Neuromodulazione e mitocondriale di trasporto: Imaging Live in neuroni dell'ippocampo oltre durate a lungo

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare il trasporto mitocondriale nei neuroni in coltura per periodi prolungati mediante microscopia a fluorescenza su cellule vive. Questo risultato si ottiene innanzitutto etichettando i mitocondri nei neuroni in coltura con una proteina fluorescente mirata a un organo. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'acquisire immagini del trasporto mitocondriale in condizioni di controllo.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'acquisire serie di immagini in time-lapse del trasporto mitocondriale dopo la somministrazione acuta di neuromodulatori come la serotonina. L'ultimo passaggio della procedura è analizzare le serie di immagini in time-lapse acquisite. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano come i neurotrasmettitori modulino il trasporto mitocondriale.

Tali risultati si ottengono soltanto mediante l'acquisizione di immagini di mitocondri marcati con fluorescenza in neuroni per periodi prolungati. Il principale vantaggio di questo metodo rispetto alle tecniche esistenti, come l'etichettatura con coloranti vitali o la transfezione transitoria di GFP, è che questo metodo rende possibile effettuare osservazioni a lungo termine del trasporto mitocondriale in neuroni coltivati sani. A dimostrare questa procedura sarà Chen, un ricercatore associato del mio laboratorio, al fine di fornire un ambiente stabilmente riscaldato e umidificato.

L'incubatore da microscopio è collegato a un incubatore standard per colture cellulari tramite un circuito chiuso; il coperchio in membrana A-P-F-T-E per piatti di coltura da 35 millimetri con fondo in vetro consente lo scambio gassoso tra la coltura neuronale e l'ambiente all'interno dell'incubatore. Queste e altre caratteristiche permettono l'osservazione a lungo termine di neuroni coltivati in diverse condizioni sperimentali. Trasferire la piastra di coltura contenente neuroni ippocampali coltivati, esprimenti la proteina mito turbo red, in una cappa da coltura cellulare.

Sostituire il coperchio in plastica con quello in membrana PFTE e spostare la piastra di coltura sul microscopio. Fissare la base dell'incubatore alla platina del microscopio, quindi posizionare con attenzione la piastra di coltura coperta dalla membrana. Nell'apertura incassata, allineare l'involucro dell'incubatore con i perni in acciaio presenti sulla base dell'incubatore e abbassare delicatamente l'involucro sulla base.

Serrare le viti a testa zigrinata fino a ottenere una buona tenuta tra l'involucro e la base. Accendere il controller della ruota dei filtri del microscopio, la sorgente luminosa e la telecamera CCD prima di aprire il software di acquisizione delle immagini. In questo protocollo, viene utilizzato il libro di vetrini numero cinque per l'acquisizione delle immagini.

Passare a un obiettivo a immersione in olio da 63 x e abbassare la torretta degli obiettivi. Applicare con attenzione l'olio per immersione sulla superficie dell'obiettivo. Fare clic sull'icona della finestra di messa a fuoco sulla barra degli strumenti e accendere la lampada a campo chiaro spostando il cursore della lampada.

Per regolare l'intensità della luce, mettere a fuoco un campo di cellule utilizzando gli oculari e individuare una cellula di interesse. Selezionare il filtro XI tre nella scheda del microscopio utilizzando gli oculari, trovare il piano di messa a fuoco per i mitocondri nelle cellule marcate con la proteina mito turbo red, quindi passare alla fotocamera CCD. Fare clic sull'icona di acquisizione immagine sulla barra degli strumenti, partendo da un tempo di esposizione iniziale di 100 millisecondi.

Trova l'esposizione ottimale utilizzando i pulsanti prova e trova migliore nella finestra di acquisizione. Nella casella Tipo di acquisizione, seleziona l'opzione acquisizione temporizzata e scegli l'intervallo di imaging desiderato e la durata della sessione di imaging nelle opzioni di acquisizione temporizzata.

Avviare l'acquisizione di immagini in time-lapse facendo clic sul pulsante di avvio in basso a destra nella finestra di acquisizione. Dopo aver effettuato una sessione di imaging di controllo, somministrare neurotrasmettitori o altri reagenti attraverso i porti di iniezione posti nella parte superiore dell'incubatore da piastra. Dopo l'aggiunta dell'agonista del recettore della serotonina 8-OH-DPAT, le mitocondrie precedentemente stazionarie, indicate dalla freccia, si muovono lungo l'assone del neurone ippocampale.

La velocità media e la direzionalità dei singoli mitocondri vengono riassunte prima dell'aggiunta di serotonina. La maggior parte dei mitocondri è stazionaria; tuttavia, dopo l'aggiunta di serotonina, il 42% dei mitocondri mostra ora un movimento direzionale e percorre distanze maggiori rispetto a quelli che mostrano movimento direzionale in assenza di serotonina. Al contrario, dopo l'aggiunta di dopamina, il 92% dei mitocondri è stazionario negli ultimi 15 minuti di una sessione di acquisizione immagini, seguendo questa procedura.

Possono essere eseguiti altri metodi per monitorare più di un segnale al fine di rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, in che modo l'attività del calcio e il trasporto mitocondriale nei neuroni sono correlati.