Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare embrioni di topo E 8.5 per l'uso in saggi di cromatina, immunoprecipitazione o chip. Ciò si ottiene isolando prima gli embrioni di topo e preparando sospensioni di singole cellule. La seconda fase della procedura consiste nel reticolare chimicamente le proteine legate al DNA al DNA genomico, seguita dalla sonicazione per frammentare il DNA.

La terza fase della procedura consiste nell'immunoprecipitare i complessi proteici della cromatina e isolare il DNA purificato. La fase finale della procedura consiste nell'analizzare il DNA immunoprecipitato purificato mediante PCR convenzionale o PCR quantitativa in tempo reale. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano interazioni proteiche con sequenze regolatorie di geni specifici per il differenziamento durante l'inizio del programma di differenziamento in tessuti e organi in via di sviluppo.

Questo semestre può aiutare a rispondere a una buona domanda sull'avvio del programma di differenziamento durante l'embriogenesi attraverso l'identificazione di fattori regolatori che interagiscono con le sequenze regolatorie del gene specifico del differenziamento man mano che diventano trascrizionalmente competenti. Per iniziare questa procedura, le corna uterine vengono rimosse da un topo sacrificato al giorno embrionale 8.5. Secondo un protocollo approvato, il tessuto viene inserito in una capsula di Petri contenente terreni di sezione freschi utilizzando le forbici.

Tagliare ogni sito di impianto singolarmente e metterlo in una capsula di Petri contenente terreni di dissezione freschi per evitare l'eccesso di sangue. Con l'otto pinze, rimuovere lo strato uterino da ciascun sito di impianto per esporre i singoli embrioni isolati de sidu utilizzando una pinza. In questa fase dello sviluppo, gli embrioni sono circondati dal sacco vitellino parietale, che entra in contatto con il tessuto deum, il sacco vitellino viscerale e l'amnio.

L'amnio è una membrana trasparente che è a diretto contatto con l'embrione. Il sacco vitellino viscerale si trova tra l'amnio e il sacco vitellino parietale ed è facilmente distinguibile nel 8,5 per mangiare 9,5 embrioni per la presenza di vasi sanguigni prominenti che nutrono l'embrione. Rimuovere ogni embrione dalle membrane circostanti e trasferirlo singolarmente in una nuova piastra contenente mezzi di dissezione per rimuovere il sangue in eccesso.

Quindi trasferire ogni embrione in una provetta da 1,5 millilitri contenente 200 microlitri di terreno di dissezione. L'omogeneizzazione dell'embrione isolato inizia con l'aggiunta di 200 microlitri di collagenasi. Tipo due soluzione per ciascuna provetta contenente gli embrioni.

Agitare delicatamente i campioni in un agitatore a 37 gradi Celsius a 100 giri/min per 20 minuti. Quindi risospendere i campioni accarezzando per distruggere i grumi di cellule. Applicare la sospensione cellulare sulla parte superiore di un filtro cellulare sterile da 40 micron posizionato su un tubo eend rph da 1,5 millilitri.

Applicare immediatamente 600 microlitri di temperatura ambiente X-D-P-B-S sulla parte superiore del filtro cellulare per completare la separazione. Una volta filtrata la sospensione, scartare il filtro cellulare e centrifugare i campioni a 4.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, scartare i surnatanti reus.

Sospendere ogni pellet in un millilitro di temperatura ambiente uno X-D-P-B-S. Quindi centrifugare i campioni a 4.000 G per un minuto a temperatura ambiente. Dopo aver scartato la snat per la seconda volta, risospendere ciascun palato in 200 microlitri di terreno di dissezione a temperatura ambiente, reticolare la cromatina aggiungendo 5,6 microlitri di formaldeide al 37% ai campioni da 200 microlitri per una concentrazione finale dell'1% di formaldeide.

Incubare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente dopo l'incubazione, centrifugare i campioni a 4.000 G per tre minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante. Risospendere le cellule con un cocktail di inibitori della proteasi o PIC a freddo, contenente 80 microlitri per millilitro di inibitore della proteasi. Quindi centrifugare i campioni a 4.000 G per tre minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo aver scartato il surnatante, i campioni possono essere congelati a meno 80 gradi Celsius e sono stabili per diversi mesi prima della sonicazione, scongelare il pellet di cella congelato su ghiaccio o posizionare il pellet della fase precedente su ghiaccio. Risospendere la tavolozza cellulare in 100 microlitri di tampone di lisi SDS a temperatura ambiente dopo la sospensione di resus. Vengono aggiunti altri 100 microlitri di tampone di lisi SDS a temperatura ambiente e il campione viene risospeso mediante pipettaggio e inversione.

Incubare la sospensione cellulare su ghiaccio per 10 minuti. Dopo l'incubazione, impostare l'ator per tagliare il DNA cross-link in un numero compreso tra 200 e 500 coppie di basi. In questa dimostrazione, viene utilizzato un DIO geno bio rupture UCD 200.

Sonicare il campione circondato da un impasto di ghiaccio. Non lasciarlo riscaldare oltre i quattro gradi Celsius o congelare la centrifuga. Il campione sonicato a 14.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Trasferire il surnatante in un tubo DPH fresco e pre-raffreddare con ghiaccio. Dividere il campione sonicato in un massimo di cinque aliquote. Memorizzare un'aliquota a meno 20 gradi Celsius per riservare il suo input per l'inversione del cross-link.

Dieci volte le altre aliquote in tampone di diluizione del truciolo contenente PIC appena aggiunto a un microlitro per 800 microlitri di tampone. Innanzitutto, determinare quali velocità aerodinamiche verranno utilizzate per la pre-clearing in base all'anticorpo da utilizzare per la proteina del test del chip. Qui vengono utilizzate perline A perché l'anticorpo da utilizzare per il chip è rabbioso.

Pre-eliminare la superina diluita aggiungendo 75 microlitri di spermatozoo, DNA e proteine di salmone al 50%. A velocità aero incubata a quattro gradi Celsius con rotazione per un'ora dopo l'incubazione centrifugare i campioni a 2.500 G per un minuto a quattro gradi Celsius. Trasferire le supine in un nuovo tubo DPH pre-raffreddato.

Aggiungere quattro microgrammi di anticorpi per campione all'Eloqua pre-autorizzato e incubare per una notte a quattro gradi Celsius con rotazione. Iniziare aggiungendo 60 microlitri di sperma di salmone, proteina del DNA, una sospensione di perline aeros in ogni campione e incubare a quattro gradi Celsius con rotazione per un'ora. Centrifugare i campioni a 1000 G per un minuto a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione. Rimuovere con cura le supine e scartarle mantenendo il complesso di perline proteiche del DNA sul ghiaccio. Sospendere e lavare nuovamente i pallet come descritto nel protocollo scritto con i buffer da uno a quattro.

Ogni lavaggio è composto da un periodo di incubazione di cinque minuti con rotazione seguita da centrifugazione a 1000 G per un minuto e rimozione del surnatante dopo il lavaggio. Eluire il complesso anticorpale della cromatina mediante Resus Sospendendo il complesso di perle proteiche della cromatina lavato in 250 microlitri di tampone di eluizione appena preparato, agitare vigorosamente ogni campione per cinque secondi, quindi incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti con rotazione dopo la centrifugazione a 2.500 G per un minuto. A temperatura ambiente, trasferire ciascun eluato in un nuovo tubo eph.

Ripetere il processo eluciano e combinare l'eluato per ogni campione nella stessa provetta eph. Per invertire i legami incrociati, aggiungere 20 microlitri di cloruro di sodio da cinque moer a ciascun eluato da 500 microlitri. Per il controllo dell'ingresso precedentemente riservato, aggiungere 40 microlitri di cloruro di sodio da cinque moer per millilitro.

Riscalda gli EIT in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius per quattro ore. Per una notte, eseguire 10 microlitri di ciascun campione nel controllo di input su un gel aeros al 2% accanto a un marcatore di dimensioni che si estende da 0,1 a una coppia di kilobasi per controllare la dimensione del frammento di DNA. Il DNA apparirà come una macchia e non una banda affilata.

Recupera il DNA da ogni campione da 500 microlitri utilizzando un kit di estrazione rapida del gel kaya. Iniziare aggiungendo 600 microlitri di tampone qg per ottimizzare l'assorbimento del DNA con la membrana di silice in una colonna a rotazione rapida kaya e quindi aggiungere 200 microlitri di isopropanolo prima di caricare la colonna. Controllare la miscela per determinare se è presente un precipitato SDS.

Se si sono verificate precipitazioni SDS, i campioni devono essere riscaldati in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius fino a quando il precipitato non scompare. Quindi applicare i campioni alle colonne ed eluire il DNA secondo le istruzioni del produttore. La SDS può interferire con l'attività della PCRT polimerasi e deve quindi essere rimossa completamente prima di eseguire la PCR.

Incubare ogni campione di DNA su ghiaccio per far precipitare eventuali residui di SDS e centrifugare a 14.000 G per un minuto a quattro gradi Celsius. Trasferire il SANE in nuove provette einor. Gli EIT del DNA possono essere rilevati sia mediante PCR convenzionale che mediante PCR quantitativa in tempo reale o QPCR con primer specifico Per ogni sequenza da analizzare, utilizzare da cinque a 10 microlitri dal DNA totale IIT per una reazione PCR o QPCR, le condizioni di PCR e QPCR variano.

Tuttavia, la quantità limitata di materiale di partenza richiede cicli di PCR aggiuntivi per il rilevamento della PCR convenzionale, iniziare con 40 cicli e regolare secondo necessità. Utilizzando questo protocollo, sono stati eseguiti chip da embrioni E 8.5 ed E 9.5. Il DNA purificato con chip è stato analizzato mediante PCR convenzionale e PCR quantitativa in tempo reale.

I risultati dimostrano che il fattore miogenico e regolatorio è presente sul miogenico e sul promotore negli embrioni E 8.5 ed E 9.5. Al contrario, non c'era alcuna indicazione di miogenico e di legame con il miogenico e il promotore nel sacco di quercia dove la miogenia non è espressa. Il promotore dell'interferone gamma, che contiene sequenze corrispondenti al sito di legame miogenico, è stato utilizzato come controllo di sequenza negativo come previsto Myogenic non si è legato al promotore dell'interferone gamma in nessuno dei campioni di tessuto testati.

I risultati indicano che Myogenic è legato al promotore miogenico nei somiti degli embrioni E 8.5 ed E 9.5 poiché myo Genin è specificamente espresso nei somiti In queste fasi, dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e preparare gli embrioni di topo EA 0.5 per la precipitazione della cromatina che identificherà i fattori regolatori trovati nei geni specifici del tessuto nei tessuti in via di sviluppo.