Name: Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 13 s
Description: Impara l'isolamento rapido dei testicoli da Drosophila melanogaster maschi di 0-3 giorni utilizzando aghi da dissezione e PBS freddo. Questo metodo consente analisi di RNA, proteine e immunofluorescenza.

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Gli autori ringraziano Vasia VAGIN per l&#39;introduzione di questa tecnica nel nostro laboratorio.

<ol><li> Fare un vetrino da microscopio in vetro con uno sfondo nero: Tagliare carta da 20 # bianco delle stesse dimensioni del vetrino da microscopio. Colore un lato della slide-nero Taglia carta con un pennarello indelebile (ad esempio, Sharpie). Applicare la colla bianca (Elmer) per il lato nero e aderire la carta alla diapositiva. La presentazione può essere riutilizzato. Utilizzando ¾ "tape label (Fisherbrand), fissare il vetrino da microscopio, vetro laterale alto, al pad CO 2 volare a fissarlo. </li><li> Raccogliere 0-3 vola maschio giorno. </li><li> Preparare un secchio di ghiaccio, PBS (PBS), aghi di dissezione. </li><li> Anestetizzare 50-100 vola utilizzando un flusso di CO 2 e trasferirli dalla bottiglia o flacone per il pad volare vicino al vetrino da microscopio. </li><li> Pipettare ~ 50 microlitri ghiaccio PBS freddo in una goccia nel mezzo del vetrino da microscopio. </li><li> Delicatamente prendere un moscerino maschio con la dissezione ago-dip l'ago dissezione in PBS, tocco gentile lato ventrale (cioè, in prossimità delle ali) della mosca con l'ago posto in una goccia di PBS. </li><li> Posto un ago al centro della mosca, tra il torace e l'addome, spingendo con decisione. Posizionare l'ago altro tra il sesto (A6) e settimo (A7) segmenti addominali (le strisce secondo e il terzo dal basso); tirare l'addome di distanza dal torace. </li><li> Stuzzicare i testicoli a parte altri organi, in particolare dell'intestino. Soprattutto in mutanti bianco, testicoli e intestino simile. Differenze principali sono che testicoli vengono sempre a coppie, ognuna testicolo è un percorso a spirale ed è più di colore bianco che nell'intestino. </li><li> Conservare i testicoli nella gelida PBS in una provetta polipropilene. </li></ol> Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2641/2641fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Vista dorsale del sistema riproduttivo maschile, da flybase.org/reports/FBim0000074.html. Flybase attribuzione:... "Dopo Figura 38 A a pagina 508 di Miller (1950) A. Miller, L'anatomia interna e istologia della imago di Drosophila melanogaster In M. Demerec, editore, Biologia della Drosophila, capitolo 6, pagine 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, edizione facsimile, 1994. Copyright 1994 da Cold Spring Harbor Laboratory Press. Utilizzato per gentile concessione del Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) Premere. Vedere <a href="http://www.cshlpress.com">http://www.cshlpress.com</a> ".

<ol><li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+Techniques+for+Studying+the+Drosophila+Male+Germline+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell.</a> Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Forniamo un protocollo per isolare i testicoli di adulto maschio di Drosophila melanogaster. Perché la tecnica richiede coordinamento proprio due mani, l&#39;abilità viene solo con la pratica.

<table><tbody><tr><td>Ago da dissezione</td><td>Strumento</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17346</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini microscopici, lisci</td><td>Strumento</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553</td><td></td></tr><tr><td>Luce per microscopio</td><td>Strumento</td><td>Schott AG</td><td>KO-1500</td><td></td></tr><tr><td>Pad per CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Strumento</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>Sistema completo Benchtop Flowbuddy</td><td>Strumento</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td></td></tr><tr><td>Umidificatore a bolle</td><td>Strumento</td><td>Salter Labs</td><td>7100</td><td></td></tr><tr><td>Ago per riempimento a sfera</td><td>Strumento</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Nastro etichette &amp;#190;&amp;#8221;</td><td>Consumabile</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-5B</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di drosophila melanogaster testicoli

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

I testicoli di Drosophila melanogaster fornire un importante modello per lo studio della manutenzione e la differenziazione delle cellule staminali, la meiosi, e soma-germinale interazioni. I testicoli sono tipicamente isolate da maschi adulti 0-3 giorni dopo eclosion dal caso pupa. I testicoli di wild-type mosche sono facilmente distinguibili da altri tessuti perché sono gialle, ma i testicoli del bianco mosche mutanti, un background genetico comune per esperimenti di laboratorio sono simili in forma e colore per l&#39;intestino volare. Esecuzione di dissezione su un vetrino di vetro con uno sfondo nero rende l&#39;identificazione dei testicoli molto più semplice. Testicoli vengono rimossi dalle mosche utilizzando aghi dissezione. Rispetto ai protocolli che utilizzano pinze per la dissezione dei testicoli, il nostro metodo è molto più veloce, che consente una ben praticata individuale di sezionare testicoli 200-300 wild-type vola per ora, cedendo 400-600 testicoli. Testicoli dalle mosche bianche o da mutanti che riducono le dimensioni dei testicoli sono più difficili da analizzare e in genere resa testicoli 200-400 all&#39;ora.

Drosophila melanogaster testicoli possono essere rapidamente ed efficacemente isolato da maschi adulti con aghi dissezione. Con la pratica, si può facilmente isolare in uno o due giorni una quantità di testicoli sufficiente per l&#39;analisi del DNA o RNA mediante sequenziamento throughput elevato o più tradizionali metodi di biologia molecolare o di proteine ​​per i test degli anticorpi-o a base di enzimi.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

I testicoli di Drosophila melanogaster rappresentano un modello importante per lo studio del mantenimento e del differenziamento delle cellule staminali, della meiosi e dell'interazione soma-linea germinale...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i testicoli di Drosophila melanogaster maschi da zero a tre giorni di vita. Questo viene ottenuto anestetizzando le mosche maschio ed estraendo i loro testicoli in una goccia di PBS freddo sotto un microscopio, utilizzando due aghi da dissezione per staccare l'addome dal torace della mosca.Infine, separare delicatamente i testicoli dal resto del tessuto e raccoglierli per l'uso in diverse tecniche analitiche, come immunofluorescenza, colorazione istologica o isolamento di RNA totale e proteine. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché l'identificazione dei testicoli dissecati può risultare difficile da apprendere, essendo difficili da distinguere dall'intestino. La procedura sarà dimostrata da Shemei Ma, un tecnico del mio laboratorio.Preparare innanzitutto un secchiello con del ghiaccio, aghi da dissezione e circa 100 millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato. Collocare il PBS nel secchiello del ghiaccio per raffreddarlo. Preparare un vetrino con sfondo nero ritagliando della carta bianca da 20 libbre in modo che si adatti al vetrino.Quindi colorare un lato in nero. Utilizzando un pennarello indelebile, incollare il foglio in posizione sul vetrino e fissare il vetrino al tampone di CO2. Sotto un microscopio stereoscopico, anestetizzare con un flusso di CO2 una provetta contenente moscerini di età compresa tra zero e tre giorni ed estrarli sul tampone.Vicino al vetrino fissato, identificare le mosche maschio in base ai caratteristici uncini di accoppiamento di colore scuro e selezionarne da 50 a 100. Pipettare circa 50 microlitri di PBS freddo al centro del vetrino, formando una goccia. Prelevare una mosca maschio immergendo un ago da dissezione nella goccia di PBS e toccando delicatamente il lato ventrale della mosca, in modo che aderisca all'ago.Posizionare la mosca nella goccia di PBS e premere saldamente un ago tra il torace e l'addome della mosca. Premere l'altro ago tra il sesto e il settimo segmento addominale, quindi tirare l'addome lontano dal torace. Separare delicatamente i testicoli dal resto degli organi, in particolare dall'intestino, che può apparire simile, per aiutare a distinguere i testicoli dall'intestino.Ricordare che i testicoli sono sempre presenti a coppie, hanno una forma spiraliforme caratteristica e sono più chiari rispetto al tessuto intestinale. Raccogliere i testicoli in una provetta per microcentrifuga contenente PBS freddo di ghiaccio e conservarli sul ghiaccio, dove possono essere mantenuti per diverse ore. Una volta acquisita dimestichezza, è possibile dissezionare un moscerino in meno di un minuto seguendo questa procedura.Altri metodi, come il sequenziamento profondo di piccole RNA silenziatrici o di microRNA, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio come cambia il repertorio di RNA in una particolare mosca mutante?

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Impara l'isolamento rapido dei testicoli da Drosophila melanogaster maschi di 0-3 giorni utilizzando aghi da dissezione e PBS freddo. Questo metodo consente analisi di RNA, proteine e immunofluorescenza.

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