Name: Neuromodulazione e mitocondriale di trasporto: Imaging Live in neuroni dellippocampo oltre durate a lungo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Scopri come visualizzare il trasporto mitocondriale nei neuroni dell'ippocampo coltivati con microscopia a fluorescenza a lungo termine. Questo metodo rivela come i neuromodulatori modulino la dinamica mitocondriale.

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Vorremmo ringraziare Donald Hutson per aver contribuito la sua competenza tecnica e grande abilità durante la progettazione e la realizzazione della fase-top-incubatore. Siamo anche grati a Ayda Dashtaei per la sua eccellente assistenza tecnica. Tutto il lavoro è stato sostenuto dal Neurosciences Research Foundation.

<ol><li>Ligon, L. A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+mitochondria+in+the+axons+and+dendrites+of+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons.</a> J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).</li>
<li>Miller, K. E., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+coherent+low+velocity+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria.</a> J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).</li>
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<li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).</li>
<li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li>
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<li>Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFedoroff%2C+S+%22Protocols+for+neural+cell+culture%22">Protocols for neural cell culture</a>. , 3rd edn, Humana Press. (2001).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+stimulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).</li>
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<li>Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+regulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. , e10848-e10848 (2010).</li>
<li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol Ther. 1, 31-38 (2000).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Impiegando lentivirus-mediata espressione di una proteina fluorescente mirata ai mitocondri in infetti neuroni coltivati ​​e un poco costoso laboratorio di un palco allestito-top incubatore che permette l&#39;imaging di cellule vive per periodi estesi, siamo stati in grado di indagare il legame tra movimento mitocondriale e segnali neuromodulatori , come la serotonina (5-HT), dopamina (DA) e acetilcolina (ACh). I nostri studi hanno permesso di chiarire una via di segnalazione che, per la prima volta, i collegamenti il ​​traffico di mitocondriali ai cambiamenti nell&#39;attività dei neuroni-modulata da neurotrasmettitori come la 5-HT e DA - che sono al centro della funzione neurale. Troviamo che l&#39;uso di proteine ​​fluorescenti mirato permette l&#39;osservazione dei mitocondri etichettate in vita i neuroni in coltura per lunghi periodi che possono essere fisiologicamente più rilevanti rispetto alla durata molto più breve che sono possibili utilizzando coloranti vitali. Inoltre, l&#39;intensità del segnale proteina fluorescente ci permette di mantenere tempi di esposizione brevi durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine, riducendo al minimo la possibilità di photobleaching o fototossicità. Infine, uno stadio-top semplice e poco costoso incubatore che mantiene la temperatura ambiente, umidità e livelli di CO 2, riducendo al minimo l&#39;evaporazione dei media, ci permette di seguire il movimento mitocondriale in vita i neuroni nel giro di ore o anche giorni. I ricercatori che desiderano fabbricare un palcoscenico superiore incubatore per le osservazioni a lungo termine dei mitocondri dei neuroni vivere non è necessario seguire i dettagli precisi del nostro design, a condizione che le proprietà dei materiali utilizzati (ad esempio, membrana permeabile ai gas per evitare l&#39;evaporazione dei media ) ei principi applicati (ad esempio, il controllo della temperatura e dell&#39;umidità, tamponamento del pH, della manutenzione di osmolarità) sono generalmente in linea con quanto descritto in questo protocollo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Quantità </th><th> Descrizione (e della posizione in Figura 1) </th></tr><tr><td> 1 </td><td> Incubatore di coltura tissutale (H) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Resistente al calore custodia in plastica (delrin o comparabili) (A) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Telaio in plastica per il coperchio 35 millimetri GBM (per l&#39;apposizione della membrana a scatola di Petri) (M) </td></tr><tr><td> 1-2 </td><td> lineare ft chiaro PTFE (Teflon) membrana di materiale </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Viti in ottone pollice </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Piccole resistenze dissipatore 10kOhm (utilizzati come elementi di riscaldamento all&#39;interno di stage-superiore della custodia incubatore) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Trasformatore (fornitura di corrente da 9V a resistenze) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Terrario regolatore di temperatura e sonda (regolazione termostatica del potere di resistenze dissipatore tramite trasformatore) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2000ml Beuta (marmitta per la soppressione delle vibrazioni nel tubo prima fase-top incubatore) (K) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 / 8 &quot;foglio sorbotano (materiale della guarnizione per la base del palco-top incubatore) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> ABS a tenuta d&#39;aria (o assimilabili) scatola di plastica (alloggiamento per la pompa dell&#39;acquario) (J) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Acquario di pompa (I) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Piccola ventola di raffreddamento del computer </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Contenitore in plastica per la ventola di raffreddamento (L) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Trasformatore 9V per la ventola di raffreddamento del computer </td></tr><tr><td> 20-30ft </td><td> Nalgene o tubi silicone (collegamento tra la cultura del tessuto e stadio-top incubatori; trappole umidità) (F, G, N) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Rubinetti in plastica (per aprire e chiudere il flusso d&#39;aria prima e dopo la fase-top incubatore) (O) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Spinato ottone raccordi per tubi flessibili (per i collegamenti dei tubi per / da stadio-top incubatore e corpo pompa acquario) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Accoppiatori rapidi in ottone (per connessioni tubo da / per stage-top incubatore) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Accoppiatori rapidi in ottone (per connessioni tubo da / per stage-top incubatore) </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Stage-top incubatore parti: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7280-5MG </td></tr><tr><td> laminina </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243217001 </td></tr><tr><td> 35 millimetri con fondo di vetro piatti </td><td> MatTek </td><td> P35GC-0-14-C </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Life Technologies </td><td> 10567 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Life Technologies </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Ricchi di lipidi BSA </td><td> Life Technologies </td><td> 11020-021 </td></tr><tr><td> L-Asparagina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380-100G </td></tr><tr><td> L-prolina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8381-100G </td></tr><tr><td> La vitamina B-12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V2876-100MG </td></tr><tr><td> 5-HT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9523-25mg </td></tr><tr><td> 8-OH-DPAT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8520-25mg </td></tr><tr><td> Dopamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8502-5G </td></tr><tr><td> Bromocriptina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2134-25mg </td></tr><tr><td> SKF38393 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D047-100MG </td></tr></tbody></table>

neuromodulazione e mitocondriale di trasporto: imaging live in neuroni dell&#39;ippocampo oltre durate a lungo

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Per capire il rapporto tra trasporto mitocondriale e la funzione neuronale, è importante osservare il comportamento mitocondriale in vivo neuroni in coltura per la durata estesa 1-3. Questo è ora possibile attraverso l&#39;utilizzo di coloranti vitali e delle proteine ​​fluorescenti con cui i componenti del citoscheletro, organelli e altre strutture nelle cellule viventi possono essere etichettati e poi visualizzati tramite dinamica microscopia a fluorescenza. Per esempio, embrioni di pollo nei neuroni simpatici, il movimento dei mitocondri è stato caratterizzato utilizzando il colorante vitale rodamina 123 4. In un altro studio, i mitocondri sono stati visualizzati nei neuroni del proencefalo ratto mediante trasfezione di mitocondri mirati eYFP 5. Tuttavia, l&#39;imaging di neuroni primari più minuti, ore o addirittura giorni presenta una serie di questioni. Tra questi sono: 1) mantenimento delle condizioni di coltura, quali temperatura, umidità e pH durante lunghe sessioni di imaging, 2) un segnale forte e stabile fluorescente per garantire sia la qualità delle immagini acquisite e misurazione precisa di intensità del segnale durante l&#39;analisi delle immagini; e 3) limitare i tempi di esposizione durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine per minimizzare ed evitare photobleaching fototossicità. Qui, descriviamo un protocollo che permette l&#39;osservazione, la visualizzazione e l&#39;analisi del movimento mitocondriale in colture di neuroni dell&#39;ippocampo con alta risoluzione temporale e in condizioni ottimali di supporto vitale. Abbiamo costruito un acquistabile fase-top incubatore che fornisce una buona regolazione della temperatura e il flusso dei gas atmosferici, e limita anche il grado di evaporazione media, assicurando il pH stabile e osmolarità. Questa incubatrice è collegato, tramite tubi di alimentazione e scarico, ad una cultura incubatore standard di tessuto, che fornisce livelli di umidità costante e un&#39;atmosfera di 5-10% di CO 2 / aria. Questo progetto offre una conveniente alternativa agli incubatori microscopio molto più costosi che non necessariamente garantiscono la vitalità delle cellule di molte ore o anche giorni. Per visualizzare i mitocondri, che infettano le cellule con un lentivirus che codifica per una proteina fluorescente rossa che si rivolge al mitocondrio. Questo assicura un segnale forte e persistente, che, in concomitanza con l&#39;uso di una stabile fonte di luce allo xeno, ci permette di limitare i tempi di esposizione durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine e di tutti, ma preclude photobleaching e fototossicità. Due porte di iniezione sulla parte superiore del palco-top incubatore consente la somministrazione acuta di neurotrasmettitori e altri reagenti destinati a modulare il movimento mitocondriale. In sintesi, lentivirus-mediata espressione di un organello mirati proteina fluorescente rossa e la combinazione del nostro stadio-top-incubatore, un microscopio invertito a fluorescenza convenzionale, telecamera CCD, e la sorgente di luce allo xeno ci permettono di acquisire immagini time-lapse di trasporto mitocondriale in neuroni vita nei periodi più lunghi rispetto a quelli possibili negli studi di distribuzione convenzionali coloranti vitali e off-the-shelf sistemi di supporto vitale.

Noi descriviamo un protocollo che permette l&#39;imaging di mitocondri in vita i neuroni tramite microscopia a fluorescenza su durate lunghe. Imaging per lunghi periodi si realizza attraverso lentivirus-mediata espressione di una proteina fluorescente mitocondri mirata e l&#39;uso di un poco costoso stadio-top incubatore che è stato progettato e costruito nel nostro laboratorio.

Neuromodulazione e mitocondriale di trasporto: Imaging Live in neuroni dell&#39;ippocampo oltre durate a lungo

Per comprendere la relazione tra il trasporto mitocondriale e la funzione neuronale, è fondamentale osservare il comportamento dei mitocondri in colture vive di...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare il trasporto mitocondriale nei neuroni in coltura per periodi prolungati mediante microscopia a fluorescenza su cellule vive. Questo risultato si ottiene innanzitutto etichettando i mitocondri nei neuroni in coltura con una proteina fluorescente mirata a un organo. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'acquisire immagini del trasporto mitocondriale in condizioni di controllo.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'acquisire serie di immagini in time-lapse del trasporto mitocondriale dopo la somministrazione acuta di neuromodulatori come la serotonina. L'ultimo passaggio della procedura è analizzare le serie di immagini in time-lapse acquisite. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano come i neurotrasmettitori modulino il trasporto mitocondriale.Tali risultati si ottengono soltanto mediante l'acquisizione di immagini di mitocondri marcati con fluorescenza in neuroni per periodi prolungati. Il principale vantaggio di questo metodo rispetto alle tecniche esistenti, come l'etichettatura con coloranti vitali o la transfezione transitoria di GFP, è che questo metodo rende possibile effettuare osservazioni a lungo termine del trasporto mitocondriale in neuroni coltivati sani. A dimostrare questa procedura sarà Chen, un ricercatore associato del mio laboratorio, al fine di fornire un ambiente stabilmente riscaldato e umidificato.L'incubatore da microscopio è collegato a un incubatore standard per colture cellulari tramite un circuito chiuso; il coperchio in membrana A-P-F-T-E per piatti di coltura da 35 millimetri con fondo in vetro consente lo scambio gassoso tra la coltura neuronale e l'ambiente all'interno dell'incubatore. Queste e altre caratteristiche permettono l'osservazione a lungo termine di neuroni coltivati in diverse condizioni sperimentali. Trasferire la piastra di coltura contenente neuroni ippocampali coltivati, esprimenti la proteina mito turbo red, in una cappa da coltura cellulare.Sostituire il coperchio in plastica con quello in membrana PFTE e spostare la piastra di coltura sul microscopio. Fissare la base dell'incubatore alla platina del microscopio, quindi posizionare con attenzione la piastra di coltura coperta dalla membrana. Nell'apertura incassata, allineare l'involucro dell'incubatore con i perni in acciaio presenti sulla base dell'incubatore e abbassare delicatamente l'involucro sulla base.Serrare le viti a testa zigrinata fino a ottenere una buona tenuta tra l'involucro e la base. Accendere il controller della ruota dei filtri del microscopio, la sorgente luminosa e la telecamera CCD prima di aprire il software di acquisizione delle immagini. In questo protocollo, viene utilizzato il libro di vetrini numero cinque per l'acquisizione delle immagini.Passare a un obiettivo a immersione in olio da 63 x e abbassare la torretta degli obiettivi. Applicare con attenzione l'olio per immersione sulla superficie dell'obiettivo. Fare clic sull'icona della finestra di messa a fuoco sulla barra degli strumenti e accendere la lampada a campo chiaro spostando il cursore della lampada.Per regolare l'intensità della luce, mettere a fuoco un campo di cellule utilizzando gli oculari e individuare una cellula di interesse. Selezionare il filtro XI tre nella scheda del microscopio utilizzando gli oculari, trovare il piano di messa a fuoco per i mitocondri nelle cellule marcate con la proteina mito turbo red, quindi passare alla fotocamera CCD. Fare clic sull'icona di acquisizione immagine sulla barra degli strumenti, partendo da un tempo di esposizione iniziale di 100 millisecondi.Trova l'esposizione ottimale utilizzando i pulsanti prova e trova migliore nella finestra di acquisizione. Nella casella Tipo di acquisizione, seleziona l'opzione acquisizione temporizzata e scegli l'intervallo di imaging desiderato e la durata della sessione di imaging nelle opzioni di acquisizione temporizzata.Avviare l'acquisizione di immagini in time-lapse facendo clic sul pulsante di avvio in basso a destra nella finestra di acquisizione. Dopo aver effettuato una sessione di imaging di controllo, somministrare neurotrasmettitori o altri reagenti attraverso i porti di iniezione posti nella parte superiore dell'incubatore da piastra. Dopo l'aggiunta dell'agonista del recettore della serotonina 8-OH-DPAT, le mitocondrie precedentemente stazionarie, indicate dalla freccia, si muovono lungo l'assone del neurone ippocampale.La velocità media e la direzionalità dei singoli mitocondri vengono riassunte prima dell'aggiunta di serotonina. La maggior parte dei mitocondri è stazionaria; tuttavia, dopo l'aggiunta di serotonina, il 42% dei mitocondri mostra ora un movimento direzionale e percorre distanze maggiori rispetto a quelli che mostrano movimento direzionale in assenza di serotonina. Al contrario, dopo l'aggiunta di dopamina, il 92% dei mitocondri è stazionario negli ultimi 15 minuti di una sessione di acquisizione immagini, seguendo questa procedura.Possono essere eseguiti altri metodi per monitorare più di un segnale al fine di rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, in che modo l'attività del calcio e il trasporto mitocondriale nei neuroni sono correlati.

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