Name: Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Impara a registrare l'attività elettrica dei neuroni piramidali in fette organotipiche di neocorteccia di ratto. Questo metodo consente di studiare le proprietà neuronali dopo manipolazioni genetiche in vitro.

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Gli autori desiderano ringraziare Mayumi Sakuraba e Rebecca Foehring per l&#39;eccellente assistenza tecnica. Inoltre, vorremmo ringraziare Drs. Rodrigo Andrade per l&#39;assistenza nell&#39;attuazione della cultura organotipica fetta e protocolli di trasfezione biolistic e il Dr. Giovanna Nerbonne per averci fornito i costrutti di cDNA per la trasfezione. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzione: NS044163 dal NINDS (a RCF).

<ol><li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li>
<li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li>
<li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li>
<li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Neurosci+Abstr%22%5BJournal%5D)">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li>
<li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li>
<li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+rectifier+K%2B+currents%2C+IK%2C+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li>
<li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li>
<li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proc%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li>
<li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li>
<li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo studiato i ruoli espressione e funzionale di canali del potassio voltaggio-dipendenti in neuroni piramidali da ratto neocorteccia (4, 9-11). A causa della mancanza di specifici agenti farmacologici per questi canali, usiamo un approccio genetico per manipolare l&#39;espressione canale (1,14,15,17-19). Utilizziamo una preparazione organotipica cultura (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Modificata da un approccio di Stoppini et al (16), al fine di mantenere la morfologia cellulare e il modello laminare del...

Chirurgia / trasfezione / cultura: <ol><li> Cervello Slicer: Campden Vibroslice # MA572 Strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL, USA </li><li> Sistema Gun gene: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547) <ul><li> Include: pistola Gene, assemblaggio tubo flessibile con regolatore di elio, tubi stazione della preparazione (# 165-2418), siringa kit, tubi Tefzel, taglio tubi, ottimizzazione kit (# 165-2424), taglio tubi </li><li> Bio-Rad Elio Regolatore (# 165-2413) </li><li> materiali di consumo usa e getta per Helios da Bio-Rad: <ul><li> Microcarriers 1,6 micron oro: # 165-2264 </li><li> Tefzel Tubing: # 165-2441 </li></ul></li></ul></li><li> Incubatore: modello Forma Scientific # 3110 (Thermo-scientifiche: (866) 984-3766). </li></ol> Media: <ol><li> Siero di cavallo: Hyclone donatore equino SH # 30074. (Hyclone, 925 Sud Occidentale 1800, Logan, UT 84321) </li><li> HMEM (Minimal Essential Media più HBSS e HEPES, non glutammina: Lonza BioWhittaker catalogo # 12-137F): GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, opzione 1. </li><li> HBSS (GIBCO Hanks soluzione salina tamponata, # 24020-117): GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, opzione 1. </li><li> MEM (GIBCO terreno minimo indispensabile, # 12360-038), GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, opzione 1. </li><li> 250 ml Millipore 0,2 micron filtro: # SC6PU02RE </li><li> Pipette di plastica di trasferimento: Fisher # 13-711-20. </li><li> 50 mL Millipore steriflip 0,22 micron filtro (# SCGP00525) </li></ol> Elementi 6-8 ottenuto a partire da: Fisher Scientific, 1241 Ambasciatore Blvd., PO Box 14989, St. Louis, MO 63132. Registrazione: <ol><li> Pipetta di vetro: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 ottobre Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746 </li><li> Sutter P-87 estrattore orizzontale elettrodo: Strumento azienda Sutter, One Digital Drive, Novato, CA 94949 </li><li> Axon Instruments Multiclamp 700B amplificatore: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> PClamp 10 software di acquisizione dati: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> posizione lectrode è controllato con Sutter ROE manipolatori-200 e PC-200 controller: Instrument Company Sutter, One Digital Drive, Novato, CA 94949. </li><li> Microscopio: Olympus BX-50WI microscopio in posizione verticale con IR-DIC ottica </li><li> IR sensibile fotocamera OLY-150 (Olympus) o DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 del Nord Roeske Avenue, Michigan City, IN 46360). </li></ol>

registrazione intera cella da un preparazione tagliare organotipica della neocorteccia

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Abbiamo studiato i ruoli espressione e funzionale di canali del potassio voltaggio-dipendenti in neuroni piramidali dalla neocorteccia del ratto. A causa della mancanza di specifici agenti farmacologici per questi canali, abbiamo adottato un approccio genetico per manipolare l&#39;espressione dei canali. Noi usiamo una preparazione organotipica cultura (16) al fine di mantenere la morfologia cellulare e il modello laminare della corteccia. Noi di solito isolare acuta fette neocorticale a 8-10 giorni dopo la nascita e mantenere le fette in coltura per 3-7 giorni. Questo ci permette di studiare i neuroni ad un&#39;età simile a quella nel nostro lavoro con le fette acuta e riduce al minimo lo sviluppo delle connessioni eccitatorie esuberante nella fetta. Noi registriamo da visivamente identificati neuroni piramidali negli strati II / III o V con illuminazione ad infrarossi (IR) e l&#39;interferenza differenziale microscopia a contrasto (DIC) con il morsetto intera patch di cellule in corrente o tensione-clamp. Noi usiamo biolistic (pistola Gene) trasfezione di tipo selvaggio o del DNA mutante canale del potassio per manipolare l&#39;espressione dei canali per studiare la loro funzione. Le cellule trasfettate sono facilmente identificabili mediante microscopia in epifluorescenza dopo la co-trasfezione con cDNA per la proteina fluorescente verde (GFP). Confrontiamo le registrazioni delle cellule transfettate adiacenti, i neuroni untransfected nello stesso strato dalla stessa porzione.

Questo è un protocollo di preparare e mantenere una preparazione neocorticale fetta di cultura organotipica allo scopo di effettuare registrazioni elettrica da neuroni piramidali.

Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

Abbiamo studiato l'espressione e i ruoli funzionali dei canali del potassio voltaggio-dipendenti nei neuroni piramidali della neocorteccia di ratto. A causa della ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere registrazioni elettriche da neuroni parametali in fette organotipiche di neocorteccia. Questo risultato si ottiene innanzitutto tagliando fette acute da ratti a età postnatale P8-P10. Il secondo passaggio della procedura consiste nel realizzare la trasfezione con Bic del DNAc. Il terzo passaggio prevede la coltivazione delle fette per tre-sette giorni.L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'ottenere registrazioni elettriche da cellule transfectate utilizzando il blocco in corrente o in tensione. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano come le cellule parametali in fette organotipiche presentino proprietà simili a quelle delle fette acute dello stesso stadio d'età. La transfezione di GFP non altera tali proprietà, permettendo lo studio dei neuroni dopo manipolazioni genetiche dei canali ionici mediante registrazioni in blocco in corrente o in tensione su cellula intera.Il principale vantaggio di questa tecnica, rispetto ad esempio a fette acute, è che le cellule possono essere mantenute in un ambiente normale per un periodo sufficientemente lungo da permettere la manipolazione genetica dei canali ionici.

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Questo protocollo descrive un saggio organotipica fetta ottimizzato per il cervello postnatale e ad alta risoluzione time-lapse imaging di migrazione neuroblasti nel flusso migratorio rostrale.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Questo video mostra il posizionamento di una pipetta a punta fine vicino a fette di cervello, formando un sigillo con una cellula neuronale. L'aspirazione rompe la membrana cellulare, creando così un patch clamp a cellula intera che consente misurazioni di corrente per esperimenti di elettrofisiologia.

Stabilire una configurazione di voltage-clamp a cellula intera per registrazioni elettrofisiologiche in fette di cervello

Questo video delinea un metodo per l'imaging e la registrazione simultanea dell'attività elettrica da fette di cervello transgenico che contengono proteine fluorescenti specifiche per i neuroni. La procedura prevede il mantenimento della fetta di cervello in una camera di perfusione con liquido cerebrospinale artificiale aerato, l'utilizzo di una sorgente luminosa per eccitare le cellule marcate con fluorescenza e la registrazione dei segnali elettrici con una sonda multicanale e un patch clamp.

Monitoraggio ottico ed elettrofisiologico simultaneo delle cellule neuronali in fette di cervello

Le registrazioni di coppia sono registrazioni simultanee di patch clamp di intere cellule da due neuroni collegati sinapticamente, che consentono una precisa caratterizzazione elettrofisiologica e farmacologica delle sinapsi tra i singoli neuroni. Qui descriviamo la metodologia dettagliata e i requisiti per stabilire questa tecnica in colture organotipiche di fette di ippocampo in qualsiasi laboratorio attrezzato per l'elettrofisiologia.

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

I protocolli a circuito chiuso stanno diventando sempre più diffusi nell'elettrofisiologia moderna. Presentiamo un modo semplice, versatile ed economico per eseguire protocolli elettrofisiologici complessi in neuroni piramidali corticali in vitro, utilizzando un computer desktop e una scheda di acquisizione digitale.

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Qui, viene presentata una procedura per attivare selettivamente una proteina neuronale con un breve impulso di luce codificando geneticamente un amminoacido innaturale foto-reattivo in una proteina neuronale bersaglio espressa in neuroni in coltura o in vivo.

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Questo protocollo viene illustrata l'implementazione di un ottimizzato N-metilico-D-glucamine (NMDG) protezione recupero metodo di preparazione di fetta di cervello. Una formulazione di singolo supporto viene utilizzata per ottenere in modo affidabile fette di cervello sano da animali di tutte le età e per diverse applicazioni sperimentali.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

In questa carta, discutiamo tre preparazioni di cervello usate per la registrazione di tutta la cella patch clamp per studiare il circuito retinotectal di girini di Xenopus laevis . Ogni preparazione, con i suoi specifici vantaggi, contribuisce alla trattabilità sperimentale il girino di Xenopus come modello per studiare la funzione del circuito neurale.

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Qui, descriviamo i passi essenziali per le registrazioni di cellule intere patch-clamp fatta da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) nella fetta di midollo spinale in vitro . Questo metodo consente la proprietà intrinseca della membrana, la trasmissione sinaptica e la caratterizzazione morfologica dei neuroni di SG per essere studiato.

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Qui presentiamo protocolli per la preparazione di fette cerebrali acute contenenti il nucleo genetico laterale e l'indagine elettrofisiologica della funzione sinapsi retinogenica e corticogena. Questo protocollo fornisce un modo efficiente per studiare le sinapsi con la probabilità ad alto rilascio e basso rilascio nelle stesse fette cerebrali acute.

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Qui presentiamo un protocollo che descrive la trasduzione virale di regioni cerebrali discrete con costrutti optogenetici per consentire la caratterizzazione elettrofisiologica sinaptico-specifica in fette acute di cervello di roditori.

Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale

Impara a registrare l'attività elettrica dei neuroni piramidali in fette organotipiche di neocorteccia di ratto. Questo metodo consente di studiare le proprietà neuronali dopo manipolazioni genetiche in vitro.

Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

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