Generazione di piante Composite in Medicago truncatula Per saggi nodulazione

Ciao, mi chiamo Oliver Yu del Dan Plant Science Center. Oggi vi mostreremo come generare piante di Ute Compote mediante Agrobacterium Ogn. Questa tecnica è stata introdotta al Dan Center dal Dottor Chris Taylor, attualmente presso la Ohio State University.

Molti dei miei ex membri del gruppo hanno migliorato queste tecniche nel corso degli anni e oggi il mio attuale membro del gruppo, il dott. Stone e Mao, hanno realizzato questo video per mostrare come vengono prodotti i piani compositi di Harry Root. Gli Agrobacterium ZOS sono molto simili all'agrobacterium tumefaciens poiché introducono DNA estraneo nelle piante, ma gli ZOS possono indurre una formazione radicale maggiore nei tessuti di tipo selvatico, generando piante compositive come questa. Pertanto, in queste piante composite, alcune radici sono transgeniche mentre gli apici caulinari rimangono di tipo selvatico.

Pertanto, questa tecnologia non produrrà semi transgenici. Tuttavia, esistono tre principali vantaggi delle piante con elevata capacità di accogliere il campilobactere che rendono questa tecnologia molto utile. In primo luogo, molte specie vegetali, in particolare le specie dicotiledoni, possono essere trasformate mediante batteri agrobatterici.

In secondo luogo, non dobbiamo stabilire una coltura tessutale prima della trasformazione. Possiamo utilizzare diverse parti della pianta, come piantine, getti e co, per generare direttamente piante campy. Infine, possiamo ottenere tessuto radicale transgenico nell'arco di poche settimane.

Per le trasformazioni transgeniche di soia e medic, possiamo ottenere radici transgeniche in appena tre settimane, più velocemente rispetto alla trasformazione OPIS. Nel complesso, la tecnologia delle piante con radici citochinina-alte è uno strumento molto utile per lo studio delle funzioni geniche e dei fenotipi legati alle radici. No. Salve, mi chiamo Ong.

Ciao, mi chiamo, ecco il mio operatore Bill. Oggi presenteremo il protocollo della pianta composita Harry root. Sì, utilizziamo questo protocollo in diversi nostri progetti.

Già, abbiamo iniziato, sì. Sì. Per la nostra dimostrazione, utilizzeremo meta cargo Tula come esempio. Questi sono baccelli maturi di meta cargo.

Mettere i baccelli in una capsula di macinazione e quindi macinare i baccelli con un movimento lungo e deciso. Separare i semi dai baccelli agitando delicatamente e posizionare i semi in un tubo da centrifuga da 50 millilitri. Aggiungere quindi cinque millilitri di acido solforico concentrato.

Scalpello molto accuratamente. Richiede circa 10 minuti. Agitare il tubo con vortice acido da due a tre volte.

Durante il trattamento acido, il tegumento del seme diventerà di colore giallo. Rimuovere l'acido solforico dal tubo e risciacquare i semi almeno cinque volte con acqua sterile. Immergere i semi in acqua deionizzata a temperatura ambiente per sei ore, quindi mantenerli a quattro gradi centigradi per due giorni.

Per sincronizzare la germinazione. Distribuire da 20 a 30 semi su carta filtrante umida nella piastra di Petri. Dopo cinque-sei giorni, trasferire le piantine nel terreno e farle crescere in serra per quattro settimane.

Per la trasformazione delle piante composite, utilizziamo normalmente il ceppo di agrobatterio Zony K 5 99. Il vettore shuttle o il vettore binario possono essere trasformati nel ceppo K 5 99 seguendo il protocollo standard di trasformazione di agrobacterium tumefaciens. Inoculare l'agrobatterio, coltivarlo a 30 gradi centigradi per 16-24 ore; al termine del periodo di crescita, raccogliere le cellule posizionando la soluzione di coltura in un tubo da centrifuga da 50 millilitri.

Eseguire la centrifugazione a 5.000 G per 30 minuti. Risospendere il pellet con soluzione nutritiva priva di azoto. Assicurarsi di diluire le cellule di agrobatterio a 0,3 a OD 600.

Questa concentrazione è importante per una trasformazione massima. Utilizziamo la roccia di scisto come matrice di supporto. L'uso di questo materiale è importante per una trasformazione ad alta frequenza.

Tagliare la parete rocciosa nelle dimensioni corrette. Inserire un tappo. Praticare un foro nella parte superiore di circa uno e mezzo a due centimetri di diametro. Utilizzando una punta di pipetta, aggiungere cinque millilitri di soluzione di Agrobacterium Zony ri-sospesa in ogni tappo.

Selezionare un tratto di fusto con due o tre gemme ascellari ed effettuare un taglio obliquo. Inserire i tralicci vegetali nel foro nella parete rocciosa. Collocare le piante tagliate in una camera di crescita o sul banco del laboratorio per tre settimane.

Aggiungere cinque millilitri di soluzione nutritiva in ogni spina ogni 10 giorni. Dopo tre settimane, le radici si rigenerano dal lato tagliato. Immergere la pianta in acqua.

Rimuovere con cura la parete rocciosa ammorbidita senza danneggiare le radici. Assicurarsi di rimuovere completamente la parete rocciosa. È possibile trasferire le piante composite con radici capillari in sabbia o perlite. Per esperimenti di simbiosi, coltivare il rizobio in un mezzo di estratto di lievito e manitolo per sette giorni a 30 gradi Celsius.

Raccogliere le cellule zoia disgelate. Sospendere il pellet con la soluzione nutritiva priva di azoto. Diluire la soluzione fino a un valore di 0,08 a OD 600.

Aggiungere 10 millilitri di soluzione ZOA a ciascuna coltura di pianta composita, coltivare la pianta per altre due o tre settimane per consentire la formazione dei noduli. Rimuovere la sabbia dalle piante compositive estirpandole e lavandole. Utilizzare l'espressione della proteina fluorescente verde per verificare la radice transgenica.

Utilizzerai un microscopio a fluorescenza per eseguire questa procedura. Tutti i nostri costrutti di radici pelose possiedono una cassetta GFP costitutiva per la selezione delle linee transgeniche. Questa immagine mostra le piante composite con radici pelose transgeniche per GFP osservate al microscopio a fluorescenza.

Le radici transgeniche con una fluorescenza verde più intensa sono facili da distinguere rispetto alle radici non transgeniche. I noduli si formano nella radice pelosa delle piante composite. Ecco il protocollo completo.

Anche in questo caso, la generazione di piante composite con radici pelose è un metodo rapido e semplice per ottenere grandi quantità di tessuto transgenico, specialmente per specie diop. Sebbene questo metodo non permetta di ottenere semi transgenici, può produrre materiale transgenico in poche settimane. È particolarmente adatto per piante che presentano difficoltà nell'instaurare colture di tessuti e nella trasformazione.

Nel corso degli anni, abbiamo utilizzato questa tecnologia per studiare le funzioni geniche, le funzioni dei promotori, i microRNA, lo sviluppo della radice principale e delle radici laterali, la risposta allo stress difensivo e antibiotico, la nodulazione e altri processi simbiotici. Abbiamo analizzato la risposta ormonale, il profilo metabolico, il profilo genico e l'analisi proteomica impiegando piante composite con radici superiori. Speriamo che questo video vi aiuti ad adattare questo sistema alla vostra specie preferita.

È possibile contattarci per domande relative a questa tecnologia e in bocca al lupo.