Rilevazione di segnalazione Effettistica-Complessi valle di BMP4 utilizzo In situ PLA, una legatura di prossimità Assay

L'obiettivo generale del seguente esperimento è visualizzare e quantificare la segnalazione BMP nelle cellule di coltura tissutale. Le BMP si legano ai recettori nella superficie cellulare e al FOSFOLATO tre, agli effettori SMAD, SMAD uno, SMAD cinque e SMAD otto. Questi formano complessi con smad quattro e traslocano nel nucleo dove orchestrano la trascrizione.

Qui utilizziamo il PLA per visualizzare i complessi che si formano tra gli effettori endogeni di SMA e smad quattro in cellule di coltura tissutale con o senza stimolazione BMP. Questo inizia con l'uso parallelo di due anticorpi primari, uno dei quali riconosce tutti e tre gli effettori fosforilati, smma, e l'altro dei quali riconosce smad quattro anticorpi secondari chiamati sonde PLA, ciascuno con un filamento di DNA corto unico attaccato ad esso, si legano agli anticorpi primari dove le sonde PLA si trovano nelle immediate vicinanze. I filamenti di DNA interagiscono attraverso una successiva aggiunta di due cerchi che formano oligonucleotidi di DNA.

Questi sono uniti tra loro dalla legatura enzimatica e formano un cerchio che viene amplificato attraverso la replicazione del cerchio rotante dopo la reazione di amplificazione. L'ibridazione di sonde oligonucleotidiche complementari marcate evidenzia le macchie fluorescenti del prodotto associate all'amplificazione di ciascuna circolarizzata. I prodotti del DNA sono facilmente visibili.

Se osservati al microscopio a fluorescenza, gli spot corrispondono a complessi tra effettore, seds e smad four, che significano la segnalazione BMP attiva nella cellula. I principali vantaggi del PLA rispetto ai metodi esistenti è che è facile da usare, altamente sensibile e senza sfondo e può essere utilizzato per quantificare la segnalazione BMP attiva in situ. La via BMP è essenziale per lo sviluppo di diversi organi e tessuti e per processi che includono la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali.

Il PLA può essere utilizzato per affrontare questioni chiave riguardanti la dinamica, i livelli e la localizzazione subcellulare della segnalazione BMP, ma può anche essere utilizzato per la diagnosi. Poiché questa via è alla base di diverse malattie, il BLA può essere utilizzato per studiare altri componenti della transazione del segnale del BMP o di altre vie e può essere adattato per lavorare su sezioni di tessuto o embrioni interi. Per iniziare il saggio di legatura di prossimità in situ, preparare le colture cellulari Neuro due cellule A vengono coltivate in GMEM integrate con il 10% di FBS, una volta di amminoacidi non essenziali, una volta di piruvato e una volta di L-glutammina.

Dividere le cellule usando la tripsina e piastrarle da 15.000 a 20.000 cellule per pozzetto. In un vetrino da 16 pozzetti, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica per 24 ore. Dopo 24 ore.

Sostituire i terreni di coltura con GMEM integrato senza siero e incubare per altre due o tre ore per i controlli. Conservare tre pozzetti con cellule in coltura e condizioni normali dopo la seconda incubazione. Inibire la via BMP trattando le cellule con due micromolari dorsa morfina o indurre la segnalazione trattando le cellule con BMP quattro per 10-60 minuti.

Dopo la stimolazione cellulare, aspirare il terreno dai pozzetti e lavare delicatamente le cellule con PBS per evitare il distacco delle cellule. Non pipettare il PBS direttamente sulle cellule. Quindi aspirare il PBS e rimuovere le camere, ma lasciare il silicone intorno ai pozzetti.

Aggiungere 50 microlitri di para formaldeide appena preparata e filtrata nei pozzetti e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitare. Dopo la fissazione, lavare le cellule con PBS per cinque minuti a temperatura ambiente agitando in un barattolo di copin. Ripetere il lavaggio due volte per un totale di tre lavaggi.

Successivamente, permeare le cellule con Triton X 100 allo 0,5% in PBS in un barattolo di copin e incubarle per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Quindi lavare le celle con lo 0,05% di interpolazione 20 e TB S3 volte per cinque minuti per lavaggio con agitazione in un barattolo di accoppiamento. Avviare la procedura di blocco picchiettando il vetrino per rimuovere la soluzione di lavaggio finale.

Fare attenzione a non lasciare che le cellule si secchino. Aggiungi una goccia di collegamento DUO alla soluzione di blocco a ciascuno. Incubare bene le cellule in soluzione bloccante per 30 minuti a 37 gradi Celsius in una camera umidificata preriscaldata costituita da una scatola di puntali per pipette vuota con acqua distillata.

Per preparare le soluzioni anticorpali primarie, diluire l'anti fosfo, lo smad 1, 5, 8 e l'anti SMAD quattro, da uno a 100, in diluente anticorpale duo link due. Utilizzare ciascun anticorpo da solo e in combinazione. Ora toccare il vetrino per rimuovere la soluzione bloccante dal vetrino e aggiungere 40 microlitri di soluzioni anticorpali ai pozzetti appropriati e il controllo negativo con solo diluente può essere incluso.

Esegui questo passaggio rapidamente in modo che le celle non si secchino. Ora incubare i vetrini a 37 gradi Celsius in una camera umidificata preriscaldata per un'ora. Durante l'incubazione, diluire le due sonde PLA in diluente.

Per ogni reazione mescolare otto microlitri di ciascuna sonda e 24 microlitri di diluente in modo che le sonde vengano diluite da una a cinque nella soluzione. Dopo un'ora di incubazione, picchiettare la soluzione di anticorpi primari e lavare due volte i vetrini con Duo link a Wash Buffer a per cinque minuti ciascuno a temperatura ambiente con agitazione in un barattolo di accoppiamento. Al termine dei lavaggi, picchiettare il tampone di lavaggio A rimanente dai vetrini e aggiungere 40 microlitri della soluzione della sonda PLA a ciascuno.

Bene, ora incubare i vetrini a 37 gradi Celsius in una camera umidificata preriscaldata. Per un'ora, il duo si collega al ceppo di legatura e prepara un volume per la miscela di legatura. Agitando prima il duo link al ceppo di legatura e diluendolo una volta in acqua ad alta purezza.

Tenete presente che l'enzima ligasi viene aggiunto da uno a 40 in questa soluzione e sono necessari 40 microlitri della miscela per pozzetto. Dopo l'incubazione, picchiettare la soluzione della sonda PLA dai vetrini e lavarli due volte con il tampone di lavaggio. A per cinque minuti a temperatura ambiente con agitazione in un barattolo di accoppiamento durante l'ultimo lavaggio, prelevare Duo link Ligasi in un blocco di congelamento e poi aggiungerlo alla soluzione di legatura fino a una diluizione finale di uno a 40 e Vortex.

Ora picchiettare il volume finale di Wash Buffer A dai vetrini e aggiungere 40 microlitri di legatura. Mescolare con l'enzima a ciascuno mentre l. Incubare i vetrini in una camera di umidità preriscaldata per 30 minuti.

A 37 gradi Celsius, scongelare il supporto di amplificazione DUO link e prepararsi per la fase di amplificazione durante l'incubazione diluendo il supporto di amplificazione DUO Link in acqua ad alta purezza fino a una volta Tenere i reagenti al riparo dalla luce perché sono sensibili alla luce. Al termine della fase di legatura, picchiettare la soluzione e lavare due volte i vetrini con il tampone di lavaggio A per due minuti ciascuno a temperatura ambiente con agitazione in un barattolo di accoppiamento durante l'ultimo lavaggio, aggiungere la polimerasi duo link alla soluzione di amplificazione fino a una diluizione finale di 1, 2, 80 e vortex. Dopo aver picchiettato il tampone di lavaggio, aggiungere 40 microlitri di amplificazione miscelati a ciascun pozzetto e incubare i vetrini in una camera di umidità preriscaldata al buio per 100 minuti a 37 gradi Celsius.

Una volta completata l'incubazione dell'amplificazione, picchiettare la soluzione di polimerasi dai vetrini e lavarli nel tampone di lavaggio B due volte per 10 minuti per lavaggio con la vegetazione in un barattolo di accoppiamento, tenere i vetrini fuori dalla luce durante questa fase perché i reagenti sono sensibili alla luce. Seguire i due lavaggi con un tuffo in 0,1 volte il tampone di lavaggio B.Ora rimuovere completamente il silicone dal 16. Scivolare bene quindi a circa 40 microlitri del duo.

Collegare il supporto di montaggio con dappy a un vetrino coprioggetti e posizionarlo delicatamente sui campioni, premendolo leggermente in modo che non ci siano bolle d'aria sotto il vetrino coprioggetti, fissare e sigillare il vetrino coprioggetto sul vetrino utilizzando lo smalto per unghie, lasciando almeno 15 minuti prima dell'imaging. Si tratta di immagini confocali di cellule che sono state trattate con due micromolari dorsa morfina, un inibitore della via BMP o trattate con 25 nanogrammi per millilitro. BMP quattro per 60 minuti.

Gli anticorpi contro Phospho Smad 1 58 e Smad 4 sono stati utilizzati per rilevare i complessi SMAD attivi e sono visti come macchie rosse. La cellula nucleare sostenuta blu da dpi. I segnali PLA sono stati contati con il software DUO link image tool e il numero medio di macchie nel nucleo per cellula è presentato nel grafico.

Non si osserva alcuna colorazione quando uno dei due anticorpi primari viene utilizzato da solo, indicando che non vi è alcun riscontro di fondo delle sonde PLA e successiva legatura degli oligonucleotidi. Allo stesso modo, non vengono rilevate macchie in un altro controllo negativo che emette entrambi gli anticorpi primari. Nelle neuro due cellule A, la pagina SDS dell'immunoblotting rivela SMAD 1, 5, 8 fosfo-correlate in cellule non trattate e trattate con BMP.

Tuttavia, i livelli di fosfosma sono marcatamente ridotti nelle cellule trattate con morfina dorsale. L'anticorpo contro il PCNA fornisce un controllo del carico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come seguire i passaggi e la configurazione che suggeriamo per ottenere risultati in meno di sei ore dopo la fissazione delle cellule.

In sintesi, le fasi sono il blocco dell'incubazione degli anticorpi primari, l'incubazione del PLA prob, l'amplificazione della legatura, il montaggio di un imaging.