Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

L'obiettivo generale del seguente esperimento è purificare contemporaneamente e con elevata purezza un'ampia gamma di cellule mitiche dai testicoli adulti di topo, al fine di studiare i processi dinamici che avvengono durante questo ciclo cellulare unico. Questo risultato si ottiene dissociando in modo efficiente le cellule testicolari mediante una serie di digestioni enzimatiche con collaghenasi e tripsina in presenza di DNA, al fine di ottenere, in un secondo passaggio, una sospensione di cellule singole.

La sospensione testuale viene colorata con il colorante fluorescente per il DNA vitale 3 33 42 dell'Hulk, che permette di distinguere vari tipi di cellule mitotiche in base al loro contenuto e alla densità del DNA. Successivamente, le cellule mitotiche vengono analizzate mediante sorting cellulare attivato da fluorescenza al fine di identificare e purificare tutte le frazioni necessarie per ulteriori analisi, come ad esempio analisi citogenetiche o di espressione genica. I risultati ottenuti mostrano una purificazione efficiente di popolazioni cellulari mitotiche difficili da ottenere, con elevata purezza, basata su approfonditi studi citogenetici e con matrici di espressione.

Il principale vantaggio di questo protocollo basato su fatti rispetto ai metodi esistenti come la centrifugazione, la filtrazione o la sedimentazione gravitazionale è che consente di raccogliere contemporaneamente frazioni mitotiche con un'elevata purezza. Gli individui alle prime armi con questo metodo dovranno combinare competenze molto diverse per eseguire un'efficace dissociazione dei tessuti e un'attenta preparazione, seguite da un'ottimale separazione cellulare; è fondamentale un buon coordinamento tra la persona che prepara le cellule e l'operatore della citometria a flusso, nonché una solida comprensione dei principi fondamentali di questo protocollo per garantirne il successo. A dimostrare il protocollo di dissociazione cellulare sarà la dott.ssa I. Gatun, post-dottoranda senior del nostro laboratorio che ha notevolmente migliorato questo protocollo.

BVN Tores. Il nostro operatore di citometria a flusso vi guiderà nella configurazione ottimale per un'efficiente separazione cellulare. In questo protocollo verrà dimostrata la dissociazione di due testicoli di topo adulti, ma i volumi possono essere adattati di conseguenza per soggetti giovani o per un numero maggiore di testicoli.

Per iniziare, aggiungere tre millilitri di soluzione salina equilibrata contenente 120 unità per millilitro di collaghenasi di tipo uno nel tubo. Una dissociazione efficiente e accurata è fondamentale per una corretta colorazione e per il successivo isolamento delle cellule. L'aggiunta di una quantità sufficiente di G nase uno, nonché il posizionamento del tubo in posizione orizzontale durante l'agitazione, sono aspetti molto importanti per una dissociazione testicolare efficiente. Inserire un testicolo encapsulato in un tubo da 15 millilitri.

Aggiungere 10 microlitri di DNAasi I al testicolo e agitare vigorosamente il tubo a mano finché non si osserva l'inizio della dissociazione dei tubuli testicolari. Successivamente, posizionare e fissare il tubo in posizione orizzontale su uno shaker rotante e agitare il tubo a un massimo di 120 giri al minuto per 15 minuti a 33 gradi Celsius. Dopo 15 minuti, lasciare decantare verticalmente per un minuto a temperatura ambiente. Quindi utilizzare una pipetta monouso per eliminare il soprannatante. Aggiungere tre millilitri di soluzione salina tamponata con glicina contenente collagenasi di tipo I, nonché 10 microlitri di DNAasi I, al campione.

Agitare nuovamente il tubo alcune volte a mano. Agitare il tubo orizzontalmente a un massimo di 120 giri al minuto per 15 minuti a 33 gradi Celsius, quindi lasciare decantare verticalmente per un minuto a temperatura ambiente e poi eliminare il soprannatante. Successivamente, aggiungere 2,5 millilitri di GBSS contenente collagenasi.

Aggiungere 50 microlitri di tripsina e 10 microlitri di dase. Capovolgere il tubo diverse volte, quindi agitare orizzontalmente a un massimo di 120 giri al minuto per 15 minuti a 33 gradi Celsius. Al termine dell'agitazione di 15 minuti, utilizzare una pipetta di plastica monouso con un orifizio largo per pipettare delicatamente il campione su e giù per tre minuti.

Non dovrebbero essere visibili grumi a questo punto. Aggiungere quindi 30 microlitri di tripsina, 10 microlitri di DNAs one e 40 microlitri di Hulks 3 33 42 sospesi in DMSO. Capovolgere il tubo diverse volte.

Agitare orizzontalmente a un massimo di 120 giri/min per 15 minuti a 33 gradi Celsius. Al termine dell'agitazione del campione, aggiungere 400 microlitri di siero fetale bovino e mescolare capovolgendo il tubo per inattivare la tripsina. Per eseguire la colorazione finale, aggiungere 50 microlitri di hoax 3 33 42 e 10 microlitri di DNAs.

Agitare nuovamente il tubo orizzontalmente a un massimo di 120 giri al minuto per 15 minuti a 33 gradi Celsius. Il campione di testicolo dissociato viene quindi fatto passare attraverso due filtri monouso da 40 micron, preventivamente inumiditi con GBSS, in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere cinque microlitri di soluzione di ioduro di propidio al campione e mescolare delicatamente aspirando e dispensando più volte con una pipetta Pasteur monouso.

Successivamente, trasferire il campione in una siringa di plastica da cinque millilitri attraverso un ago da 18 gauge. Quindi sostituire l'ago da 18 gauge con un ago da 22 gauge per la somministrazione del campione. Infine, conservare la siringa sul ghiaccio e proteggerla dalla luce fino a quando il campione non è pronto per la procedura di fax.

Per questo esperimento, il sorting cellulare viene eseguito in un'area Backin Dixon. Due, le condizioni del cell sorter sono state adattate da quelle utilizzate in precedenza per un citometro a flusso dotato di un laser ad argon ultravioletto a 360 nanometri e di un laser ad argon a 488 nanometri. In definitiva, l'allestimento del citometro a flusso dovrà essere ottimizzato dall'operatore del cell sorter.

Poiché il Becton Dixon Aria due U non dispone di un laser UV, il protocollo per la rilevazione della colorazione con hawk viene adattato utilizzando un laser violetto a 405 nanometri. Hawk viene eccitato dal laser violetto a 405 nanometri, mentre un laser blu a 488 nanometri viene utilizzato sia per l'eccitazione del PI sia per la rilevazione della luce diffusa in avanti e laterale. Inoltre, i filtri per la rilevazione di hos vengono modificati al fine di limitare alcune perdite del laser rosso, ottenendo un miglioramento della nitidezza dei diagrammi di dispersione.

Il laser violetto è configurato con un filtro passa-banda di 450/40 nanometri per la rilevazione dell'emissione blu simulata e un filtro passa-banda di 585/42 nanometri per l'emissione rossa simulata. Viene utilizzato un filtro passa-lungo di 502 nanometri per separare la fluorescenza blu da quella rossa. Qui si mostra la differenza derivante dall'uso di due diversi set di filtri.

Il filtro da 5 85 42 nanometri fornisce popolazioni cellulari più compatte rispetto al filtro da 6 30 30 nanometri. Pertanto, l'operatore dovrebbe essere pronto a provare diverse combinazioni sul proprio strumento al fine di ottenere il miglior compromesso. Viene utilizzata una bocchetta da 100 micron con una frequenza di goccia di 28.000 gocce al secondo.

La velocità di soglia del campione è di circa 4.000 eventi al secondo con una portata compresa tra uno e tre per mantenere una risoluzione maggiore. Eseguire il sorting del campione in aliquote di circa 750 microlitri erogati dalla siringa. Durante queste pause, mantenere il campione rimanente nella siringa su ghiaccio e protetto dalla luce. Raccogliere i campioni ordinati in provette di raccolta in vetro borosilicato da 12 per 75 millimetri contenenti 250 microlitri di DMEM integrati con il 10% di FCS.

Per mantenere il campione nei tubi di raccolta a quattro gradi Celsius, utilizzare l'opzione di controllo della temperatura per tutta la durata dell'ordinamento. Inoltre, utilizzare la funzione di agitazione del campione a 200 giri al minuto per evitare che il campione si sedimenti durante l'intero processo di ordinamento. Ogni volta che viene aggiunta un'aliquote del campione principale, è importante agitare leggermente i tubi di raccolta per mantenere l'integrità delle cellule raccolte.

Qui sono mostrati profili rappresentativi di dati in cui tutti i passaggi principali della meiosi di tipo selvatico sono identificati in questo grafico a dispersione in cui sono indicate le cellule selezionate; è presente una grande quantità di detriti contenenti principalmente membrane vuote e code degli spermatozoi nei testicoli adulti. Un grafico rappresentativo con ioduro di propidio mostra una quantità molto limitata di cellule positive all'ioduro di propidio presenti nel campione. L'andatura tipica è indicata in questo profilo rappresentativo di tipo selvatico hoax 3 33 42 fax.

Le diverse popolazioni cellulari meiotiche che possono essere purificate con questo metodo per ulteriori studi sono indicate come spermatogoni, preleptotene, leptotene, zigoti, pacu, diplonema e spermatidi rotondi. Questi ultimi due profili provengono da un testicolo di topo SPO11 negativo e da un testicolo di tipo selvaggio di topi di 13 giorni. SPO11 è l'endonucleasi meiotica che indirizza le rotture a doppio filamento ai siti di ricombinazione meiotica nota come hotspot; come osservato qui, l'assenza di SPO11 determina un evidente fallimento meiotico poiché nessuna fase successiva allo stadio leptotene-zigote e al pacu precoce può essere rilevata.

Al contrario, il profilo di un topo maschio di tipo selvatico di 13 giorni mostra una elevata concentrazione di cellule zigoti di leptina. Questa prima ondata di mirosi è piuttosto asincrona, come chiaramente visibile. Utilizzando questa metodologia, mentre si esegue questo esperimento, è importante utilizzare una quantità sufficiente di DNA.

Il centro della città è fondamentale per un'ordinazione senza problemi. Sebbene inizialmente i ricercatori siano riluttanti ad utilizzarlo, l'aggiunta di DNA ridurrà la viscosità del campione e migliorerà la separazione e la colorazione delle cellule, oltre al fatto che le cellule integre non verranno danneggiate. Il metodo FOX per l'isolamento di cellule matiche può essere impiegato in una vasta gamma di applicazioni a valle, come ad esempio l'estrazione di DNA-RNA per lo studio della dinamica dell'espressione genica, oppure per la tecnica di immunoprecipitazione della cromatina al fine di stabilire diversi profili epigenetici.