Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare embrioni di topo a 8,5 giorni per l'utilizzo in saggi di cromatina, immunoprecipitazione o chip. Questo viene ottenuto innanzitutto isolando gli embrioni di topo e preparando sospensioni cellulari singole. Il secondo passaggio della procedura consiste nel reticolare chimicamente le proteine legate al DNA con il DNA genomico, seguito da sonicazione per frammentare il DNA.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'immunoprecipitare i complessi proteina-cromatina e isolare il DNA purificato. L'ultimo passaggio della procedura prevede l'analisi del DNA immunoprecipitato purificato mediante PCR convenzionale o PCR quantitativa in tempo reale. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano le interazioni proteiche con sequenze regolatorie di geni specifici della differenziazione durante l'avvio del programma di differenziazione nei tessuti e negli organi in via di sviluppo.

Questo semestre può contribuire a rispondere a importanti domande riguardo l'inizio del programma di differenziazione durante l'embriogenesi, attraverso l'identificazione di fattori regolatori che interagiscono con le sequenze regolatorie di geni specifici per il differenziamento, man mano che questi acquisiscono competenza trascrizionale. Per iniziare questa procedura, gli ovidotti uterini vengono rimossi da un topo sacrificato al giorno embrionale 8,5. Secondo un protocollo approvato, il tessuto viene posizionato in una piastra di Petri contenente mezzo di sezionamento fresco utilizzando delle forbici.

Tagliare singolarmente ciascun sito di impianto e posizionarli in una piastra di Petri contenente mezzo di dissezione fresco per evitare eccesso di sangue. Con l'aiuto delle pinzette, rimuovere lo strato uterino da ciascun sito di impianto per esporre il deciduo ed isolare singoli embrioni utilizzando le pinzette. In questa fase dello sviluppo, gli embrioni sono circondati dal sacco vitellino parietale, che è a contatto con il tessuto deciduale, dal sacco vitellino viscerale e dall'amnios.

L'amnios è una membrana trasparente che è a diretto contatto con l'embrione. Il sacco vitellino viscerale si trova tra l'amnios e il sacco vitellino parietale ed è facilmente distinguibile negli embrioni da 8,5 a 9,5 giorni per la presenza di vasi sanguigni prominenti che nutrono l'embrione. Rimuovere ogni embrione dalle membrane circostanti e trasferirlo singolarmente in una nuova piastra contenente mezzo di dissezione per eliminare l'eccesso di sangue.

Quindi trasferire ogni embrione in una provetta einor da 1,5 millilitri contenente 200 microlitri di mezzo di dissezione. L'omogeneizzazione dell'embrione isolato inizia con l'aggiunta di 200 microlitri di collagenasi. Tipo due soluzione in ogni provetta einor contenente gli embrioni.

Agitare delicatamente i campioni in un agitatore a 37 gradi Celsius a 100 giri al minuto per 20 minuti. Successivamente, risospendere i campioni picchiettando per rompere gli aggregati cellulari. Applicare la sospensione cellulare sulla parte superiore di un filtro cellulare sterile con maglia da 40 micron posizionato sopra una provetta eppendorf da 1,5 millilitri.

Applicare immediatamente 600 microlitri di D-P-B-S 1X a temperatura ambiente sulla parte superiore del filtro cellulare per completare la separazione. Una volta filtrata la sospensione, scartare il filtro cellulare e centrifugare i campioni a 4.000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, scartare i soprannatanti reus.

Sospendere ogni pellet in un millilitro di D-P-B-S 1X a temperatura ambiente. Centrifugare quindi i campioni a 4.000 ×g per un minuto a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il soprannatante per la seconda volta, risospendere ogni pellet in 200 microlitri di mezzo di dissezione a temperatura ambiente. Incrociare il cromatina aggiungendo 5,6 microlitri di formaldeide al 37% ai campioni da 200 microlitri, ottenendo una concentrazione finale di formaldeide dell'1%.

Incubare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente; al termine dell'incubazione, centrifugare i campioni a 4.000 G per tre minuti a quattro gradi Celsius e scartare il soprannatante. Risospendere le cellule in D-P-B-S freddo 1X contenente 80 microlitri per millilitro di cocktail inibitore delle proteasi o PIC. Quindi, centrifugare nuovamente i campioni a 4.000 G per tre minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo aver eliminato il soprannatante, i campioni possono essere congelati a meno 80 gradi Celsius e risultano stabili per diversi mesi prima della sonicazione; scongelare il pellet cellulare congelato su ghiaccio o posizionare il pellet ottenuto nel passaggio precedente su ghiaccio. Ri-sospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di tampone di lisi SDS a temperatura ambiente dopo la ri-sospensione. Aggiungere ulteriori 100 microlitri di tampone di lisi SDS a temperatura ambiente e ri-sospendere il campione mediante pipettaggio e inversione.

Incubare la sospensione cellulare sul ghiaccio per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, impostare l'ator per frammentare il DNA cross-linkato in frammenti compresi tra 200 e 500 paia di basi. In questa dimostrazione, viene utilizzato un DIO geno bio rupture UCD 200.

Sonicare il campione circondato da una miscela di ghiaccio. Non permettere che si riscaldi oltre i quattro gradi Celsius o che si congeli. Centrifugare il campione sonicato a 14.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Trasferire il sopranatante in una nuova provetta eend DPH preraffreddata su ghiaccio. Dividere il campione sonificato in un massimo di cinque aliquote. Conservare un'aliquote a meno 20 gradi Celsius per riservarne l'input per il ripristino del cross-link.

Diluire in modo graduale gli altri aliquote di dieci volte in buffer di diluizione per chip contenente PIC appena aggiunto, in quantità di un microlitro ogni 800 microlitri di buffer. Innanzitutto, determinare quali velocità aerodinamiche verranno utilizzate per la pre-pulizia in base all'anticorpo da impiegare per la proteina del saggio con chip. Qui vengono utilizzate perle A perché l'anticorpo da usare per il chip è di origine rabica.

Prepulire il surnatante diluito aggiungendo 75 microlitri di una soluzione al 50% di sperma di salmone, DNA e proteine. Incubare a velocità moderata a quattro gradi Celsius con rotazione per un'ora; al termine dell'incubazione, centrifugare i campioni a 2.500 ×g per un minuto a quattro gradi Celsius. Trasferire i surnatanti in una nuova provetta DPH preraffreddata.

Aggiungere quattro microgrammi di anticorpo per campione all'Eloqua pre-pulito e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius con rotazione. Iniziare aggiungendo 60 microlitri della sospensione di perle di salmone spermatozoi, DNA proteina, a aeros in ogni campione e incubare a quattro gradi Celsius con rotazione per un'ora. Centrifugare i campioni a 1000 G per un minuto a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione i soprannatanti e scartarli, mantenendo il complesso DNA-proteina-legame su ghiaccio. Ripesare e lavare i pellet come descritto nel protocollo scritto, utilizzando i tamponi da uno a quattro.

Ogni lavaggio prevede un periodo di incubazione di cinque minuti con rotazione, seguito da centrifugazione a 1000 G per un minuto e rimozione del sopranatante dopo il lavaggio. Eluire il complesso cromatina-anticorpo sospendendo nuovamente il complesso di perline proteiche con cromatina lavato in 250 microlitri di tampone di eluizione appena preparato; vortexare vigorosamente ogni campione per cinque secondi, quindi incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti con rotazione, dopo centrifugazione a 2.500 G per un minuto. A temperatura ambiente, trasferire ciascun eluato in una nuova provetta eppendorf.

Ripetere il processo di eluizione e combinare l'eluato di ogni campione nello stesso tubo eppendorf. Per invertire i legami incrociati, aggiungere 20 microlitri di cloruro di sodio 5 M a ogni eluato di 500 microlitri. Per il controllo input precedentemente conservato, aggiungere 40 microlitri di cloruro di sodio 5 M per millilitro.

Riscaldare i TEI in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius per quattro ore. Per l'analisi notturna, caricare 10 microlitri di ogni campione nel controllo di input su un gel all'1-2% di agarosio accanto a un marcatore di dimensione compreso tra 0,1 e un paio di chilobasi per verificare la dimensione dei frammenti di DNA. Il DNA apparirà come una striscia diffusa e non come una banda nitida.

Recuperare il DNA da ogni campione di 500 microlitri utilizzando un kit di estrazione da gel kaya quick. Iniziare aggiungendo 600 microlitri di buffer qg per ottimizzare l'assorbimento del DNA nella membrana di silice di una colonna kaya quick spin, quindi aggiungere 200 microlitri di isopropanolo prima di caricare la colonna. Verificare la miscela per determinare la presenza di eventuali precipitati di SDS.

Se si è verificata una precipitazione dell'SDS, i campioni devono essere riscaldati in un bagno a 42 gradi Celsius fino alla scomparsa del precipitato. Successivamente, applicare i campioni sulle colonne ed eluire il DNA seguendo le istruzioni del produttore. L'SDS può interferire con l'attività della polimerasi PCRT e pertanto deve essere completamente rimosso prima di eseguire la PCR.

Incubare ogni campione di DNA sul ghiaccio per precipitare eventuali residui di SDS e centrifugare a 14.000 ×g per un minuto a quattro gradi Celsius. Trasferire il SANE in nuove provette einor. I DNA EIT possono essere rilevati mediante PCR convenzionale o mediante PCR quantitativa in tempo reale o QPCR con primer specifici. Per ogni sequenza da analizzare, utilizzare da cinque a dieci microlitri del DNA totale IIT per una reazione di PCR o QPCR; le condizioni di PCR e QPCR varieranno.

Tuttavia, la quantità limitata di materiale iniziale richiede cicli aggiuntivi di PCR per la rilevazione mediante PCR convenzionale; iniziare con 40 cicli e regolare secondo necessità. Utilizzando questo protocollo, sono stati eseguiti esperimenti Chip sia su embrioni E 8,5 che su embrioni E 9,5. I DNA purificati mediante Chip sono stati analizzati mediante PCR convenzionale e mediante PCR quantitativa in tempo reale.

I risultati dimostrano che il fattore miogenico e regolatorio è presente sul promotore miogenico negli embrioni E 8,5 ed E 9,5. Al contrario, non vi era alcuna evidenza di legame miogenico al promotore miogenico nel sacco vitellino, dove il fattore miogenico non è espresso. Il promotore dell'interferone gamma, che contiene sequenze corrispondenti al sito di legame miogenico, è stato utilizzato come controllo negativo di sequenza; come previsto, il fattore miogenico non si è legato al promotore dell'interferone gamma in nessuno dei campioni di tessuto analizzati.

I risultati indicano che Myogenic è legato al promotore Myogenic nei somiti di embrioni a 8,5 e 9,5 giorni, poiché myo Genin è espressa specificamente nei somiti a questi stadi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e preparare embrioni di topo a 8,5 giorni per la precipitazione della cromatina, un saggio che permetterà di identificare i fattori regolatori associati a geni specifici dei tessuti in via di sviluppo.