Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è trasfettare singole cellule gangliari retiniche o piccoli gruppi di queste mediante elettroporazione in vivo in topi postnatali, al fine di studiare lo sviluppo delle proiezioni retinouticolari. Questo risultato si ottiene esponendo chirurgicamente il bulbo oculare e iniettando un piccolo volume di soluzione di DNA plasmidico direttamente nella retina. Come secondo passaggio, si posizionano degli elettrodi sul bulbo oculare esattamente sopra il sito di iniezione e si applicano impulsi elettrici, che consentono il trasferimento del DNA plasmidico nei neuroni retinici.

Successivamente, all'età desiderata, si prelevano le retine e i cervelli elettroporati per visualizzare i neuroni gangliari retinici trasfettati e le loro proiezioni al sistema nervoso centrale; i risultati ottenuti mostrano un'etichettatura fluorescente sia dei dendriti che degli ARB assonali dei neuroni gangliari retinici marcati nelle loro diverse strutture subcorticali bersaglio. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'elettroporazione retinica in utero, è che essa è meno invasiva e non interferisce con gli eventi precoci di guida assonale, come l'incrocio al chiasma ottico. Inoltre, consente di marcare una piccola popolazione o singoli neuroni gangliari retinici in topi postnatali con un controllo spaziale e temporale preciso.

Per realizzare gli elettrodi per l'elettroporazione, staccare un rene da una pinzetta Dumont numero cinque e saldare un filo alla base di ciascun rene. Avvolgere la base dei rene con filo isolato, nastro isolante e inserire un distanziatore di plastica tra i rene per garantire un'azione a molla. Una volta assemblati gli elettrodi, collegare il filo di un rene al pedale, che è collegato in serie allo stimolatore elettrico.

Quando si preme il pedale, la corrente scorre attraverso gli elettrodi. Successivamente, collegare il cavo dell'altra punta allo stimolatore elettrico. Infine, collegare lo stimolatore elettrico all'oscilloscopio e al monitor audio.

Montare il sistema di iniezione su un micromanipolatore a tre assi al banco utilizzando un tiratore di pipette. Preparare pipette di vetro tirate con un cono lungo e una punta piccola utilizzando un ago fornito con il nano Inject due. Riempire in retrovia una pipetta tirata con olio minerale e fissarla al microiniettore.

Utilizzando forbici da microdissezione affilate, tagliare la punta della pipetta montata per creare un'apertura di due-tre micrometri. Riempire la pipetta con la soluzione di iniezione aspirandola attraverso la punta aperta.

Anestetizzare i cuccioli di topo all'H 4-5 giorni dalla nascita mediante ipotermia e verificare lo stato anestetico con una pinzata al dito del piede. Posizionare il topo anestetizzato sotto un microscopio stereoscopico e aprire chirurgicamente la palpebra tagliando lungo tutta la lunghezza della futura apertura palpebrale con forbici da microdissezione; quindi protrudere il bulbo oculare applicando delicatamente pressione intorno all'orbita con una pinza.

Posizionare la pipetta vicino al bulbo oculare regolando il micromanipolatore. Premere il pedale del sistema di microiniezione con una mano per assicurarsi che la punta della pipetta non sia ostruita. Stabilizzare il bulbo oculare sporgente stringendo con la pinzetta la pelle intorno all'orbita oculare con l'altra mano.

Spostare il micromanipolatore in modo che la pipetta penetri attraverso l'epitelio pigmentato retinico ed entri nella retina. Rilasciare la quantità desiderata di soluzione premendo il pedale, ritrarre la pipetta e posizionare le punte degli elettrodi direttamente sopra il sito di iniezione. Su entrambi i lati del bulbo oculare, appena a contatto con la superficie, premere il pedale collegato allo stimolatore per chiudere il circuito ed elettroporare il bulbo oculare.

Spingere delicatamente l'occhio all'interno della sua orbita e applicare un unguento oftalmico sulla ferita. Posizionare i topi su un tappetino riscaldante mantenuto a 36 gradi Celsius finché non riprendono conoscenza e restituirli alla madre solo se transfettati con RG CS. Sia il plasmide che il gene codificante per la ricombinasi Cre, nonché lo stop flock per EGFP, sono in grado di esprimersi.

L'etichettatura di singole cellule EGFP si ottiene grazie alla concentrazione relativamente bassa del plasmide Cree utilizzato; singole cellule gangliari retiniche EGFP marcate, dendriti e assoni possono essere visualizzati in una retina montata in piano. Altri tipi cellulari retinici, come le cellule omicron a stella, possono essere etichettati anche con questa tecnica. Qui vediamo un esempio di un gruppo di neuroni retinici marcati con EGFP, inclusi cellule gangliari retiniche e cellule omicron, in una retina montata in piano al giorno 14 postnatale.

Utilizzando questa tecnica, possiamo analizzare il targeting retinico delle RG CS in un preparato in toto del collicolo superiore, partendo da tutte e quattro le principali coordinate retiniche nello stesso topo, una volta acquisita padronanza. Se eseguita correttamente, questa tecnica può essere completata in quattro o cinque minuti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come effettuare iniezioni focali di soluzioni, come DNA plasmidico, nella retina postnatale e della trasfezione in vivo dei neuroni retinici mediante elettroporazione.