Dissezione e immagini di zone attive nel Drosophila Giunzione neuromuscolare

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire una colorazione immunofluorescente per le proteine delle zone attive nei larve di terzo stadio e star di drosophila. Questo viene realizzato innanzitutto selezionando e fissando le larve sulla piastra per dissezione. Il secondo passaggio della procedura consiste nel dissezionare le larve, rimuovendo i tessuti in eccesso per esporre i muscoli e le giunzioni neuromuscolari.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'effettuare la colorazione immunoistochimica direttamente nel piatto di dissezione sui pelli di larva dissezionate. L'ultimo passaggio della procedura è il montaggio delle pelli di larva su un vetrino per microscopia. Alla fine, è possibile ottenere risultati sulla morfologia della zona attiva della giunzione neuromuscolare di CHO mediante microscopia a fluorescenza.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurologia, come la regolazione delle proteine della giunzione neuromuscolare coinvolte nella morfologia della zona attiva. Per creare una superficie di dissezione, versare il sigillante in silicone 180 4 (Sylgard) in una piccola piastra per colture cellulari. Accertarsi di non riempire completamente la piastra, in modo che l'area di dissezione risulti più bassa rispetto al bordo. Tagliare i perni da dissezione a una lunghezza di circa tre-cinque millimetri per facilitarne la manipolazione, e assicurarsi di disporre di almeno sei perni per ciascun larva, provenienti da ceppi wild type e mutanti. Identificare e selezionare larve di terzo stadio vaganti che si stanno muovendo attivamente lungo la parete del flacone e che non hanno ancora iniziato la metamorfosi.

Rimuovere due larve per ogni genotipo dai vial e posizionarle in una capsula di Petri contenente PBS per eliminare i detriti sotto un microscopio stereoscopico. Asciugare l'eccesso di umidità sulla superficie di dissezione utilizzando un fazzoletto di carta assorbente. Disporre le larve in modo che il lato dorsale sia rivolto verso l'alto e le due trachee bianche siano visibili lungo la parte dorsale del centro della larva.

Le trachee al centro delle larve segnano la posizione della linea mediana dorsale. Inserire il perno numero uno appena sopra i ganci boccali, quindi posizionare il perno numero due nella posizione della coda, appena sopra le sferette e tra le trachee. Aggiungere una piccola quantità di PBS alle larve per evitare l'essiccamento del tegumento.

Assicurarsi di mantenere separati i diversi genotipi posizionando un perno tra ciascun gruppo. Una volta fissati i larve con i perni, effettuare un taglio trasversale attraverso le trachee appena sopra il perno numero due. Inserire le forbici in questo taglio e proseguire il taglio lungo la linea mediana dorsale tra le trachee, fino a superare il perno numero uno se necessario.

Eseguire quattro piccole incisioni aggiuntive nella parte superiore e inferiore di ciascun lato della cuticola in modo che i lati destro e sinistro si aprano, consentendo di fissarli con puntine senza tirare sulla cuticola. Una volta che ogni angolo della cuticola è stato fissato piatto sulla piastra di dissezione, fissare le larve filettate con paraformaldeide al 4% per 20-25 minuti a temperatura ambiente. Dopo circa 25 minuti di fissazione, eliminare la paraformaldeide e lavare con PBS per 3 volte, eliminando ogni volta la soluzione mentre le larve sono in una goccia di PBS sotto il microscopio stereoscopico; afferrare l'estremità posteriore di una delle trachee con pinzette da dissezione ed estrarla.

Ripetere per la seconda trachea. Afferrare una parte del corpo adiposo posteriore o del tessuto intestinale ed estrarlo dalla zona di dissezione. Una volta rimosso la maggior parte del tessuto posteriore, concentrarsi sulla rimozione dei piccoli tessuti intorno al cervello.

Una volta che la pelle larvale è priva di tessuto in eccesso, può essere colorata direttamente sulla piastra di dissezione utilizzando un anticorpo primario per riconoscere la zona attiva, seguito da un anticorpo secondario fluorescente. Dopo la colorazione immunofluorescente della zona attiva, il passo successivo consiste nel montare le pelli larvali immunomarcate. Iniziare decantando ed asciugando con carta da filtro l'ultimo lavaggio successivo all'incubazione con l'anticorpo secondario ed aggiungere circa un millilitro di glicerolo all'80%. Per coprire le pelli larvali fissate, rimuovere tutti i perni tranne uno da ciascuna larva, quindi posizionare due gocce di mezzo di montaggio su un vetrino da microscopio.

Rimuovere il pin finale e afferrare i larve dalla coda con pinzette smussate. Trascinare le larve nella glicerolo, quindi posizionare le larve nella prima goccia di mezzo di montaggio e ripetere l'operazione con le larve rimanenti dello stesso genotipo. Una volta che tutte le larve si trovano nella prima goccia di mezzo di montaggio, prendere le larve una alla volta e trascinarle attraverso la goccia e poi lungo i bordi asciutti del vetrino per rimuovere la maggior parte del mezzo.

Quindi posizionare i larve nella seconda goccia di mezzo di montaggio. Preparare il vetrino finale etichettandolo e posizionando una piccola forma a T di mezzo di montaggio sul vetrino. Ripetere la procedura di trascinamento e asciugatura con le larve nella seconda goccia di mezzo di montaggio, quindi disporre le larve con il lato del tegumento rivolto verso il basso nel mezzo di montaggio.

Sull'ultimo vetrino, posizionare un coprioggetto per coprire le larve dissezionate con il bordo iniziale in alto. Nella parte superiore della T, posizionare un piccolo peso sul coprioggetto per circa cinque minuti per assicurare una completa diffusione del mezzo di montaggio, quindi lasciare riposare al buio finché il mezzo non si sarà completamente polimerizzato. Per preparare il vetrino per la microscopia, rimuovere eventuali residui di mezzo di montaggio e sigillare il coprioggetto con smalto per unghie. L'orientamento corretto delle pelli larvali montate è mostrato qui.

Si noti che le cuticole sono appiattite con il lato della cuticola rivolto verso il basso e che tra una cuticola e l'altra vi è almeno una distanza pari alla larghezza del corpo di una larva. Una volta terminate le dissezioni larvali, la colorazione e il montaggio, si può utilizzare la microscopia per identificare il muscolo larvale di interesse situato nei segmenti da A2 a A6.

Utilizzando un obiettivo ad alta potenza, è possibile focalizzare una singola sinapsi ed acquisire un'immagine a stack ZS mediante microscopio. Qui viene mostrata un'immagine rappresentativa di proiezione massima di una porzione di sinapsi, con colorazione NC 82 in verde e colorazione pre-sinaptica HRP in rosso. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un'immunomarcatura per proteine importanti delle giunzioni neuromuscolari, come quelle coinvolte nella morfologia della zona attiva.