di calcio due molare e portare il volume totale a 100 microlitri con acqua sterile.Aggiungere la miscela di DNA, GOCCE PER GOCCE, a 100 microlitri di soluzione salina tamponata al doppio della concentrazione. Vortexare il tampone dopo l'aggiunta di ogni goccia. Dopo aver lasciato riposare la miscela finale a temperatura ambiente per 20 minuti, aggiungere la soluzione di DNA in tampone ai neuroni incubati in DMEM.Incubare i neuroni a 37 gradi Celsius per un'ora e mezza. Al termine dell'incubazione, rimuovere il mezzo contenente fosfato di calcio dalle piastre di coltura e lavare le cellule con DMEM. Ripetere il lavaggio con DMEM per un totale di tre volte.Sostituire il mezzo DMEM con il mezzo di coltura originale prima di rimetterli nell'incubatrice. I neuroni vengono utilizzati per l'esperimento frack da due a quattro giorni dopo la trasfezione. Per iniziare, sostituire immediatamente il mezzo di coltura nella piastra da 35 millimetri con fondo in vetro con soluzione Prewarm Tyro.Viene utilizzato un microscopio confocale Zeiss LSM seven 10 per l'esperimento di frack. Il sistema del modulo termico Zeiss mantiene la temperatura, l'umidità e la percentuale di anidride carbonica del sistema di lavoro. Assicurarsi che la bombola di anidride carbonica sia collegata e che la bottiglia dell'acqua, utilizzata per bilanciare l'umidità, sia riempita d'acqua.Dopo aver configurato il microscopio, individuare un dendrite maturo trasfettato utilizzando l'obiettivo 100x. Se le cellule trasfettate nella piastra sono scarsamente distribuite, cercare la cellula desiderata con l'obiettivo 40x, quindi passare all'obiettivo 100x.Per acquisire le immagini, utilizzare un ingrandimento ottico di cinque volte e una risoluzione di 256 per 256 pixel. Per immagini di un breve tratto di dendrite con diverse spine. Per acquisire le immagini, utilizzare la velocità nominale nove, che richiede 0,5 secondi.Per completare una scansione, impostare il pinhole a due micrometri per ottenere una fluorescenza intensa. Durante l'acquisizione delle immagini, cercare di utilizzare una bassa trasmissione del laser, ad esempio dall'1 al 5%, per evitare il fotoblesamento dell'intera immagine. Successivamente, selezionare lo spino di interesse per questo esperimento.Si scelgono spine dendritiche a fungo con diametro della testa della spina di circa un micrometro per eseguire un esperimento di wrap. Acquisire cinque immagini di controllo prima della fotobleaching, quindi sottoporre la spina di interesse a 10 cicli di fotobleaching al 100% della trasmissione del laser e acquisire immediatamente una serie di immagini dopo la fotobleaching. L'intervallo di tempo deve essere regolato in base alle diverse proteine bersaglio e ai diversi disegni sperimentali.Per questo esperimento, le immagini vengono acquisite ogni secondo per 15 secondi dopo la fotobleaching. Successivamente, salvare le immagini per analizzare i dati. Aprire le immagini con il software ImageJ e allineare la serie di immagini utilizzando lo strumento di allineamento in modo che la spina dorsale di interesse non si sposti e rimanga nella stessa posizione.Sull'immagine, misurare l'intensità di fluorescenza relativa della spina di interesse, che corrisponde a una regione trasfettata ma non sbiancata. Misurare la regione di fondo nelle immagini a intervalli temporali utilizzando lo strumento di monitoraggio dell'intensità rispetto al tempo di ImageJ. Utilizzare una regione non fluorescente come regione di fondo e adattare l'intensità fluorescente con un'equazione esponenziale a una fase mediante il software GraphPad Prism o un software analogo. Infine, calcolare la percentuale di frazione mobile e immobile della fluorescenza mostrata.Di seguito sono riportate le misurazioni di FRAP della fluorescenza di EGFP in uno spino di un neurone ippocampale in coltura. La regione dello spino di controllo e lo sfondo sono indicati, e la freccia rossa indica il momento del fotoblesamento. Fotografie della stessa area sono state scattate prima e a 0, 1, 5, 10 e 15 secondi dopo il fotoblesamento.Le curve FRA della fluorescenza di EGFP sono mostrate per un periodo di 15 secondi, con i punti sulle curve che rappresentano il FRA ogni secondo. Le curve sono state adattate mediante equazioni esponenziali a una fase. La fluorescenza media prima del fotoblesamento è stata considerata pari al 100%. In questo esperimento, la frazione mobile è dell'87% e la frazione immobile è del 13%A.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la mobilità di una proteina marcata con GFP utilizzando la tecnica FRAPPE.

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Impara la tecnica FRAP per studiare la mobilità di proteine EGFP nelle spine dendritiche di neuroni ippocampali di ratto. Questo metodo quantifica le frazioni mobile e immobile della proteina fluorescente.

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