Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) di fluorescenza proteine ​​Tagged in spine dendritiche di colture di neuroni ippocampali

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la mobilità della proteina a fluorescenza verde potenziata misurando il frap della proteina in una regione di interesse. Ciò si ottiene mediante il primo transetto, il vettore EGFP nei neuroni ippocampali di ratto in coltura. La successiva registrazione Fre viene eseguita in una colonna vertebrale di interesse utilizzando un microscopio confocale Zeiss seven 10.

Il tasso di fotosbiancamento può quindi essere calcolato utilizzando Image J e il software GraphPad Prism. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la mobilità dell'EGFP in una colonna vertebrale da un neurone ippocampale in coltura attraverso la microscopia confocale. Questo protocollo è stato sviluppato da Chazen in collaborazione con me, Ronald Pet, così come Ya, Wang Bahar Kisha, e l'autore senior dell'articolo originale, Robert Ol, che è morto nell'ottobre 2009.

Dedichiamo questo video alla sua memoria. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della dinamica delle proteine, come il tasso di turnover di una proteina di interesse in una regione di interesse. Inizia questa procedura coltivando neuroni dell'ippocampo di ratto embrionale del giorno 18 su piastre con fondo di vetro opaco da 35 millimetri rivestite di poli de lisina su neuroni trasfettati in vitro da 16 a 18 giorni utilizzando il kit di trasfezione dei mammiferi Cal Foss della tecnologia clone prima di iniziare la trasfezione.

Conservare il terreno di coltura originale in una provetta sterile da 15 millilitri per un uso successivo. Riempire ogni piatto da 35 millimetri con 1,5 millilitri di terreno eagle modificato di DOL eco 30 minuti prima della trasfezione. Successivamente, combina 10 microgrammi di P-E-G-F-P-N un DNA plasmatico con 12,4 microlitri di soluzione di calcio a due molari e porta il volume totale fino a 100 microlitri con acqua sterile.

Aggiungere la miscela di DNA GOCCIA GOCCIA a 100 microlitri di soluzione salina tamponata con due mucchi. Vorticing del buffer dopo l'aggiunta di ogni goccia. Dopo aver lasciato riposare la miscela finale a temperatura ambiente per 20 minuti, aggiungere la soluzione tampone di DNA ai neuroni incubati DMEM.

Incubare i neuroni a 37 gradi Celsius per un'ora o un'ora e mezza. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno contenente fosfato di calcio dalle piastre di coltura e lavare le cellule con DMEM. Ripetendo il lavaggio DMEM per un totale di tre volte.

Scambia il terreno DMEM con il terreno di coltura originale prima di rimetterli nell'incubatrice. I neuroni vengono utilizzati per l'esperimento del fracking da due a quattro giorni dopo la trasfezione. Per iniziare, sostituire immediatamente il terreno di coltura nella piastra con fondo di vetro da 35 millimetri con la soluzione Prewarm Tyro.

Per l'esperimento del frack viene utilizzato un microscopio confocale Zeiss LSM seven 10. Il sistema del modulo temp Zeiss mantiene la temperatura, l'umidità e la percentuale di anidride carbonica del sistema di lavoro. Assicurarsi che il serbatoio dell'anidride carbonica sia collegato e che la bottiglia d'acqua, che viene utilizzata per bilanciare l'umidità, sia piena d'acqua.

Una volta impostato il microscopio, trova un dendrite maturo e trasfettato con l'obiettivo 100x. Se le cellule trasfettate nel piatto sono sparse, cerca una cella desiderata con l'obiettivo 40x. Quindi passa all'obiettivo 100x.

Per acquisire le immagini, utilizzare uno zoom ottico cinque x e una risoluzione di 2 56 x 2 56 pixel. Immagine di un breve pezzo di dendrite con diverse spine. Per acquisire le immagini, utilizzare la velocità nominale nove, che richiede 0,5 secondi.

Per completare una scansione, impostare il foro stenopeico su due micrometri per ottenere una forte fluorescenza. Quando si scattano immagini, provare a utilizzare una bassa trasmissione laser, ad esempio dall'uno al 5% per evitare lo sbiancamento dell'intera immagine. Quindi, seleziona la colonna vertebrale di interesse per questo esperimento.

Le spine dei funghi con un diametro della testa della spina di circa un micrometro vengono scelte per eseguire un esperimento di avvolgimento. Scatta cinque immagini di controllo prima dello sbiancamento, quindi sbianca la colonna vertebrale di interesse 10 volte al 100% nominaleTrasmissione laser per acquisire una serie di immagini immediatamente dopo lo sbiancamento. L'intervallo di tempo deve essere regolato in base a diverse proteine bersaglio e a diversi disegni sperimentali.

Per questo esperimento, le immagini vengono catturate ogni secondo per 15 secondi dopo lo sbiancamento. Quindi, salva le immagini per analizzare i dati. Apri le immagini con il software Image J Allinea la pila di immagini utilizzando lo strumento allineato in modo che il dorso di interesse non fluttui e rimanga nella stessa posizione.

Sull'immagine misurare l'intensità relativa della fluorescenza della colonna vertebrale di interesse, che è una regione trasfettata ma non sbiancata. Misura la regione di sfondo nelle immagini time-lapse con lo strumento di monitoraggio dell'intensità rispetto al tempo dell'immagine J.Utilizzare una regione non fluorescente poiché la curva della regione di sfondo si adatta all'intensità fluorescente con un'equazione esponenziale monofase nel software GraphPad Prism o in un altro software simile. Infine, calcola la percentuale di frazione mobile e immobile della fluorescenza. Mostrato.

Ecco le misurazioni del frack della fluorescenza dell'EGFP in una colonna vertebrale da un neurone ippocampale in coltura. La regione del controllo della colonna vertebrale e lo sfondo sono contrassegnati e la punta della freccia rossa indica il momento dello sbiancamento delle foto. Le fotografie della stessa area sono state scattate prima e a 0, 1, 5, 10 e 15 secondi dopo lo sbiancamento delle foto.

Le curve FRA della fluorescenza EGFP sono mostrate su un periodo di 15 secondi con i punti sulle curve che rappresentano il FRA ogni secondo. Le curve sono state adattate da equazioni esponenziali monofase. La fluorescenza media prima del fotosbiancamento è stata conteggiata come 100%In questo esperimento, la frazione mobile è dell'87% e la frazione immobile è del 13%A.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la mobilità della proteina marcata con A GFP utilizzando la tecnica FRAPPE.