Rilevazione di segnalazione Effettistica-Complessi valle di BMP4 utilizzo In situ PLA, una legatura di prossimità Assay

L'obiettivo generale del seguente esperimento è visualizzare e quantificare il segnale BMP in cellule in coltura. Le BMP si legano ai recettori sulla superficie cellulare e FOSFORILANO tre effettori Smad, Smad1, Smad5 e SMAD8. Questi formano complessi con Smad4 e si traslocano nel nucleo, dove regolano la trascrizione.

Qui utilizziamo l'PLA per visualizzare i complessi che si formano tra gli effettori SMA endogeni e Smad4 in cellule in coltura, in presenza o assenza di stimolazione da BMP. Il metodo inizia con l'uso parallelo di due anticorpi primari, uno dei quali riconosce tutti e tre gli effettori SMA fosforilati e l'altro riconosce Smad4. Gli anticorpi secondari, denominati sonde PLA, ciascuno con una breve sequenza di DNA legata, si legano agli anticorpi primari quando le sonde PLA si trovano in prossimità. Le sequenze di DNA interagiscono mediante l'aggiunta successiva di due oligonucleotidi di DNA che formano un circolo.

Questi vengono uniti insieme mediante ligazione enzimatica e formano un cerchio che viene amplificato attraverso la replicazione circolare a rotazione dopo la reazione di amplificazione. L'ibridazione di sonde oligonucleotidiche complementari marcate evidenzia le macchie fluorescenti prodotte dall'amplificazione di ciascun DNA circolarizzato. I prodotti di DNA sono facilmente visibili.

Quando osservati al microscopio a fluorescenza, i puntini corrispondono a complessi tra effettore, seds e smad quattro, che indicano una segnalazione BMP attiva nella cellula. I principali vantaggi del PLA rispetto ai metodi esistenti sono la facilità d'uso, l'elevata sensibilità, l'assenza di fondo e la possibilità di quantificare la segnalazione BMP attiva in situ. Il percorso BMP è essenziale per lo sviluppo di diversi organi e tessuti e per processi quali la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali.

Il PLA può essere utilizzato per affrontare domande fondamentali riguardo alla dinamica, ai livelli e alla localizzazione subcellulare della segnalazione BMP, ma può anche essere impiegato a scopo diagnostico. Poiché questa via è alla base di diverse malattie, il PLA può essere utilizzato per studiare altri componenti della trasduzione del segnale delle vie BMP o di altre vie e può essere adattato per essere eseguito su sezioni di tessuto o su embrioni interi. Per iniziare il saggio di legatura in situ per prossimità, preparare le colture cellulari: le cellule Neuro2A vengono coltivate in GMEM integrato con FBS al 10%, aminoacidi non essenziali 1×, piruvato 1× e L-glutammina 1×.

Dividere le cellule utilizzando la tripsina e seminare da 15.000 a 20.000 cellule per pozzetto. In una piastra con camera a 16 pozzetti, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un'incubatrice umidificata con anidride carbonica al 5% per 24 ore. Dopo 24 ore.

Sostituire il terreno di coltura con GMEM privo di siero e integrato e incubare per altre due o tre ore per i controlli. Mantenere tre pozzetti con cellule in condizioni di coltura normali dopo la seconda incubazione. Inibire la via BMP trattando le cellule con dorsa morfina a due micromolari oppure indurre il segnale trattando le cellule con BMP4 per 10-60 minuti.

Dopo la stimolazione delle cellule, aspirare il mezzo dai pozzetti e lavare delicatamente le cellule con PBS per evitare il distacco cellulare. Non pipettare il PBS direttamente sulle cellule. Successivamente, aspirare il PBS ed eliminare le camere, lasciando tuttavia il silicone intorno ai pozzetti.

Aggiungere 50 microlitri di paraformaldeide al 4% appena preparata e filtrata nei pozzetti e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Dopo la fissazione, lavare le cellule con PBS per cinque minuti a temperatura ambiente con agitazione in un barattolo Coplin. Ripetere il lavaggio due volte per un totale di tre lavaggi.

Successivamente, permeabilizzare le cellule con Triton X-100 0,5% in PBS in un barattolo copin e incubarle per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Quindi lavare le cellule con tween 20 0,05% e TB S per 3 volte, cinque minuti per ogni lavaggio, con agitazione in un barattolo per accoppiamento. Iniziare la procedura di bloccaggio tamponando il vetrino per rimuovere la soluzione dell'ultimo lavaggio.

Avendo cura di non far seccare le cellule. Aggiungere una goccia di DUO link alla soluzione di blocco per ogni pozzetto. Incubare le cellule nella soluzione di blocco per 30 minuti a 37 gradi Celsius in una camera umidificata preriscaldata, costituita da una scatola vuota per puntali con acqua distillata.

Per preparare le soluzioni di anticorpo primario, diluire l'anti phospho smad 1 5 8 e l'anti SMAD four uno a uno a 100 nel diluente per anticorpi duo link due. Utilizzare ciascun anticorpo singolarmente e in combinazione. Ora battere leggermente il vetrino per rimuovere il soluzione di blocco e aggiungere 40 microlitri delle soluzioni di anticorpo nei pozzetti appropriati; un controllo negativo con solo diluente può essere incluso.

Eseguire rapidamente questo passaggio per evitare che le cellule si secchino. Incubare ora i vetrini a 37 gradi Celsius in una camera umidificata preriscaldata per un'ora. Durante l'incubazione, diluire i due sonde PLA nel diluente.

Per ogni reazione, mescolare otto microlitri di ogni sonda e 24 microlitri di diluente in modo che le sonde vengano diluite uno a cinque nella soluzione. Dopo l'incubazione di un'ora, rimuovere delicatamente la soluzione dell'anticorpo primario e lavare i vetrini due volte con il Duo link al tampone di lavaggio A per cinque minuti ciascuno a temperatura ambiente con agitazione in un barattolo di accoppiamento. Al termine dei lavaggi, rimuovere delicatamente il tampone di lavaggio A residuo dai vetrini e aggiungere 40 microlitri della soluzione della sonda PLA a ciascuno.

Ora incubare le preparazioni a 37 gradi Celsius in una camera umidificata preriscaldata. Per un'ora, preparare il volume della miscela di ligazione partendo dal stock di duo link per la ligazione, prima agitando il duo link per la ligazione e poi diluendolo a una concentrazione di 1x in acqua ad alta purezza.

Tenere presente che l'enzima Ligasi viene aggiunto in un rapporto di uno a 40 in questa soluzione e che sono necessari 40 microlitri della miscela per pozzetto. Dopo l'incubazione, rimuovere con un colpetto la soluzione del sonda PLA dai vetrini e lavarli due volte con il Buffer di Lavaggio. Per cinque minuti a temperatura ambiente con agitazione in un barattolo di accoppiamento durante l'ultimo lavaggio, prelevare il Duo link Ligasi da un blocco congelato e aggiungerlo alla soluzione di ligazione fino a un'ultima diluizione di uno a 40 e vortexare.

Ora asciugare delicatamente il volume residuo del tampone di lavaggio A dai vetrini e aggiungere 40 microlitri della soluzione di ligazione. Mescolare con l'enzima su ciascuno mentre l. Incubare i vetrini in una camera umidificata preriscaldata per 30 minuti.

Sciogliere a 37 gradi Celsius il DUO link amplification stock e prepararlo per il passaggio di amplificazione durante l'incubazione diluendo il DUO link amplification stock in acqua ad alta purezza fino a una concentrazione di una volta. Mantenere i reagenti al riparo dalla luce poiché sono fotosensibili. Al termine del passaggio di ligazione, rimuovere la soluzione per battitura e lavare i vetrini due volte con il Wash Buffer A per due minuti ciascuno a temperatura ambiente con agitazione in un barattolo di accoppiamento; durante l'ultimo lavaggio, aggiungere la duo link polimerasi alla soluzione di amplificazione fino a un diluizione finale di 1:280 e vortexare. Dopo aver rimosso il tampone di lavaggio per battitura, aggiungere 40 microlitri della miscela di amplificazione in ogni pozzetto e incubare i vetrini in una camera umida preriscaldata al buio per 100 minuti a 37 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione per l'amplificazione, rimuovere delicatamente la soluzione di polimerasi dai vetrini e lavarli due volte in tampone di lavaggio B, per 10 minuti ogni lavaggio, con agitazione in un barattolo di accoppiamento; mantenere i vetrini al buio durante questo passaggio poiché i reagenti sono sensibili alla luce. Dopo i due lavaggi, immergere brevemente in tampone di lavaggio B 0,1 volte. Rimuovere quindi completamente il silicone dal vetrino a 16 pozzetti, quindi aggiungere circa 40 microlitri del duo.

Collegare il mezzo di montaggio con dappy a un coprioggetto e posizionarlo delicatamente sui campioni, premendo leggermente in modo da non lasciare bolle d'aria sotto il coprioggetto; fissare e sigillare il coprioggetto sul vetrino utilizzando smalto per unghie, lasciando almeno 15 minuti prima dell'acquisizione delle immagini. Queste sono immagini confocali di cellule trattate con due micromolari di dorsa morfina, un inibitore della via BMP, o trattate con 25 nanogrammi per millilitro di BMP quattro per 60 minuti.

Anticorpi contro Smad 1 58 fosforilato e Smad quattro sono stati utilizzati per rilevare i complessi Smad attivi, visibili come puntini rossi. Il nucleo cellulare è colorato in blu con DAPI. I segnali PLA sono stati contati mediante il software DUO link image tool e il numero medio di puntini nel nucleo per cellula è riportato nel grafico.

Non si osserva alcuna colorazione quando ciascun anticorpo primario viene utilizzato da solo, indicando l'assenza di segnale di fondo derivante dalle sonde PLA e dalla successiva ligazione degli oligonucleotidi. Analogamente, nessun punto è rilevato in un altro controllo negativo in cui sono presenti entrambi gli anticorpi primari. In cellule neuro due A, l'immunoblotting su gel SDS rivela la presenza di SMAD 1 5 8 fosforilato nelle cellule non trattate e in quelle trattate con BMP.

Tuttavia, i livelli di smad fosforilato sono notevolmente ridotti nelle cellule trattate con morfina dorsale. L'anticorpo anti-PCNA fornisce un controllo di caricamento. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come seguire i passaggi e la configurazione che suggeriamo per ottenere risultati in meno di sei ore dopo la fissazione delle cellule.

In sintesi, i passaggi sono bloccaggio, incubazione con l'anticorpo primario, incubazione con le sonde PLA, amplificazione per legazione e montaggio per l'analisi microscopica.