Name: Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Scopri l'imaging time-lapse di cellule progenitrici neurali nel proencefalo di Danio rerio mediante elettroporazione e microscopia confocale. Questo metodo consente l'analisi in vivo dello sviluppo clonale nel sistema nervoso centrale.

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Questo lavoro è stato sostenuto da theNIH grantNS042626. Ringraziamo Thorn Kurt e UCSF Nikon Imaging centro per l&#39;assistenza con l&#39;imaging.

1. Preparazione di embrioni di zebrafish <ol><li> Due giorni prima elettroporazione, istituito gabbie di accoppiamento dei pesci di tipo selvatico con divisori per separare i maschi dalle femmine. </li><li> Un giorno prima elettroporazione, tirare i divisori in accoppiamento gabbie a partire dal giorno precedente. </li><li> Raccogliere embrioni e incubare 50 embrioni fecondati in 30 ml di mezzo embrionale contenente 0,003% phenylthiourea (PTU) a 28.5 ° C. </li><li> Il giorno della elettroporazione, dechorionate gli embrioni manualmente con una pinza sottile (Inox 5, Dumont elettronico, Svizzera), quando gli embrioni raggiungono lo stadio di sviluppo di 22hpf. Poi il trasferimento degli embrioni a 3 10ml elettroporazione Ringer (180 mM NaCl, KCl 5mM, 1.8 mM CaCl2, 5 mM pH Hepes 7,2) contenente 0,003% PTU. </li><li> Aggiungere 420 microlitri tricaine stock (4mg/ml) per l'elettroporazione 10ml suoneria per anestetizzare gli embrioni. </li></ol> 2. Preparazione per elettroporazione <ol><li> Aghi da iniezione di vetro sono stati estratti dai capillari (1,2 mm di diametro, 0,9 mm ID, con filamento) su un Flaming-Brown P897 estrattore (Sutter Instruments, Novato, CA, USA). La punta dell'ago è stata interrotta con una pinza per ottenere un fine tagliente come mostrato nella figura 1D. Il diametro della punta dovrebbe essere di circa 10 micron e l'angolo di rastremazione dovrebbe essere di circa 30 gradi. </li><li> Preparare 0,8% e 1% a basso punto di fusione agarosio (Shelton Scientific, Inc. catalogo # IB70050) in soluzione di Ringer elettroporazione. Aliquota della soluzione di agarosio in tubi di ml 2 microcentrifuga. Mantenere le aliquote in un blocco di calore a ~ 37 ° C. </li><li> Il sistema Gal4/UAS è usato per guidare l'espressione genica nelle cellule progenitrici neurali di embrioni elettroporate. Due plasmidi sono utilizzati: plasmide EF1α-GFF-PT2KXIG, in cui è guidato Gal4FF dal EF1α promotore onnipresente, e plasmide UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG. </li><li> Preparare EF1α-GFF-PT2KXIG e UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG DNA plasmidico utilizzando GenEluteTM HP plasmidi Midiprep Kit (Sigma). </li><li> I plasmidi vengono poi concentrati da sodio acetato / etanolo precipitazione alla concentrazione finale di 1-2 mg / mL in 10 mM Tris Cl ¯ (PH 8,5). </li><li> Mescolare le due plasmidi e diluire con nucleasi-free H2O ad una concentrazione finale di 500 ng / mL per ogni plasmide. L'aggiunta di rosso fenolo (diluito volume totale 1 / 10) per la soluzione è preferita per la visualizzazione di consegna. Tenere la soluzione di DNA su ghiaccio. </li><li> Poco prima elettroporazione, ritardare l'ago per l'iniezione con 2 microlitri soluzione di DNA e regolare il volume di iniezione a 2 nl. </li></ol> 3. Elettroporazione <ol><li> Un microscopio a dissezione stero (Zeiss Stemi 2000 con un ingrandimento massimo di 50x), una pressione di iniezione (Narishige IM 300 microinjector), due micromanipolatori (WPI M3301R, strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL, USA), e uno stimolatore elettrico (SD9 piazza impulso stimolatore, Erba Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, USA) sono impostati come mostrato nella Figura 1A. </li><li> Per montare gli embrioni, immergere 2 embrioni di 1% a basso punto di fusione agarosio. Poi rimuovere immediatamente gli embrioni dal agarosio con una pipetta di vetro. </li><li> Mettere gli embrioni in un coperchio di plastica rovesciata piastra Petri in singole gocce di agarosio. Orientare gli embrioni delicatamente con una sonda ad una dorsale in fibra-up prima posizione l'agarosio si solidifica in modo che il prosencefalo è accessibile sia per gli elettrodi e l'ago microiniezione (Figura 1B). Gli embrioni devono essere montate nei singoli agarosio gocce. </li><li> Manipolare gli elettrodi con il micromanipolatore sinistra. Inserire gli elettrodi nella agarosio come mostrato nella Figura 1B. Personalizzati platino iridio elettrodi bipolari parallelo 125 micron di diametro e distanziati 500 micron a parte sono utilizzati per l'elettroporazione (FHC, catalogo PBSA0575). </li><li> Inserire l'ago microiniezione nel ventricolo proencefalo e iniettare mix 4NL DNA, come fluire di liquido rosso e il gonfiore del ventricolo può essere osservato. </li><li> Immediatamente, una 28,5 V impulso della durata di 1 millisecondo è stato applicato manualmente. Poi invertire la polarità e applicare un altro 28,5 V impulso della durata di 1 millisecondo. Questo si tradurrà in etichettatura mosaico bilaterale del proencefalo cellule progenitrici neurali. </li><li> Dopo l'elettroporazione di 10 embrioni, aggiungere 5 ml di media embrionale per coprire gli embrioni e la buccia di agarosio con un coltello microchirurgica per liberare gli embrioni. </li><li> Trasferire gli embrioni elettroporate per un piatto fresco di 30 ml di mezzo embrionale contenente 0,003% PTU e incubare a 28.5 ° C. </li></ol> 4. Montaggio e Time-lapse dell'immagine in tempo reale <ol><li> Circa 4 ore dopo l'elettroporazione, il segnale EGFP è osservabile se osservato al microscopio epifluorescente dissezione. </li><li> Cinque ore dopo l'elettroporazione, selezionare gli embrioni con il mosaico, ma espressione di EGFP molto forte nella regione proencefalo. </li><li> Trasferire gli embrioni selezionati per media 10ml embrionale contenente 0,003% PTU. </li><li> Aggiungere 420 microlitri tricaine stock (4mg/ml) al embrionale 10ml medio to anestetizzare gli embrioni. </li><li> Per montare gli embrioni, immergere 1 embrione nello 0,8% di agarosio a basso punto di fusione. Poi rimuovere immediatamente l'embrione dal agarosio con una pipetta di vetro e posto l'embrione al centro di un piatto di 35 millimetri cultura fondo di vetro (MatTek società, parte # P35GC-1.5-10-C, <a href="http://www.glass-bottom-dishes.com/">www.glass-bottom-dishes.com</a> ) . </li><li> Orientare gli embrioni delicatamente con una sonda ad una dorsale in fibra-up prima posizione l'agarosio si solidifica. </li><li> Porre la capsula correttamente sul palcoscenico temperatura controllata del microscopio confocale come mostrato in figura 1C (Usiamo una Nikon C1 microscopio confocale spettrale con in alto a destra obiettivi). Regolare la temperatura a 28,5 ° C. </li><li> Aggiungere 3 ml 28,5 ° C preriscaldato medio embrionale contenente 0,003% PTU per coprire l'embrione. L'embrione è ora pronto per l'imaging. </li><li> Eseguire time-lapse imaging dal vivo con un intervallo fisso con un obiettivo d'acqua ad immersione. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Mostrato nella Figura 2 sono selezionati fotogrammi di un time-lapse confocale vivo dell'embrione elettroporate di EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP a 22 HPF. <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Apparatus set-up. (A) L'assemblea di attrezzature elettroporazione: l'erba SD9 piazza impulso stimolatore (i), la micromanipolatore sinistra (ii), gli elettrodi (iii), la dissezione microscopio Zeiss (iv), l'ago di iniezione (v), il micromanipolatore destra (vi) e la Narishige IM 300 microinjector (vii). (B) La posizione relativa degli elettrodi (i), il ventricolo proencefalo (ii) e l'ago per iniezione (iii). Notare il colore rosso soluzione di DNA è stato iniettato nel ventricolo proencefalo. (C) Il montaggio delle immagini in diretta su microscopio confocale Nikon C1: il regolatore di temperatura (i), l'acqua immergendo obiettivo len (ii) e l'embrione elettroporate incorporato in agarosio a basso punto di fusione in un piatto di cultura fondo di vetro (iii) (D ) Immagine di un ago tirato e tagliato per microiniezione di DNA. <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fotogrammi selezionati di 18 ore di time-lapse confocale vivo dell'embrione elettroporate con EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP a 22 HPF. Superficie ventricolo si trova sul lato inferiore di ogni telaio immagine. Barra di scala rappresenta 10 micron.

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414, 112-117 (2001).</li>
<li>G#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+DNA%2C+RNA%2C+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li>
<li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+methods+for+in+vivo%2C+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural. Dev. 2, 6-6 (2007).</li>
<li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol. Biol. 546, 145-151 (2009).</li>
<li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish%3A+a+new+tool+to+study+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo video, si dimostra un metodo per time-lapse immagini dal vivo di cellule progenitrici neurali a livello clonale nel proencefalo zebrafish via di sviluppo. Abbiamo testato e modificato i protocolli esistenti elettroporazione 4-6 a geneticamente e fluorescente etichetta singole cellule progenitrici neurali. Un albero lignaggio composto da cellule progenie clonale relativi possono essere stabiliti dal momento che solo poche cellule sono state scarsamente etichettati con un voltaggio relativamente basso...

time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo zebrafish proencefalo

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Schemi precisi di divisione, migrazione e differenziazione delle cellule progenitrici neurali sono cruciali per il corretto sviluppo del cervello e 1,2 funzione. Per capire il comportamento delle cellule progenitrici neurali nel complesso in un ambiente vivo, time-lapse immagini dal vivo delle cellule progenitrici neurali in un cervello intatto è criticamente necessaria. In questo video, sfruttiamo le caratteristiche uniche di embrioni di zebrafish per visualizzare lo sviluppo delle cellule progenitrici neurali proencefalo in vivo. Noi usiamo per elettroporazione geneticamente e scarsamente etichetta singole cellule progenitrici neurali. In breve, il DNA che codifica per i costrutti marcatori fluorescenti sono stati iniettati nel ventricolo proencefalo di 22 ore dopo la fecondazione (HPF) embrioni di zebrafish e impulsi elettrici sono stati consegnati immediatamente. Sei ore più tardi, gli embrioni di zebrafish elettroporate sono stati montati con agarosio a basso punto di fusione in fondo la cultura piatti di vetro. Fluorescente cellule progenitrici neurali sono state poi ripreso per 36 ore con intervalli fissi al microscopio confocale utilizzando lenti dell&#39;obiettivo acqua immersione. L&#39;attuale metodo fornisce un modo per acquisire conoscenze nel vivo nello sviluppo delle cellule progenitrici neurali proencefalo e può essere applicato ad altre parti del sistema nervoso centrale dell&#39;embrione zebrafish.

Il video presente mostra un metodo che sfrutta la combinazione di elettroporazione e microscopia confocale per eseguire l&#39;imaging in diretta su singole cellule progenitrici neurali nel proencefalo zebrafish via di sviluppo.<em&gt; In vivo</em&gt; Analisi dello sviluppo delle cellule progenitrici neurali proencefalo a livello clonale può essere raggiunto in questo modo.

Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

I modelli precisi di divisione, migrazione e differenziamento delle cellule progenitrici neurali sono cruciali per il corretto sviluppo e funzionamento del cervello1,2. Per...

L'obiettivo del seguente esperimento è osservare lo sviluppo in vivo di singole cellule progenitrici neurali del proencefalo mediante imaging in tempo reale a intervalli di tempo su embrioni di pesce zebra. Questo viene ottenuto tramite elettroporazione di costrutti di DNA codificanti marcatori fluorescenti che etichettano in modo sparso quattro cellule progenitrici neurali cerebrali. Gli embrioni elettroporati vengono anestetizzati, montati in agarosio a basso punto di fusione e sottoposti a microscopia confocale a intervalli di tempo.I risultati mostrano lo sviluppo in vivo di un particolare progenitore neurale del proencefalo. Questo metodo può fornire informazioni sullo sviluppo in vivo delle cellule neuroprogenitrici del proencefalo. Può inoltre essere applicato ad altre regioni del sistema nervoso centrale, come la membrana, il proencefalo e il midollo spinale.Il vantaggio principale di questo metodo rispetto ai metodi esistenti, come l'iniezione di DNA o RNA a livello di singola cellula, è che esso permette di indirizzare con precisione l'interesse specifico in qualsiasi punto temporale dello sviluppo. Questo protocollo inizia il giorno precedente l'elettroporazione programmata. Al mattino, raccogliere 50 embrioni fecondati da zebrafish accoppiati, immergere gli embrioni in un mezzo embrionale contenente feniltiourea o PTU e incubare gli embrioni sommersi per 22 ore a 28,5 gradi Celsius il giorno successivo.A 22 ore post-fecondazione, gli embrioni sono pronti per essere elettroporati. Iniziare rivestendo manualmente gli embrioni con pinzette fini. Trasferire gli embrioni rivestiti in 10 millilitri di soluzione fisiologica per elettroporazione contenente PTU, quindi anestetizzare gli embrioni.Aggiungere 420 microlitri di soluzione madre di Trica a una concentrazione di quattro milligrammi per millilitro alla soluzione. Gli embrioni sono ora pronti per l'elettroporazione. Preparare gli aghi di iniezione necessari per l'elettroporazione. I capillari di vetro vengono tirati e le loro punte spezzate con pinzette per ottenere una punta affilata con punto di fusione basso pari a 0,2.Sono necessarie anche soluzioni di agrobatterio, che includono una sospensione al 1% in soluzione fisiologica per elettroporazione e una soluzione allo 0,8% in mezzo embrionale per il montaggio. Aliquotare le due diverse soluzioni di agrobatterio in provette microcentrifuga da due millilitri e tenerle pronte in un blocco termoregolato a circa 37 gradi Celsius. Questo protocollo utilizza il sistema GAL4-UAS per indurre l'espressione genica nelle cellule progenitrici neurali.Vengono utilizzati due plasmidi quando si esprime in modo ubiquo GAL four ff e l'altro esprime GFP in risposta a GAL four ff. Entrambi i plasmidi vengono preparati mediante kit, quindi concentrati a una concentrazione compresa tra uno e due microgrammi per microlitro utilizzando una precipitazione con acetato di sodio ed etanolo in una soluzione di 10 millimolare Tri cl. Dopo aver determinato la concentrazione del plasmide, diluire entrambi i plasmidi in una singola soluzione con acqua priva di nucleasi a 500 nanogrammi per microlitro.A questa concentrazione, verranno valutati insieme per visualizzare la somministrazione della soluzione, colorandola con rosso fenolo al 10% del volume totale della soluzione. La soluzione è ora pronta per l'elettroporazione e deve essere posta sul ghiaccio. L'apparato per elettroporazione è costituito da un microscopio stereoscopico per dissezione con un ingrandimento massimo di 50 x.L'apparato è dotato di un iniettore a pressione d'aria, due micromanipolatori e uno stimolatore elettrico. L'elettrodo sul micromanipolatore sinistro ha elettrodi bipolari paralleli personalizzati in platino-iridio; subito prima dell'elettroporazione, ricaricare l'ago di iniezione con due microlitri di soluzione di DNA e regolare il volume di iniezione a quattro nanolitri. Da questo momento in poi, il protocollo richiede pratica per perfezionare il montaggio: immergere e rimuovere immediatamente due embrioni dalla soluzione di agarosio al 1% a basso punto di fusione.Trasferire ciascun campione con una pipetta di vetro in una goccia separata di agros sulla piattaforma o nella piastra, formando una goccia. Utilizzare una sonda in fibra per orientare delicatamente gli embrioni in posizione dorsale verso l'alto prima che l'agros si solidifichi. Questo renderà il proencefalo accessibile sia agli elettrodi sia all'ago per microiniezione.Ripetere questo processo fino a quando tutte e 10 le gocce non contengono tutti gli embrioni preparati. Inserire gli elettrodi nell'aeros e introdurre l'ago di microiniezione nel ventricolo anteriore del cervello. Iniettare ora quattro nanolitri della miscela di DNA.Osservare il flusso e fare attenzione al rigonfiamento del ventricolo. Non appena si osserva il rigonfiamento, applicare due gruppi di quattro impulsi di 0,5 volt, della durata di un millisecondo ciascuno. Questi otto impulsi devono essere erogati con polarità opposta.Il risultato è un'etichettatura mosaicale bilaterale delle quattro cellule progenitrici neurali del cervello. Ora rimuovere l'ago di iniezione dal proencefalo e spostare il preparato sull'embrione successivo. Ripetere il processo di iniezione ed elettroporazione su ciascun embrione rimanente.Dopo aver elettroporato tutti e 10 gli embrioni, versare cinque millilitri di mezzo embrionale sugli embrioni per trasferirli. Rimuovere le aros con un bisturi microchirurgico e spostarli in una nuova piastra contenente 30 millilitri di mezzo embrionale. Prima dell'acquisizione delle immagini, incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius per circa quattro ore, quattro ore dopo l'elettroporazione.Il segnale EGFP è osservabile. Se osservato al microscopio stereoscopico a fluorescenza episcopica un'ora o cinque ore dopo l'elettroporazione, selezionare gli embrioni con espressione EGFP fortemente mosaicale ma intensa nella regione del cervello. Trasferire gli embrioni selezionati in 10 millilitri di mezzo e anestetizzarli aggiungendo 420 microlitri di soluzione stock di trica a una concentrazione di quattro milligrammi per millilitro.L'imaging verrà eseguito sul palchetto controllato in temperatura di un microscopio confocale, dotato di obiettivi eretti. Preparare il microscopio impostando la temperatura del palchetto a 28,5 gradi Celsius. Riscaldare anche il mezzo embrionale a 28,5 gradi Celsius.Per montare un embrione, utilizzare una pipetta di vetro per immergerlo brevemente nell'agarosio e posizionarlo al centro di una piastra per colture da 35 millimetri con fondo in vetro. Utilizzando una sonda in fibra, orientare delicatamente gli embrioni in posizione dorsale superiore prima che l'agarosio si solidifichi e coprirli con tre millilitri di mezzo preriscaldato. L'embrione è ora pronto per l'acquisizione di immagini in tempo reale a intervalli fissi mediante un obiettivo ad immersione in acqua. Qui sotto sono mostrate immagini al microscopio confocale in time-lapse di una singola cellula progenitrice neurale.Utilizzando questo metodo, possiamo osservare questa cellula migrare e dividersi due volte tra 28,5 e 41,5 ore dopo la fecondazione. Minimizzando la potenza del laser e rinnovando il mezzo embrionale, è possibile continuare a ottenere immagini fino a 60 ore dopo la fecondazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un'elettroporazione su cellule neurogeniche geneticamente marcate e in video, nonché di come manipolare gli embrioni con gli elettrodi.Per l'acquisizione confocale a livello TimeLapse, una volta acquisita padronanza, questa elettroporazione può essere eseguita in meno di un'ora se effettuata correttamente.

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