Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

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L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di trasfettare singoli o piccoli gruppi di cellule gangliari retiniche utilizzando l'elettroporazione in vivo in topi postnatali per studiare lo sviluppo delle proiezioni ugali retiniche. Ciò si ottiene esponendo chirurgicamente il bulbo oculare e iniettando un piccolo volume di soluzione di DNA plasmatico direttamente nella retina. In una seconda fase, gli elettrodi vengono posizionati sul bulbo oculare direttamente sopra il sito di iniezione e vengono applicati impulsi elettrici, che consentono il trasferimento del DNA plasmatico nei neuroni retinici.

Successivamente, all'età desiderata, vengono raccolte retine e cervelli elettroporati per visualizzare le cellule gangliari retiniche trasfettate e si ottengono le loro proiezioni ai risultati del SNC che mostrano la marcatura fluorescente sia dei dendriti che degli ARB assonali delle cellule gangliari retiniche marcate nelle loro varie strutture bersaglio sottocorticali. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'elettroporazione retinica in utero, è che questa tecnica è meno invasiva e non interferisce con gli eventi di guida precoce degli assoni, come il passaggio al chiasma ottico. Ci consente inoltre di marcare una piccola popolazione o singole cellule gangliari retiniche in topi postnatali con un preciso controllo spaziale e temporale.

Per realizzare elettrodi per elettroporazione, rompere un polo da un paio di pinze dumont numero cinque, quindi saldare un filo alla base di ciascun polo. Avvolgere la base in fili con isolamento, nastro adesivo e inserire un distanziatore di plastica tra i rebbi per fornire un'azione elastica. Una volta assemblati gli elettrodi, collegare il filo da un polo al pedale, che è collegato in serie allo stimolatore elettrico.

Quando si preme il pedale, la corrente scorre attraverso gli elettrodi. Quindi, collegare il filo dall'altro polo allo stimolatore elettrico. Infine, collegare lo stimolatore elettrico all'oscilloscopio e al monitor audio.

Montare il sistema di iniezione su un micromanipolatore a tre assi al banco utilizzando un estrattore per pipette. Realizzare pipette di vetro estratte con una conicità lunga e una punta piccola utilizzando un ago fornito con il nano Inject two. Riempire nuovamente una pipetta estratta con olio minerale e fissarla al microiniettore.

Usando forbici affilate per microdissezione. Tagliare la punta della pipetta montata per creare un'apertura di due o tre micrometri. Riempire la pipetta con la soluzione iniettabile aspirandola attraverso la punta aperta.

Il topo anestetizzato scoppia a H da quattro a cinque giorni dopo la nascita per ipotermia. E confermare lo stato anestetico usando un pizzico di punta. Posizionare il topo anestetizzato sotto un cannocchiale da dissezione e aprire chirurgicamente la palpebra tagliando lungo la lunghezza della futura apertura palpebrale con le forbici per microdissezione, sporgere il bulbo oculare applicando delicatamente una pressione intorno all'orbita oculare con un paio di pinze.

Posizionare la pipetta vicino al bulbo oculare regolando il micromanipolatore. Premere il pedale del sistema di microiniezione per assicurarsi che il puntale della pipetta non sia ostruito con una sola mano. Stabilizzare il bulbo oculare sporgente pizzicando la pelle intorno all'orbita con una pinza con l'altra.

Spostare il micromanipolatore in modo che la pipetta penetri attraverso il pigmento retinico, l'epitelio ed entri nella retina. Erogare la quantità desiderata di soluzione premendo il pedale, ritrarre la pipetta e posizionare le punte degli elettrodi direttamente sul sito di iniezione. Su entrambi i lati del bulbo oculare appena toccando la superficie, premere il pedale collegato allo stimolatore per completare il circuito e sfilare elettronicamente il bulbo oculare.

Spingi delicatamente il bulbo oculare nella sua orbita e metti un unguento oftalmico sul taglio. Posiziona i topi su un termoforo mantenuto a 36 gradi Celsius fino a quando non riprendono conoscenza e restituiscili alla madre solo RG CS trasfettato. Con plasmide e codifica per Cree, la ricombinasi e il flock stop, gli EGFP sono in grado di esprimere.

La marcatura di singole cellule EGFP si ottiene in virtù della concentrazione relativamente bassa del plasmide Cree utilizzato: il singolo ganglio retinico marcato con EGFP, i dendriti cellulari e gli assoni possono essere visualizzati in una retina a montaggio piatto. Anche altri tipi di cellule retiniche come le cellule omicron starburst possono essere etichettati con questa tecnica. Qui vediamo un esempio di un gruppo di neuroni retinici marcati con EGFP, tra cui RG CS e cellule omicron in una retina a montaggio piatto al 14° giorno postnatale.

Utilizzando questa tecnica, possiamo analizzare il targeting per argomento della retina di RG CS in un intero colus superiore a montatura da tutte e quattro le principali coordinate retiniche nello stesso topo Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in quattro o cinque minuti se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come effettuare iniezioni focali di soluzioni come il DNA plasmatico nella retina postnatale e la trasfezione in vivo di neuroni retinici utilizzando l'elettroporazione.