Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere registrazioni elettriche da neuroni parametali in fette organotipiche di neocorteccia. Questo risultato si ottiene innanzitutto tagliando fette acute da ratti a età postnatale P8-P10. Il secondo passaggio della procedura consiste nel realizzare la trasfezione con Bic del DNAc. Il terzo passaggio prevede la coltivazione delle fette per tre-sette giorni.

L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'ottenere registrazioni elettriche da cellule transfectate utilizzando il blocco in corrente o in tensione. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano come le cellule parametali in fette organotipiche presentino proprietà simili a quelle delle fette acute dello stesso stadio d'età. La transfezione di GFP non altera tali proprietà, permettendo lo studio dei neuroni dopo manipolazioni genetiche dei canali ionici mediante registrazioni in blocco in corrente o in tensione su cellula intera.

Il principale vantaggio di questa tecnica, rispetto ad esempio a fette acute, è che le cellule possono essere mantenute in un ambiente normale per un periodo sufficientemente lungo da permettere la manipolazione genetica dei canali ionici. Il metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei canali ionici, come i ruoli funzionali di specifici tipi di canali ionici. Preparare la cappa a flusso laminare, la cappa a vuoto, il materiale chirurgico e le soluzioni come specificato nel manoscritto allegato. Indossare guanti per tutti i passaggi successivi dopo aver filtrato l’aliquota da 250 millilitri della soluzione di taglio, trasferendo 40 millilitri in un becher da 50 millilitri.

Posizionare la camera di taglio, l'aliquota di 40 millilitri e i restanti 210 millilitri della soluzione di taglio nel congelatore a meno 20 gradi Celsius sotto la cappa a flusso laminare. Aggiungere 1,1 millilitri di terreno di coltura in tre pozzetti disposti diagonalmente di una piastra a sei pozzetti. Ripetere l'operazione per una seconda piastra.

Piastra a sei pozzetti. Posizionare le piastre a sei pozzetti in un incubatore a 37 gradi Celsius per almeno un'ora. Successivamente, utilizzare forbici sterili per accorciare quattro pipette di trasferimento da usare per il trasferimento delle sezioni.

Altre tre pipette vengono mantenute intatte quando le soluzioni sono diventate miscele simili a poltiglia. Rimuovere l'aliquota di 40 millilitri di soluzione tagliante dal congelatore e posizionarla sotto la cappa a vuoto. Satuarla con una miscela di 95% ossigeno e 5% anidride carbonica.

Quindi rimuovere i 210 millilitri di soluzione di taglio dal congelatore e posizionarli sotto la campana a flusso laminare, saturandoli anche con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica. Successivamente, rimuovere il mezzo di lavaggio dal refrigeratore e saturarlo con il 100% di ossigeno sotto la campana a flusso laminare.

Posizionare due millilitri di terreno di coltura in una piastra di Petri. Conservare il terreno di coltura rimanente in frigorifero per il cambio del mezzo durante la settimana, in preparazione al taglio del cervello. Versare circa 10 millilitri di soluzione fredda per il taglio dal becher da 50 millilitri in un becher da 25 millilitri sotto la cappa a vuoto.

Dopo l'anestesia e la decapitazione, rimuovere il cervello di un ratto di otto-dieci giorni postnatale. Lavare il cervello nel becher contenente 30 millilitri di soluzione di taglio fredda per circa 30 secondi. Quindi trasferire con attenzione il cervello nel becher da 25 millilitri.

Cambiare i guanti e saturare i guanti con etanolo. Successivamente, trasportare il cervello nella soluzione fredda di taglio verso la cappa a flusso laminare. Il passo successivo consiste nell'orientare e bloccare il cervello rimuovendo il cervelletto e il polo frontale ed effettuando un taglio sagittale mediano parziale; incollare quindi il cervello bloccato sulla piastra con la corteccia frontale rivolta verso l'alto.

Eseguire ulteriori tagli con il bisturi, se necessario, per ridurre ulteriormente le dimensioni delle fette. Quindi posizionare la piastra con il cervello nella camera di taglio in metallo sterilizzata. Fissare al microtomo a vibrazione.

Riempire il bagno con soluzione di taglio ghiacciata e gorgogliante. Versare 30 millilitri della soluzione di taglio rimanente in un becher da 50 millilitri e gorgogliare con 95% ossigeno, 5% anidride carbonica. Questo becher verrà utilizzato per raccogliere le sezioni.

Tagliare fette coronali di 250 micron della corteccia frontoparietale. Posizionare almeno sei fette nel becher da 50 millilitri contenente la soluzione di taglio. Successivamente, versare circa due millilitri di mezzo di lavaggio in una piastra di Petri da 35 millimetri.

Utilizzando una pipetta tagliata, trasferire le sezioni dalla soluzione di taglio alla piastra di Petri contenente il mezzo di lavaggio. Lavare le sezioni tre volte utilizzando pipette nuove per aggiungere il mezzo e per aspirare le soluzioni di scarto dopo il lavaggio; quindi trasferire le sezioni nella piastra di Petri da 35 millimetri contenente il mezzo di coltura. Successivamente, rimuovere i coperchi dagli imballaggi degli inserti a rete, ma lasciare gli inserti all'interno delle confezioni.

Quindi utilizzare una pinzetta per sollevare un inserto a rete dal suo pacchetto usando una pipetta di trasferimento tagliata. Trasferire una sezione dai mezzi di coltura alla rete. Inserire e posizionare la sezione al centro della membrana utilizzando una pipetta di trasferimento integra.

Rimuovere qualsiasi eccesso di mezzo di coltura. Ora, posizionare l'inserzione a rete con la sua fetta in una delle pozzette contenenti liquido della piastra a sei pozzette. Prestare attenzione a evitare la formazione di bolle d'aria sotto la rete dopo aver posizionato una fetta in ciascuna delle pozzette contenenti liquido.

Rimettere entrambe le piastre a sei pozzetti nell'incubatore e incubare a 37 gradi Celsius per circa un'ora. Nel frattempo, pulire l'area di lavoro sotto la cappa a flusso laminare in preparazione alla trasfezione. Il passaggio successivo consiste nel caricare la pistola genica BioRad Helios, lasciando libera la prima posizione.

Caricare una cartuccia contenente proiettili rivestiti con CD NA in ogni altra posizione del supporto per cartucce del gene gun. Successivamente, inserire il supporto per cartucce nel gene gun. Per prima cosa, scaricare l'arma sparando un colpo con un barile senza proiettili.

Quindi avanzare il tamburo fino a una cartuccia contenente CDNA.Bullets. Prendere le piastre a sei pozzetti dall'incubatore e posizionarle sotto la cappa a flusso laminare, tenendo la pistola in posizione verticale appena sopra la superficie della piastra a sei pozzetti; sparare un colpo a 100 PSI, quindi avanzare il tamburo e svuotarlo nuovamente sparando un colpo a vuoto. Sparare sui rimanenti campioni con un colpo per ogni campione.

Dopo la dissezione, riposizionare le piastre a sei pozzetti nell'incubatore e incubare le sezioni a 37 gradi Celsius per due fino a sette giorni con il 5% di anidride carbonica durante il periodo di incubazione. Sostituire il mezzo ogni due giorni come segue: operando sotto cappa a flusso laminare, aggiungere nuovo mezzo nei tre pozzetti vuoti. Quindi riposizionare la piastra a sei pozzetti nell'incubatore per almeno un'ora; dopo un'ora, riportare la piastra a sei pozzetti nella cappa a flusso laminare e utilizzare pinze curve sterilizzate con etanolo per spostare ogni inserto a maglia con la relativa sezione in un nuovo pozzetto, aspirare il vecchio mezzo e riportare la piastra nell'incubatore.

Dopo diversi giorni di incubazione, le sezioni sono ora pronte per le registrazioni in intero tronco. Rimuovere una piastra a sei pozzetti dalla cappa a flusso laminare. Utilizzare pinze curve pulite con etanolo per rimuovere un inserto a rete e la relativa sezione.

Quindi reinserire la piastra a sei pozzetti nell'incubatrice. Successivamente, trasferire la capsula di Petri con l'inserzione a rete e la sezione nell'area di registrazione, applicando tensione con pinze o un pezzo flessibile di metallo. Utilizzare un bisturi di numero 11 per tagliare la rete intorno alla sezione, se necessario, e completare i tagli finali con le forbici.

Quindi utilizzare pinzette per trasferire la sezione e la griglia a essa collegata nella camera di registrazione. Sul piano di un microscopio eretto, immergere la sezione in soluzione salina artificiale cerebro-spinale ossigenata con carbogen sotto ottica IR DIC. Visualizzare i neuroni parametali negli strati due, tre o cinque mediante fluorescenza in epifluorescenza e il filtro fitz.

Individuare le cellule trasfettate verdi mediante microscopia IR DIC. Cercare i proiettili di CDNA, che appaiono come piccoli punti neri all'interno delle cellule. Selezionare una cellula trasfettata per la registrazione in configurazione whole cell.

Successivamente, avanzi un microelettrodo verso la cellula selezionata e utilizzi una leggera aspirazione per ottenere un sigillo gigaohm. Poi applichi ulteriore aspirazione per rompere la membrana cellulare e ottenere la configurazione in whole cell. La cellula è ora pronta per registrazioni in clamp di corrente o di tensione.

Questa figura mostra un'immagine fluorescente di cellule trasfettate con cDNA per GFP. Le seguenti registrazioni sono state effettuate su cellule trasfettate con cDNA per GFP. Qui è mostrato un potenziale d'azione in una cellula parametale dello strato tre in risposta a un'iniezione di corrente sopra-soglia della durata di 10 millisecondi.

Questa figura mostra un'attività ripetitiva di un neurone parametale del quinto strato in risposta a un'iniezione di corrente di 400 picoampere per due secondi. Questa figura mostra un tracciato in voltometria da un neurone parametale del quinto strato. La tetrodotossina è stata utilizzata per bloccare la corrente sodica dipendente dal voltaggio.

I tracciati rappresentano correnti esterne di potassio elicitate da una serie di passi di tensione della durata di 500 millisecondi a partire da un potenziale di clamping di meno 70 millivolt. Una volta acquisite le competenze, la preparazione e la trasfezione possono essere completate in circa due ore, compreso il tempo di preparazione. Quando si tenta questa procedura.

È importante mantenere condizioni sterili e limitare lo spessore e le dimensioni della sezione per evitare l'essiccamento. Grazie per aver guardato. Buona fortuna con il tuo esperimento.

Grazie.