Name: Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Impara a registrare l'attività elettrica dei neuroni piramidali in fette organotipiche di neocorteccia di ratto. Questo metodo consente di studiare le proprietà neuronali dopo manipolazioni genetiche in vitro.

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Gli autori desiderano ringraziare Mayumi Sakuraba e Rebecca Foehring per l&#39;eccellente assistenza tecnica. Inoltre, vorremmo ringraziare Drs. Rodrigo Andrade per l&#39;assistenza nell&#39;attuazione della cultura organotipica fetta e protocolli di trasfezione biolistic e il Dr. Giovanna Nerbonne per averci fornito i costrutti di cDNA per la trasfezione. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzione: NS044163 dal NINDS (a RCF).

<ol><li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li>
<li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li>
<li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li>
<li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Neurosci+Abstr%22%5BJournal%5D)">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li>
<li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li>
<li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+rectifier+K%2B+currents%2C+IK%2C+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li>
<li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li>
<li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proc%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li>
<li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li>
<li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo studiato i ruoli espressione e funzionale di canali del potassio voltaggio-dipendenti in neuroni piramidali da ratto neocorteccia (4, 9-11). A causa della mancanza di specifici agenti farmacologici per questi canali, usiamo un approccio genetico per manipolare l&#39;espressione canale (1,14,15,17-19). Utilizziamo una preparazione organotipica cultura (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Modificata da un approccio di Stoppini et al (16), al fine di mantenere la morfologia cellulare e il modello laminare del...

Chirurgia / trasfezione / cultura: <ol><li> Cervello Slicer: Campden Vibroslice # MA572 Strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL, USA </li><li> Sistema Gun gene: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547) <ul><li> Include: pistola Gene, assemblaggio tubo flessibile con regolatore di elio, tubi stazione della preparazione (# 165-2418), siringa kit, tubi Tefzel, taglio tubi, ottimizzazione kit (# 165-2424), taglio tubi </li><li> Bio-Rad Elio Regolatore (# 165-2413) </li><li> materiali di consumo usa e getta per Helios da Bio-Rad: <ul><li> Microcarriers 1,6 micron oro: # 165-2264 </li><li> Tefzel Tubing: # 165-2441 </li></ul></li></ul></li><li> Incubatore: modello Forma Scientific # 3110 (Thermo-scientifiche: (866) 984-3766). </li></ol> Media: <ol><li> Siero di cavallo: Hyclone donatore equino SH # 30074. (Hyclone, 925 Sud Occidentale 1800, Logan, UT 84321) </li><li> HMEM (Minimal Essential Media più HBSS e HEPES, non glutammina: Lonza BioWhittaker catalogo # 12-137F): GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, opzione 1. </li><li> HBSS (GIBCO Hanks soluzione salina tamponata, # 24020-117): GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, opzione 1. </li><li> MEM (GIBCO terreno minimo indispensabile, # 12360-038), GIBCO / Invitrogen, (800) 955-6288, opzione 1. </li><li> 250 ml Millipore 0,2 micron filtro: # SC6PU02RE </li><li> Pipette di plastica di trasferimento: Fisher # 13-711-20. </li><li> 50 mL Millipore steriflip 0,22 micron filtro (# SCGP00525) </li></ol> Elementi 6-8 ottenuto a partire da: Fisher Scientific, 1241 Ambasciatore Blvd., PO Box 14989, St. Louis, MO 63132. Registrazione: <ol><li> Pipetta di vetro: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 ottobre Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746 </li><li> Sutter P-87 estrattore orizzontale elettrodo: Strumento azienda Sutter, One Digital Drive, Novato, CA 94949 </li><li> Axon Instruments Multiclamp 700B amplificatore: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> PClamp 10 software di acquisizione dati: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> posizione lectrode è controllato con Sutter ROE manipolatori-200 e PC-200 controller: Instrument Company Sutter, One Digital Drive, Novato, CA 94949. </li><li> Microscopio: Olympus BX-50WI microscopio in posizione verticale con IR-DIC ottica </li><li> IR sensibile fotocamera OLY-150 (Olympus) o DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 del Nord Roeske Avenue, Michigan City, IN 46360). </li></ol>

registrazione intera cella da un preparazione tagliare organotipica della neocorteccia

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Abbiamo studiato i ruoli espressione e funzionale di canali del potassio voltaggio-dipendenti in neuroni piramidali dalla neocorteccia del ratto. A causa della mancanza di specifici agenti farmacologici per questi canali, abbiamo adottato un approccio genetico per manipolare l&#39;espressione dei canali. Noi usiamo una preparazione organotipica cultura (16) al fine di mantenere la morfologia cellulare e il modello laminare della corteccia. Noi di solito isolare acuta fette neocorticale a 8-10 giorni dopo la nascita e mantenere le fette in coltura per 3-7 giorni. Questo ci permette di studiare i neuroni ad un&#39;età simile a quella nel nostro lavoro con le fette acuta e riduce al minimo lo sviluppo delle connessioni eccitatorie esuberante nella fetta. Noi registriamo da visivamente identificati neuroni piramidali negli strati II / III o V con illuminazione ad infrarossi (IR) e l&#39;interferenza differenziale microscopia a contrasto (DIC) con il morsetto intera patch di cellule in corrente o tensione-clamp. Noi usiamo biolistic (pistola Gene) trasfezione di tipo selvaggio o del DNA mutante canale del potassio per manipolare l&#39;espressione dei canali per studiare la loro funzione. Le cellule trasfettate sono facilmente identificabili mediante microscopia in epifluorescenza dopo la co-trasfezione con cDNA per la proteina fluorescente verde (GFP). Confrontiamo le registrazioni delle cellule transfettate adiacenti, i neuroni untransfected nello stesso strato dalla stessa porzione.

Questo è un protocollo di preparare e mantenere una preparazione neocorticale fetta di cultura organotipica allo scopo di effettuare registrazioni elettrica da neuroni piramidali.

Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

Abbiamo studiato l'espressione e i ruoli funzionali dei canali del potassio voltaggio-dipendenti nei neuroni piramidali della neocorteccia di ratto. A causa della ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere registrazioni elettriche da neuroni parametali in fette organotipiche di neocorteccia. Questo risultato si ottiene innanzitutto tagliando fette acute da ratti a età postnatale P8-P10. Il secondo passaggio della procedura consiste nel realizzare la trasfezione con Bic del DNAc. Il terzo passaggio prevede la coltivazione delle fette per tre-sette giorni.L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'ottenere registrazioni elettriche da cellule transfectate utilizzando il blocco in corrente o in tensione. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano come le cellule parametali in fette organotipiche presentino proprietà simili a quelle delle fette acute dello stesso stadio d'età. La transfezione di GFP non altera tali proprietà, permettendo lo studio dei neuroni dopo manipolazioni genetiche dei canali ionici mediante registrazioni in blocco in corrente o in tensione su cellula intera.Il principale vantaggio di questa tecnica, rispetto ad esempio a fette acute, è che le cellule possono essere mantenute in un ambiente normale per un periodo sufficientemente lungo da permettere la manipolazione genetica dei canali ionici. Il metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei canali ionici, come i ruoli funzionali di specifici tipi di canali ionici. Preparare la cappa a flusso laminare, la cappa a vuoto, il materiale chirurgico e le soluzioni come specificato nel manoscritto allegato. Indossare guanti per tutti i passaggi successivi dopo aver filtrato l’aliquota da 250 millilitri della soluzione di taglio, trasferendo 40 millilitri in un becher da 50 millilitri.Posizionare la camera di taglio, l'aliquota di 40 millilitri e i restanti 210 millilitri della soluzione di taglio nel congelatore a meno 20 gradi Celsius sotto la cappa a flusso laminare. Aggiungere 1,1 millilitri di terreno di coltura in tre pozzetti disposti diagonalmente di una piastra a sei pozzetti. Ripetere l'operazione per una seconda piastra.Piastra a sei pozzetti. Posizionare le piastre a sei pozzetti in un incubatore a 37 gradi Celsius per almeno un'ora. Successivamente, utilizzare forbici sterili per accorciare quattro pipette di trasferimento da usare per il trasferimento delle sezioni.Altre tre pipette vengono mantenute intatte quando le soluzioni sono diventate miscele simili a poltiglia. Rimuovere l'aliquota di 40 millilitri di soluzione tagliante dal congelatore e posizionarla sotto la cappa a vuoto. Satuarla con una miscela di 95% ossigeno e 5% anidride carbonica.Quindi rimuovere i 210 millilitri di soluzione di taglio dal congelatore e posizionarli sotto la campana a flusso laminare, saturandoli anche con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica. Successivamente, rimuovere il mezzo di lavaggio dal refrigeratore e saturarlo con il 100% di ossigeno sotto la campana a flusso laminare.Posizionare due millilitri di terreno di coltura in una piastra di Petri. Conservare il terreno di coltura rimanente in frigorifero per il cambio del mezzo durante la settimana, in preparazione al taglio del cervello. Versare circa 10 millilitri di soluzione fredda per il taglio dal becher da 50 millilitri in un becher da 25 millilitri sotto la cappa a vuoto.Dopo l'anestesia e la decapitazione, rimuovere il cervello di un ratto di otto-dieci giorni postnatale. Lavare il cervello nel becher contenente 30 millilitri di soluzione di taglio fredda per circa 30 secondi. Quindi trasferire con attenzione il cervello nel becher da 25 millilitri.Cambiare i guanti e saturare i guanti con etanolo. Successivamente, trasportare il cervello nella soluzione fredda di taglio verso la cappa a flusso laminare. Il passo successivo consiste nell'orientare e bloccare il cervello rimuovendo il cervelletto e il polo frontale ed effettuando un taglio sagittale mediano parziale; incollare quindi il cervello bloccato sulla piastra con la corteccia frontale rivolta verso l'alto.Eseguire ulteriori tagli con il bisturi, se necessario, per ridurre ulteriormente le dimensioni delle fette. Quindi posizionare la piastra con il cervello nella camera di taglio in metallo sterilizzata. Fissare al microtomo a vibrazione.Riempire il bagno con soluzione di taglio ghiacciata e gorgogliante. Versare 30 millilitri della soluzione di taglio rimanente in un becher da 50 millilitri e gorgogliare con 95% ossigeno, 5% anidride carbonica. Questo becher verrà utilizzato per raccogliere le sezioni.Tagliare fette coronali di 250 micron della corteccia frontoparietale. Posizionare almeno sei fette nel becher da 50 millilitri contenente la soluzione di taglio. Successivamente, versare circa due millilitri di mezzo di lavaggio in una piastra di Petri da 35 millimetri.Utilizzando una pipetta tagliata, trasferire le sezioni dalla soluzione di taglio alla piastra di Petri contenente il mezzo di lavaggio. Lavare le sezioni tre volte utilizzando pipette nuove per aggiungere il mezzo e per aspirare le soluzioni di scarto dopo il lavaggio; quindi trasferire le sezioni nella piastra di Petri da 35 millimetri contenente il mezzo di coltura. Successivamente, rimuovere i coperchi dagli imballaggi degli inserti a rete, ma lasciare gli inserti all'interno delle confezioni.Quindi utilizzare una pinzetta per sollevare un inserto a rete dal suo pacchetto usando una pipetta di trasferimento tagliata. Trasferire una sezione dai mezzi di coltura alla rete. Inserire e posizionare la sezione al centro della membrana utilizzando una pipetta di trasferimento integra.Rimuovere qualsiasi eccesso di mezzo di coltura. Ora, posizionare l'inserzione a rete con la sua fetta in una delle pozzette contenenti liquido della piastra a sei pozzette. Prestare attenzione a evitare la formazione di bolle d'aria sotto la rete dopo aver posizionato una fetta in ciascuna delle pozzette contenenti liquido.Rimettere entrambe le piastre a sei pozzetti nell'incubatore e incubare a 37 gradi Celsius per circa un'ora. Nel frattempo, pulire l'area di lavoro sotto la cappa a flusso laminare in preparazione alla trasfezione. Il passaggio successivo consiste nel caricare la pistola genica BioRad Helios, lasciando libera la prima posizione.Caricare una cartuccia contenente proiettili rivestiti con CD NA in ogni altra posizione del supporto per cartucce del gene gun. Successivamente, inserire il supporto per cartucce nel gene gun. Per prima cosa, scaricare l'arma sparando un colpo con un barile senza proiettili.Quindi avanzare il tamburo fino a una cartuccia contenente CDNA.Bullets. Prendere le piastre a sei pozzetti dall'incubatore e posizionarle sotto la cappa a flusso laminare, tenendo la pistola in posizione verticale appena sopra la superficie della piastra a sei pozzetti; sparare un colpo a 100 PSI, quindi avanzare il tamburo e svuotarlo nuovamente sparando un colpo a vuoto. Sparare sui rimanenti campioni con un colpo per ogni campione.Dopo la dissezione, riposizionare le piastre a sei pozzetti nell'incubatore e incubare le sezioni a 37 gradi Celsius per due fino a sette giorni con il 5% di anidride carbonica durante il periodo di incubazione. Sostituire il mezzo ogni due giorni come segue: operando sotto cappa a flusso laminare, aggiungere nuovo mezzo nei tre pozzetti vuoti. Quindi riposizionare la piastra a sei pozzetti nell'incubatore per almeno un'ora; dopo un'ora, riportare la piastra a sei pozzetti nella cappa a flusso laminare e utilizzare pinze curve sterilizzate con etanolo per spostare ogni inserto a maglia con la relativa sezione in un nuovo pozzetto, aspirare il vecchio mezzo e riportare la piastra nell'incubatore.Dopo diversi giorni di incubazione, le sezioni sono ora pronte per le registrazioni in intero tronco. Rimuovere una piastra a sei pozzetti dalla cappa a flusso laminare. Utilizzare pinze curve pulite con etanolo per rimuovere un inserto a rete e la relativa sezione.Quindi reinserire la piastra a sei pozzetti nell'incubatrice. Successivamente, trasferire la capsula di Petri con l'inserzione a rete e la sezione nell'area di registrazione, applicando tensione con pinze o un pezzo flessibile di metallo. Utilizzare un bisturi di numero 11 per tagliare la rete intorno alla sezione, se necessario, e completare i tagli finali con le forbici.Quindi utilizzare pinzette per trasferire la sezione e la griglia a essa collegata nella camera di registrazione. Sul piano di un microscopio eretto, immergere la sezione in soluzione salina artificiale cerebro-spinale ossigenata con carbogen sotto ottica IR DIC. Visualizzare i neuroni parametali negli strati due, tre o cinque mediante fluorescenza in epifluorescenza e il filtro fitz.Individuare le cellule trasfettate verdi mediante microscopia IR DIC. Cercare i proiettili di CDNA, che appaiono come piccoli punti neri all'interno delle cellule. Selezionare una cellula trasfettata per la registrazione in configurazione whole cell.Successivamente, avanzi un microelettrodo verso la cellula selezionata e utilizzi una leggera aspirazione per ottenere un sigillo gigaohm. Poi applichi ulteriore aspirazione per rompere la membrana cellulare e ottenere la configurazione in whole cell. La cellula è ora pronta per registrazioni in clamp di corrente o di tensione.Questa figura mostra un'immagine fluorescente di cellule trasfettate con cDNA per GFP. Le seguenti registrazioni sono state effettuate su cellule trasfettate con cDNA per GFP. Qui è mostrato un potenziale d'azione in una cellula parametale dello strato tre in risposta a un'iniezione di corrente sopra-soglia della durata di 10 millisecondi.Questa figura mostra un'attività ripetitiva di un neurone parametale del quinto strato in risposta a un'iniezione di corrente di 400 picoampere per due secondi. Questa figura mostra un tracciato in voltometria da un neurone parametale del quinto strato. La tetrodotossina è stata utilizzata per bloccare la corrente sodica dipendente dal voltaggio.I tracciati rappresentano correnti esterne di potassio elicitate da una serie di passi di tensione della durata di 500 millisecondi a partire da un potenziale di clamping di meno 70 millivolt. Una volta acquisite le competenze, la preparazione e la trasfezione possono essere completate in circa due ore, compreso il tempo di preparazione. Quando si tenta questa procedura.È importante mantenere condizioni sterili e limitare lo spessore e le dimensioni della sezione per evitare l'essiccamento. Grazie per aver guardato. Buona fortuna con il tuo esperimento.Grazie.

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Questo protocollo descrive un saggio organotipica fetta ottimizzato per il cervello postnatale e ad alta risoluzione time-lapse imaging di migrazione neuroblasti nel flusso migratorio rostrale.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

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Stabilire una configurazione di voltage-clamp a cellula intera per registrazioni elettrofisiologiche in fette di cervello

Questo video delinea un metodo per l'imaging e la registrazione simultanea dell'attività elettrica da fette di cervello transgenico che contengono proteine fluorescenti specifiche per i neuroni. La procedura prevede il mantenimento della fetta di cervello in una camera di perfusione con liquido cerebrospinale artificiale aerato, l'utilizzo di una sorgente luminosa per eccitare le cellule marcate con fluorescenza e la registrazione dei segnali elettrici con una sonda multicanale e un patch clamp.

Monitoraggio ottico ed elettrofisiologico simultaneo delle cellule neuronali in fette di cervello

Le registrazioni di coppia sono registrazioni simultanee di patch clamp di intere cellule da due neuroni collegati sinapticamente, che consentono una precisa caratterizzazione elettrofisiologica e farmacologica delle sinapsi tra i singoli neuroni. Qui descriviamo la metodologia dettagliata e i requisiti per stabilire questa tecnica in colture organotipiche di fette di ippocampo in qualsiasi laboratorio attrezzato per l'elettrofisiologia.

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

I protocolli a circuito chiuso stanno diventando sempre più diffusi nell'elettrofisiologia moderna. Presentiamo un modo semplice, versatile ed economico per eseguire protocolli elettrofisiologici complessi in neuroni piramidali corticali in vitro, utilizzando un computer desktop e una scheda di acquisizione digitale.

Real-time Elettrofisiologia: utilizzando protocolli a circuito chiuso per sonda neuronali Dynamics and Beyond

Qui, viene presentata una procedura per attivare selettivamente una proteina neuronale con un breve impulso di luce codificando geneticamente un amminoacido innaturale foto-reattivo in una proteina neuronale bersaglio espressa in neuroni in coltura o in vivo.

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

Questo protocollo viene illustrata l'implementazione di un ottimizzato N-metilico-D-glucamine (NMDG) protezione recupero metodo di preparazione di fetta di cervello. Una formulazione di singolo supporto viene utilizzata per ottenere in modo affidabile fette di cervello sano da animali di tutte le età e per diverse applicazioni sperimentali.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

In questa carta, discutiamo tre preparazioni di cervello usate per la registrazione di tutta la cella patch clamp per studiare il circuito retinotectal di girini di Xenopus laevis . Ogni preparazione, con i suoi specifici vantaggi, contribuisce alla trattabilità sperimentale il girino di Xenopus come modello per studiare la funzione del circuito neurale.

Preparazioni e protocolli per l'intera cella Patch Clamp registrazione dei neuroni Tectal Xenopus laevis

Qui, descriviamo i passi essenziali per le registrazioni di cellule intere patch-clamp fatta da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) nella fetta di midollo spinale in vitro . Questo metodo consente la proprietà intrinseca della membrana, la trasmissione sinaptica e la caratterizzazione morfologica dei neuroni di SG per essere studiato.

Preparazione delle fette Acute del midollo spinale per la registrazione di cellule intere Patch-clamp in neuroni di sostanza Gelatinosa

Qui presentiamo protocolli per la preparazione di fette cerebrali acute contenenti il nucleo genetico laterale e l'indagine elettrofisiologica della funzione sinapsi retinogenica e corticogena. Questo protocollo fornisce un modo efficiente per studiare le sinapsi con la probabilità ad alto rilascio e basso rilascio nelle stesse fette cerebrali acute.

Indagini elettrofisiologiche sulla funzione di sinapla Retinogeniculate e Corticogeniculate

Qui presentiamo un protocollo che descrive la trasduzione virale di regioni cerebrali discrete con costrutti optogenetici per consentire la caratterizzazione elettrofisiologica sinaptico-specifica in fette acute di cervello di roditori.

Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale

Impara a registrare l'attività elettrica dei neuroni piramidali in fette organotipiche di neocorteccia di ratto. Questo metodo consente di studiare le proprietà neuronali dopo manipolazioni genetiche in vitro.

Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

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