Generazione di cellule staminali neurali da scartate tessuto fetale umano corticale

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule staminali neurali umane da tessuto corticale frontale scartato. Questo viene realizzato preparando innanzitutto in anticipo soluzioni e materiali prima di dissezionare cervelli fetali umani. Segue quindi il mantenimento delle cellule staminali neurali isolate, compresa l'ulteriore espansione, caratterizzazione e sperimentazione.

È possibile una conservazione a lungo termine, così come l'allestimento di colture secondarie per la differenziazione dei progenitori in tipi cellulari neuronali e gliali. In definitiva, la differenziazione delle cellule provenienti dal SNC normale può essere caratterizzata e confrontata con quella delle cellule derivate da SNC affetto da disturbi neurologici noti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi di qualsiasi disturbo umano del SNC.

La tecnica fornisce una piattaforma semplice e affidabile per valutare le S patologiche e per analizzare l'efficacia farmacologica di nuovi farmaci per un determinato disturbo. A causa del valore eccezionale delle cellule multipotenti, tutti i materiali devono essere pronti in anticipo rispetto all'inizio del protocollo. Per ridurre al minimo il rischio di compromettere i campioni, si è provveduto a preparare una dissezione refrigerata, un bagno di mezzo riscaldato a 37 gradi Celsius per la coltura, mezzo e cellule refrigerati e mezzo di congelamento per il lungo termine.

Per la dissezione in condizioni criogeniche, avere pinzette sterili autoclavate e lame di bisturi con manici pronti per la dissociazione cellulare. Disporre di una pipetta meccanica, pipette graduate da 10 millilitri e un filtro cellulare da 40 micrometri. Preparare e mettere da parte diverse piastre di coltura da 10 centimetri per la dissezione.

Tubi da centrifuga da 50 millilitri per la dissociazione. Tubi da centrifuga da 1,5 millilitri per la conservazione del tessuto e provette congelate per il congelamento delle cellule per garantire il successo. Tessuto vitale di 18-22 settimane deve essere raccolto entro due ore dalla sua disponibilità.

È preferibile ottenere il tessuto fetale entro pochi minuti dalla sua disponibilità, organizzando il prelievo dopo procedure elettive. I tessuti sono spesso frammentati, tuttavia una porzione significativa del cervello rimane integra. Raccogliere il cervello in una piastra Petri da 10 millilitri contenente dissection.Medium freddo.

Identificare le diverse parti della corteccia mediante punti di riferimento anatomici. I confini tra le cortecce frontale, parietale e occipitale sono determinati dall'intersezione estrapolata del solco centrale e del solco silviano. Dissezionare il tessuto dalla corteccia frontale anteriore rispetto al solco centrale e lungo il bordo del solco silviano utilizzando lame chirurgiche.

Assicurarsi che il ventricolo rimanga integro e non danneggiato. Ora rimuovere eventuali residui di sangue e meningi dal blocco di corteccia frontale separato. Se il campione non è troppo frammentato e ha dimensioni sufficienti, dissezionare il blocco in diversi campioni più piccoli, conservandone una parte per istologia e per saggi di proteine o mRNA.

Ora trasferire un blocco cerebrale in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e aggiungere un volume triplo di mezzo di dissezione freddo di ghiaccio rispetto a quello del tessuto. Utilizzando una pipetta, dissociare delicatamente il tessuto fino a quando tutti i tessuti risultano frammentati. Per sospendere completamente le cellule, filtrarle attraverso un filtro cellulare da 40 micromoli.

Ora centrifugare la sospensione cellulare e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di mezzo di coltura fresco e caldo. Utilizzando un emocitometro, contare il numero di cellule e calcolare il volume corrispondente a 2 milioni di cellule. Trasferire quindi ciascun volume di 2 milioni di cellule in una fiala da coltura quadrata da 25 centimetri quadrati.

Preparato con cinque millilitri di mezzo di coltura tiepido. Mantenere le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per una settimana. Cambiare metà del mezzo una volta alla settimana per colture più lunghe. Dopo una a due settimane di coltura, di solito si formano neurosfere con un diametro di NSC compreso tra 200 e 400 micron.

Per dissociare le neurosfere in singole cellule, incubare le cellule con EDTA nel mezzo di Hank per 15 minuti. Per preparare le cellule sospese per il sottocoltivo, centrifugare le cellule, lavarle con Hank e risospendere le cellule nel mezzo di coltura caldo.

Per avviare la differenziazione, piastrare le cellule dissociate su coprioggetti rivestiti con poli-l-lisina e laminina a una densità di 100.000 cellule per coprioggetto e incubare per 30 minuti. Le cellule possono essere facilmente differenziate in oligodendrociti, neuroni o astrociti.

Per la differenziazione neuronale, coltivare le cellule in mezzo contenente B 27 per sette giorni. Per la coltura di differenziazione in astrociti, coltivare le cellule in mezzo contenente FBS per sette giorni. Per la differenziazione in oligodendrociti, mantenere le cellule in mezzo modificato con fattori di crescita per due giorni e, dopo due giorni, utilizzare lo stesso mezzo modificato senza i fattori di crescita per altri cinque giorni per conservare le cellule staminali.

Dopo aver centrifugato le sospensioni cellulari dissociate, risospendere le cellule in mezzo di congelamento a una concentrazione di 10 milioni di cellule per provetta. Congelare lentamente le cellule a meno 20 gradi Celsius per millilitro, prima di trasferirle a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Successivamente, trasferirle nell'azoto liquido.

In seguito, le cellule vengono scongelate rapidamente in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e sospese nuovamente. In D-M-E-M-F 12 riscaldato più siero al 10% per un lavaggio. Le cellule riscaldate vengono quindi centrifugate, aspirate e risospese nel terreno di coltura riscaldato.

Cellule staminali neurali medie provenienti da un feto normale. A 18 settimane di età gestazionale, sono state coltivate per formare neurosfere, che sono state poi trasfettate con GFP. Le neurosfere sono state differenziate per generare diversi tipi cellulari, che successivamente sono stati fissati e colorati con marcatori cellulari e rumina.

La multipotenzialità è osservata mediante l'espressione di marcatori indicativi di neuroni, astrociti e oligodendrociti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare, espandere e manipolare cellule staminali neurali umane a partire da tessuto corticale frontale scartato. Queste regioni offrono un'opportunità unica per studiare le massime espressioni delle malattie nell'ambiente corticale umano e testare l'efficacia potenziale di agenti farmacoterapici.