Name: Finger-stick Metodologia di campionamento del sangue per la determinazione di esercizio apoptosi indotta da linfociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Impara la metodologia di campionamento del sangue da puntura del dito per analizzare l'apoptosi dei linfociti indotta dall'esercizio fisico. Questa procedura rapida e minimamente invasiva migliora la precisione delle misurazioni.

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Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione Facoltà Nuovo dal Consiglio di Facoltà borsa di studio alla Western Kentucky University.

1. Finger-Stick prelievo di sangue <ol><li> Raccolta di sangue intero è di solito presi a riposo per una misura di base (di solito dopo 10-15 resto seduto min), durante o immediatamente dopo un attacco di esercizio, e per tutto il periodo post-esercizio (in genere da 1-3 ore dopo la cessazione del esercizio fisico). </li><li> Utilizzando le precauzioni universali, in primo luogo sterilizzare la punta del dito con il 70% di alcool isopropilico. </li><li> Successivamente, la puntura il sito utilizzando un bisturi automatici o dispositivi simili. Anche se si usa un 30-gauge bisturi per offrire il comfort soggetto, un ago di diametro più ampio potrebbero essere utilizzati. </li><li> Eliminare la prima goccia di sangue, e poi raccogliere in provette di sangue capillare o microvettes trattati con litio eparina per prevenire la coagulazione. </li></ol> 2. Fenotipizzazione delle cellule e colorazione apoptosi <ol><li> Aggiungere 10 microlitri di sangue intero eparinizzato al pannello di anticorpi titolati in 250 microlitri di buffer vincolanti (vedi tabella 1 schema). Abbiamo usato un fattore di diluizione 1:20 con successo, ma ogni laboratorio dovrebbe titolo i loro reagenti per determinare la migliore soluzione di lavoro. Tabella 1. Pannello di anticorpi per la determinazione di esercizio apoptosi indotta in sottoinsiemi dei leucociti. Apoptosi precoce è stato definito mediante l&#39;espressione di annessina V, mentre l&#39;apoptosi in ritardo è stato definito con un doppio etichettatura positiva con annessina V e 7-AAD. Le cellule necrotiche erano annessina V e 7-AAD + solo le celle. <table border="1"><tbody><tr><td> Provetta 1 </td><td> Provetta 2 </td><td> Tubo 3 </td><td> Tubo 4 </td></tr><tr><td> Solo le cellule del tubo </td><td> Annessina V - FITC </td><td> Annessina V - FITC </td><td> Annessina V - FITC </td></tr><tr><td></td><td> Anti CD4 umano - PE </td><td> Anti umane CD8 - PE </td><td> Anti umani CD19 - PE </td></tr><tr><td></td><td> 7-AAD </td><td> 7-AAD </td><td> 7-AAD </td></tr><tr><td></td><td> Anti umani CD45RA - APC </td><td> Anti umani CD45RA - APC </td><td></td></tr></tbody></table> 7-AAD = 7-amino-actinomicina D, APC = Allophycocyanin, CD4 = linfociti T helper, CD8 = soppressore / linfociti T citotossici, i linfociti B CD19 =, CD45RA = sottopopolazioni cellulari ingenuo, FITC = isotiocianato di fluorescina, PE = ficoeritrina. </li><li> Incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti. </li><li> Centrifugare a 1075 xg per 5-10 minuti. </li><li> Decantare, aggiungere 300 ul Red Cell Lysis Buffer sangue, e completamente vortice. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. </li><li> Aggiungere 300 ml di PBS per fermare la reazione di lisi. </li><li> Centrifugare a 1075 xg per 5-10 minuti. </li><li> Decantare, rack, e aggiungere 50 microlitri di buffer vincolanti. </li><li> Analizzare mediante citometria di flusso. </li></ol> Si raccomanda, come minimo, i seguenti controlli da utilizzare: un solo tubo di cellule per servire come controllo negativo nel rilevare autofluorescenza sfondo, e le provette contenenti ciascuno fluorocromo per impostare compensazione durante l&#39;impostazione iniziale della citometria a flusso. Inoltre, abbiamo utilizzato perline standard di compensazione con successo per creare i nostri esperimenti.

<ol><li>Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+does+not+contribute+to+the+blood+lymphocytopenia+observed+after+intensive+and+downhill+treadmill+running+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Res.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans.</a> Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).</li>
<li>Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise%2C+lymphocyte+apoptosis+and+F2-isoprostanes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).</li>
<li>Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+apoptosis+after+exhaustive+and+moderate+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise.</a> J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).</li>
<li>Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise+does+not+cause+lymphocyte+DNA+damage+or+increased+apoptosis+in+well-trained+endurance+athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).</li>
<li>Wang, J. -S., Huang, Y. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exercise+intensity+on+lymphocyte+apoptosis+induced+by+oxidative+stress+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).</li>
<li>Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+apoptosis+of+lymphocytes+depends+on+training+status%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).</li>
<li>Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+treatment+influences+the+yield+of+apoptotic+lymphocytes+after+maximal+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Un mini-invasiva procedura di raccolta dei campioni e successiva analisi è dimostrato per l&#39;analisi delle fasi sia precoce e tardiva di esercizio apoptosi indotta da linfociti. E &#39;anche possibile escludere con chiarezza quelle cellule, che sono necrotico, e non apoptotica. Questa procedura risolve gli inconvenienti ed il disagio associato a venipuntura invasiva della regione antecubitale in momenti diversi, prima, durante e immediatamente dopo l&#39;esercizio o attribuisce un catetere per tutta la durata della s...

<table><tbody><tr><td>Tampone di legame per citometria a flusso</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per la lisi dei globuli rossi</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo lancetta</td><td>Accu Check Soft Touch</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi capillari</td><td>Tubi capillari eparinizzati</td><td>Chase Scientific Glass, Inc.</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>GmC Lab</td><td>Gilson, Inc.</td><td>PMS-880</td><td></td></tr><tr><td>Annexina V-FITC coniugata</td><td></td><td>Biovision Inc.</td><td>K201-400-1</td><td></td></tr><tr><td>CD4-PE coniugata</td><td>Anti-umano, clone RPA-T4</td><td>eBioscience</td><td>12-0049-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8-PE coniugata</td><td>Anti-umano, clone OKT8</td><td>eBioscience</td><td>12-0086-73</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PE coniugata</td><td>Anti-umano, clone HIB19</td><td>eBioscience</td><td>12-0199-42</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione colorante per vitalità 7-AAD</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-6993-50</td><td></td></tr><tr><td>CD45RA-APC coniugata</td><td>Anti-umano, clone HI100</td><td>eBioscience</td><td>17-0458-42</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>C6</td><td>Accuri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

finger-stick metodologia di campionamento del sangue per la determinazione di esercizio apoptosi indotta da linfociti

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

L&#39;esercizio fisico è uno stimolo fisiologico in grado di indurre l&#39;apoptosi nelle cellule del sistema immunitario. Ad oggi, diverse limitazioni sono state identificate con la misura di questo fenomeno, in particolare relativi alla quantità di tempo necessaria per isolare e trattare un campione di sangue prima della valutazione della morte cellulare. A causa di questo, è difficile stabilire se un aumento segnalato in apoptosi delle cellule immunitarie possono essere contribuito l&#39;effetto reale di esercizio del sistema, o un riflesso del tempo e di elaborazione necessaria per ottenere alla fine questa misura. In questo articolo si dimostra una procedura rapida e mini-invasiva per l&#39;analisi di esercizio apoptosi indotta da linfociti. A differenza di altre tecniche, il sangue intero viene aggiunto a un pannello di anticorpi immediatamente dopo l&#39;ottenimento di un campione. Dopo il periodo di incubazione, i globuli rossi vengono lisati ed i campioni sono pronti per essere analizzati. L&#39;uso di un dito-stick procedura di campionamento riduce il volume di sangue richiesto, e riduce al minimo il disagio ai soggetti.

L&#39;esercizio fisico è in grado di indurre l&#39;apoptosi nelle cellule del sistema immunitario. Ci sono limitazioni concernenti le misure varie, in particolare relativi alla quantità di tempo necessaria per isolare e trattare un campione di sangue prima della valutazione. È dimostrata una procedura rapida e mini-invasiva per l&#39;analisi di esercizio apoptosi indotta da linfociti.

Finger-stick Metodologia di campionamento del sangue per la determinazione di esercizio apoptosi indotta da linfociti

L'esercizio fisico è uno stimolo fisiologico capace di indurre l'apoptosi nelle cellule immunitarie. A oggi, sono state identificate diverse limitazioni relative alla misurazione...

Ciao, sono James Volta del programma di Scienze dell'Esercizio nel Dipartimento di Scienze dell'Attività Fisica, Ricreazione e Sport della Western Kentucky University. Oggi vi mostreremo la procedura che abbiamo sviluppato e che utilizziamo per misurare l'apoptosi dei linfociti indotta dall'esercizio fisico. Dunque, diamo un'occhiata.Un campione di sangue da puntura del dito viene ottenuto utilizzando precauzioni universali per la raccolta della goccia di sangue. La punta del dito viene sterilizzata, quindi perforata. La prima goccia di sangue viene rimossa con uno straccio, quindi il sangue viene aspirato in tubi capillari o in microletti.10 microlitri di sangue intero sono stati prelevati con pipetta e trasferiti in un pannello di anticorpi contenente fluorocromi appropriati per la citometria a flusso, tampone di fissaggio, annexina V, sette amino attinina D, CD4, CD8 o CD19 e CD45ra, oltre a un tubo contenente solo cellule; abbiamo utilizzato perle di compensazione come controllo per facilitare l’impostazione dei nostri esperimenti. Il campione viene mescolato accuratamente mediante vortex e quindi lasciato incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti. Dopo l'incubazion

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