Name: Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 13 s
Description: Impara l'isolamento rapido dei testicoli da Drosophila melanogaster maschi di 0-3 giorni utilizzando aghi da dissezione e PBS freddo. Questo metodo consente analisi di RNA, proteine e immunofluorescenza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori ringraziano Vasia VAGIN per l&#39;introduzione di questa tecnica nel nostro laboratorio.

<ol><li> Fare un vetrino da microscopio in vetro con uno sfondo nero: Tagliare carta da 20 # bianco delle stesse dimensioni del vetrino da microscopio. Colore un lato della slide-nero Taglia carta con un pennarello indelebile (ad esempio, Sharpie). Applicare la colla bianca (Elmer) per il lato nero e aderire la carta alla diapositiva. La presentazione può essere riutilizzato. Utilizzando ¾ "tape label (Fisherbrand), fissare il vetrino da microscopio, vetro laterale alto, al pad CO 2 volare a fissarlo. </li><li> Raccogliere 0-3 vola maschio giorno. </li><li> Preparare un secchio di ghiaccio, PBS (PBS), aghi di dissezione. </li><li> Anestetizzare 50-100 vola utilizzando un flusso di CO 2 e trasferirli dalla bottiglia o flacone per il pad volare vicino al vetrino da microscopio. </li><li> Pipettare ~ 50 microlitri ghiaccio PBS freddo in una goccia nel mezzo del vetrino da microscopio. </li><li> Delicatamente prendere un moscerino maschio con la dissezione ago-dip l'ago dissezione in PBS, tocco gentile lato ventrale (cioè, in prossimità delle ali) della mosca con l'ago posto in una goccia di PBS. </li><li> Posto un ago al centro della mosca, tra il torace e l'addome, spingendo con decisione. Posizionare l'ago altro tra il sesto (A6) e settimo (A7) segmenti addominali (le strisce secondo e il terzo dal basso); tirare l'addome di distanza dal torace. </li><li> Stuzzicare i testicoli a parte altri organi, in particolare dell'intestino. Soprattutto in mutanti bianco, testicoli e intestino simile. Differenze principali sono che testicoli vengono sempre a coppie, ognuna testicolo è un percorso a spirale ed è più di colore bianco che nell'intestino. </li><li> Conservare i testicoli nella gelida PBS in una provetta polipropilene. </li></ol> Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2641/2641fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Vista dorsale del sistema riproduttivo maschile, da flybase.org/reports/FBim0000074.html. Flybase attribuzione:... "Dopo Figura 38 A a pagina 508 di Miller (1950) A. Miller, L'anatomia interna e istologia della imago di Drosophila melanogaster In M. Demerec, editore, Biologia della Drosophila, capitolo 6, pagine 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, edizione facsimile, 1994. Copyright 1994 da Cold Spring Harbor Laboratory Press. Utilizzato per gentile concessione del Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) Premere. Vedere <a href="http://www.cshlpress.com">http://www.cshlpress.com</a> ".

<ol><li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+Techniques+for+Studying+the+Drosophila+Male+Germline+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell.</a> Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Forniamo un protocollo per isolare i testicoli di adulto maschio di Drosophila melanogaster. Perché la tecnica richiede coordinamento proprio due mani, l&#39;abilità viene solo con la pratica.

<table><tbody><tr><td>Ago da dissezione</td><td>Strumento</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17346</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini microscopici, lisci</td><td>Strumento</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553</td><td></td></tr><tr><td>Luce per microscopio</td><td>Strumento</td><td>Schott AG</td><td>KO-1500</td><td></td></tr><tr><td>Pad per CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Strumento</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>Sistema completo Benchtop Flowbuddy</td><td>Strumento</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td></td></tr><tr><td>Umidificatore a bolle</td><td>Strumento</td><td>Salter Labs</td><td>7100</td><td></td></tr><tr><td>Ago per riempimento a sfera</td><td>Strumento</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Nastro etichette &amp;#190;&amp;#8221;</td><td>Consumabile</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-5B</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di drosophila melanogaster testicoli

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

I testicoli di Drosophila melanogaster fornire un importante modello per lo studio della manutenzione e la differenziazione delle cellule staminali, la meiosi, e soma-germinale interazioni. I testicoli sono tipicamente isolate da maschi adulti 0-3 giorni dopo eclosion dal caso pupa. I testicoli di wild-type mosche sono facilmente distinguibili da altri tessuti perché sono gialle, ma i testicoli del bianco mosche mutanti, un background genetico comune per esperimenti di laboratorio sono simili in forma e colore per l&#39;intestino volare. Esecuzione di dissezione su un vetrino di vetro con uno sfondo nero rende l&#39;identificazione dei testicoli molto più semplice. Testicoli vengono rimossi dalle mosche utilizzando aghi dissezione. Rispetto ai protocolli che utilizzano pinze per la dissezione dei testicoli, il nostro metodo è molto più veloce, che consente una ben praticata individuale di sezionare testicoli 200-300 wild-type vola per ora, cedendo 400-600 testicoli. Testicoli dalle mosche bianche o da mutanti che riducono le dimensioni dei testicoli sono più difficili da analizzare e in genere resa testicoli 200-400 all&#39;ora.

Drosophila melanogaster testicoli possono essere rapidamente ed efficacemente isolato da maschi adulti con aghi dissezione. Con la pratica, si può facilmente isolare in uno o due giorni una quantità di testicoli sufficiente per l&#39;analisi del DNA o RNA mediante sequenziamento throughput elevato o più tradizionali metodi di biologia molecolare o di proteine ​​per i test degli anticorpi-o a base di enzimi.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

I testicoli di Drosophila melanogaster rappresentano un modello importante per lo studio del mantenimento e del differenziamento delle cellule staminali, della meiosi e dell'interazione soma-linea germinale...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i testicoli di Drosophila melanogaster maschi da zero a tre giorni di vita. Questo viene ottenuto anestetizzando le mosche maschio ed estraendo i loro testicoli in una goccia di PBS freddo sotto un microscopio, utilizzando due aghi da dissezione per staccare l'addome dal torace della mosca.Infine, separare delicatamente i testicoli dal resto del tessuto e raccoglierli per l'uso in diverse tecniche analitiche, come immunofluorescenza, colorazione istologica o isolamento di RNA totale e proteine. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché l'identificazione dei testicoli dissecati può risultare difficile da apprendere, essendo difficili da distinguere dall'intestino. La procedura sarà dimostrata da Shemei Ma, un tecnico del mio laboratorio.Preparare innanzitutto un secchiello con del ghiaccio, aghi da dissezione e circa 100 millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato. Collocare il PBS nel secchiello del ghiaccio per raffreddarlo. Preparare un vetrino con sfondo nero ritagliando della carta bianca da 20 libbre in modo che si adatti al vetrino.Quindi colorare un lato in nero. Utilizzando un pennarello indelebile, incollare il foglio in posizione sul vetrino e fissare il vetrino al tampone di CO2. Sotto un microscopio stereoscopico, anestetizzare con un flusso di CO2 una provetta contenente moscerini di età compresa tra zero e tre giorni ed estrarli sul tampone.Vicino al vetrino fissato, identificare le mosche maschio in base ai caratteristici uncini di accoppiamento di colore scuro e selezionarne da 50 a 100. Pipettare circa 50 microlitri di PBS freddo al centro del vetrino, formando una goccia. Prelevare una mosca maschio immergendo un ago da dissezione nella goccia di PBS e toccando delicatamente il lato ventrale della mosca, in modo che aderisca all'ago.Posizionare la mosca nella goccia di PBS e premere saldamente un ago tra il torace e l'addome della mosca. Premere l'altro ago tra il sesto e il settimo segmento addominale, quindi tirare l'addome lontano dal torace. Separare delicatamente i testicoli dal resto degli organi, in particolare dall'intestino, che può apparire simile, per aiutare a distinguere i testicoli dall'intestino.Ricordare che i testicoli sono sempre presenti a coppie, hanno una forma spiraliforme caratteristica e sono più chiari rispetto al tessuto intestinale. Raccogliere i testicoli in una provetta per microcentrifuga contenente PBS freddo di ghiaccio e conservarli sul ghiaccio, dove possono essere mantenuti per diverse ore. Una volta acquisita dimestichezza, è possibile dissezionare un moscerino in meno di un minuto seguendo questa procedura.Altri metodi, come il sequenziamento profondo di piccole RNA silenziatrici o di microRNA, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio come cambia il repertorio di RNA in una particolare mosca mutante?

isolation-of-drosophila-melanogaster-testes

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video descrive la dissezione delle ghiandole accessorie dai moscerini maschi e mostra un esempio in cui la ghiandola isolata sarà dissociata in una sospensione a singola cellula.

drosofila Dissezione della ghiandola accessoria maschile: un metodo per isolare le cellule secondarie

Questo video descrive l'anatomia generale dell'ovaio di Drosophila e presenta un metodo di dissezione delle ovaie per l'imaging dal vivo o fisso.

Drosophila melanogaster Dissezione ovarica: una tecnica per la preparazione dei tessuti ex vivo

Questo video descrive la ghiandola ad anello di Drosophila, una complessa struttura endocrina importante per la biosintesi e la secrezione di ecdisteroidi e altri ormoni. Il protocollo presentato ne dimostra la dissezione, la fissazione e l'immunocolorazione.

Dissezione della ghiandola dell'anello larvale: isolamento degli organi endocrini in via di sviluppo da Drosophila

Stadio-specifica isolamento di medio-tardiva follicoli Drosophila è utile per una varietà di scopi. Tali follicoli si sviluppano nella cultura, che permette di manipolazioni genetiche e / o farmacologici per essere accoppiato con saggi in vitro di sviluppo e immagini dal vivo. Inoltre, follicoli possono essere usate per studi molecolari, come isolare mRNA e proteine.

L&#39;utilità della fase-specifici medio-tardiva<em&gt; Drosophila</em&gt; Follicolo isolamento

Metodi per isolare e preparare Drosophila testicoli campioni (vivere e fissa) per l'imaging dal contrasto di fase e microscopia a fluorescenza sono descritte qui.

L&#39;analisi citologica della spermatogenesi: Preparati Live e fisse di<em&gt; Drosophila</em&gt; Testicoli

Questo protocollo descrive la dissezione e la coltivazione di testicoli intatti e cisti germinali da pupe di Drosophila melanogaster. Questo metodo consente l'osservazione microscopica della spermatogenesi ex vivo. Inoltre, descriviamo un saggio farmacologico dell'effetto degli inibitori su specifici stadi dello sviluppo delle cellule germinali nei testicoli delle pupe.

Ex vivo Cultura della Drosophila pupa testicolo e singolo maschio cisti germinale: Dissezione, Imaging, e trattamento farmacologico

Qui, presentiamo un protocollo per dissociare e ordinare una popolazione cellulare specifica dalle ghiandole accessorie maschili della Drosophila (cellule secondarie) per il sequenziamento dell'RNA e RT-qPCR. L'isolamento cellulare si realizza attraverso la purificazione FACS delle cellule secondarie che esprime GFP dopo un processo di dissociazione multifase che richiede dissezione, proteasi di gestione e dispersione meccanica.

Un protocollo basato su FACS per isolare l'RNA dalle cellule secondarie delle ghiandole accessorie maschili della Drosophila

L'integrità della barriera emato-encefalica è fondamentale per la funzione del sistema nervoso. Nella Drosophila melanogaster, la barriera emato-encefalica è formata da cellule gliali durante l'embriogenesi tardiva. Questo protocollo descrive i metodi per la formazione e la manutenzione delle barriere emato-encefalice negli embrioni di D. melanogaster e delle larve instar terze.

Analisi per l'integrità della barriera del cervello edelico nella Drosophila melanogaster

L'obiettivo di questo protocollo è quello di analizzare la divisione cellulare nel tessuto intatto mediante microscopia cellulare viva e fissa utilizzando spermatociti meioticiti della Drosophila. Il protocollo dimostra come isolare i testicoli interi e intatti dalle larve di Drosophila e dalle prime pupe, e come elaborarli e montarli per la microscopia.

Preparazione dei test di Drosophila Larval e Pupal per l'analisi della divisione cellulare in live, tessuto intatto

Presentiamo qui un protocollo migliorato per la preparazione a montaggio intero e l'immunostaining dei tester Drosophila, adatto per la microscopia confocale e che consente anche un'etichettatura riproducibile e affidabile. Illustriamo questo protocollo attraverso la rappresentazione 3D e la quantificazione degli esperimenti di colocalizzazione sui grandi spermatociti S4-S5.

Immunostaining dei test di Drosophila a montaggio intero per l'analisi confocale 3D di grandi spermatociti

Il protocollo descrive il metodo di ibridazione in situ a fluorescenza sensibile ai polimorfismi a singolo nucleotide (SNP-FISH) per distinguere i trascritti di RNA ribosomiale derivati dal locus del DNA ribosomiale del cromosoma X o Y in Drosophila melanogaster.

FISH sensibile al polimorfismo a singolo nucleotide Rilevamento della trascrizione dell'RNA ribosomiale specifico del locus in Drosophila melanogaster

Impara l'isolamento rapido dei testicoli da Drosophila melanogaster maschi di 0-3 giorni utilizzando aghi da dissezione e PBS freddo. Questo metodo consente analisi di RNA, proteine e immunofluorescenza.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

Esplora altri video