Name: ampliPHOX rilevazione colorimetrica su un DNA microarray per linfluenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Impara la tecnica ampliPHOX per la rilevazione colorimetrica dell'influenza su microarray DNA. Questo metodo rapido utilizza la fotopolimerizzazione per visualizzare i sottotipi virali in pochi minuti con sensibilità comparabile alla fluorescenza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

InDevR riconosce NIH / NIAID U01AI070276 e R43AI077112 per il finanziamento di tale opera.

1. Esempio di amplificazione con RT-PCR <ol><li> Estrarre l'RNA virale da materiale clinico o da un isolato virale del virus usando il kit Qiagen MinElute Spin in collaborazione con il QIAcube piattaforma automatizzata estrazione degli acidi nucleici. Estrazioni vengono effettuate su 200 campioni microlitri con un volume di eluizione finale di 60 microlitri. Estratti di conservare a -70 ° C o inferiore per un uso successivo. </li><li> In un modello free-zona, preparare la RT-PCR master mix su ghiaccio secondo il protocollo del produttore. Per incorporare biotina Durante la RT-PCR, utilizzare una miscela biotinilati dNTP al posto del produttore fornito mix di dNTP. Il costo di utilizzo di una miscela biotinilato dNTP è meno di $ 1 USD / test. Metodi alternativi di incorporazione biotina come l'uso di un primer biotinilato può anche essere usato. Aggiungi fondo mescola a concentrazioni finale di 1,0 mM per l'influenza A, 1,0 mM per B Flu, e 0,14 mM per il controllo interno. L'influenza Un insieme Primer amplifica il segmento gene matrice (1032 prodotto nt) e l'influenza di fondo B amplifica un non-strutturali del segmento genico (811 prodotti nt). Ogni set fondo FluChip contiene un fondo con un 5 'gruppo fosforil per facilitare la generazione di DNA a singolo filamento tramite digestione enzimatica con esonucleasi lambda dopo PCR. Il prodotto risultante singolo filamento richiede tempi molto più brevi di ibridazione o superiore al controvalore a doppio filamento e riduce significativamente il tempo complessivo di analisi. Un pre-preparato miscela di questi primer e il modello di controllo interno RNA sono disponibili da InDevR ai ricercatori interessati su una base limitata. </li><li> Mescolare brevemente nel vortex e distribuire 18 l di mix master in tubi con pareti sottili PCR. </li><li> Trasferimento tubi sul ghiaccio ad un'area di lavoro più adatto per modello e modello di aggiungere 2 microlitri di ciascun tubo di reazione. </li><li> Trasferimento provette PCR ad un termociclatore ed eseguire il seguente profilo termico: la trascrizione inversa a 50 ° C per 30 minuti, l'inattivazione dell'enzima / attivazione a 95 ° C per 15 min, 40 cicli di PCR di 95 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 secondi e 72 ° C per 1 min, ed una estensione finale a 72 ° C per 10 min. </li></ol> 2. Ibridazione di RT-PCR prodotti microarray a bassa densità <ol><li> Al fine di generare DNA a singolo filamento per l'ibridazione FluChip, preparare la miscela digestione enzimatica, combinando 1,0 microlitri enzima esonucleasi lambda, 2,2 l di buffer di reazione di accompagnamento, e 0,8 l di acqua priva di nucleasi. Tali importi si riferiscono a un singolo campione, ma può essere semplicemente scalati per il numero totale di campioni per essere digerito. Rimuovere campioni dal termociclatore e aggiungere 4 ml di miscela pronta a ogni reazione a digerire il filone fosforilata del prodotto della PCR. Ritorna campioni al termociclatore e programmare il termociclatore a 37 ° C per 15 minuti seguita da 95 gradi Celsius per 10 minuti per completare la digestione enzimatica e passi la frammentazione di calore. </li><li> I microarray influenza personalizzati utilizzati sono stampati su lastre di vetro aldeide funzionalizzati da Applied Microarrays Inc. (Tempe, AZ). 5'-amino sequenze di acquisizione terminato sono combinati con un tampone ottimizzato spotting e stampati ad una concentrazione finale di 20 mM (tranne che per la sequenza di controllo positivo, che ha inoltre un 3'-biotina modifica e viene avvistato a una concentrazione finale di 500 nM) . Un non-contatto spotting metodo viene utilizzato, con un diametro dello spot ottimale di 300 micron e il centro a passo centro di 700 micron. </li><li> Rimuovere microarray dalla casella di stoccaggio e applicare monouso pozzi ibridazione in tutto il microarray rimuovendo il foglio protettivo e premendo con decisione intorno al perimetro bene. </li><li> Collocare i vetrini in un bidone lavare contenente 110 ml di acqua purificata per un min 5 pre-ibridazione lavare con un agitatore orbitale a 60-90 giri al minuto. Asciugare la matrice delicatamente toccando un tergicristallo tessuto al bordo del pozzo e permettendo all'acqua di essere malvagio distanza. </li><li> Unire 22 ml di tampone di ibridazione 2x con ciascuno dei prodotti frammentato ssDNA, e pipetta 40 ml di soluzioni di ibridazione nei pozzetti microarray. </li><li> Permettere che i vetrini a ibridare in camera umida chiuso per 60 minuti. </li><li> Rimuovere i vetrini dalla camera di umidità, brevemente risciacquare array con tampone di lavaggio D in un risciacquo bottiglia prima di inserire nel rack di diapositive. Di solito il volume di risciacquo di tampone di lavaggio D è di 2 ml per array. Luogo cremagliera diapositiva contenente le diapositive di bin lavare contenente 110 ml di Wash Buffer bin A. Mettere su agitatore orbitale a 60-90 rpm per 1 minuto. </li><li> Rimuovere il rack di scivolare dal tampone di lavaggio A, brevemente risciacquare con tampone di lavaggio D, far scorrere cremagliera trasferimento in un bidone contenente tampone di lavaggio B, e si agita a 60-90 rpm per 5 minuti. </li><li> Asciugare delicatamente l'array in ogni diapositiva, e il luogo diapositive essiccato in camera umida in preparazione ampliPHOX fasi di rilevamento colorimetrico. </li></ol> 3. ampliPHOX: etichettatura dei prodotti ibridato e patatine calibrazione con ampliTAG <ol><li> Combinare 10 ml di ampliTAG, 20 ml di tampone ampliTAG 2x, e 10 ml di acqua purificata per ogni array da elaborare. I volumi dei reagenti possono essere semplicemente scalati per il numero totale di campioni. Assicurarsi di preparare impasto abbastanza etichettatura per tenere conto di tutti gli array campione e gli array di taratura necessarie. Il numero di chip di taratura necessarie dipende dal fatto che si sta eseguendo una calibrazione completa (per uno strumento nuovo o nuovo lotto di reagenti), o semplicemente un controllo dello strumento. Per una calibrazione completa, 3 chip di taratura devono essere etichettati, e per un controllo reattivo, solo un singolo chip di taratura devono essere etichettati. Si prega di notare che prima della calibrazione array vengono etichettati, devono passare attraverso la pre-ibridazione fase di lavaggio che è stato precedentemente descritto per gli array influenza. </li><li> Trasferire 40 ml di miscela etichetta per ciascuna matrice e consentono l'uso di reazione di procedere in una camera umida chiuso per 5 minuti. </li><li> Sciacquare immediatamente gli array con tampone di lavaggio D in un risciacquo bottiglia prima di mettere le diapositive in un rack di diapositive. Trasferimento cremagliera in bin contenente 110 ml di tampone di lavaggio C, e agitare a 60-90 rpm per 5 minuti. </li><li> Utilizzando un secondo bidone lavare con acqua purificata, eseguire tre cadute consecutive acqua breve per rimuovere i residui di sale. Secco gli array delicatamente toccando un tergicristallo tessuto al bordo dei pozzetti. </li><li> I microarray sono ora correttamente etichettati con ampliTAG, e il resto della procedura di rilevamento ampliPHOX può essere eseguita. Fotoattivazione e l'imaging di array etichetta dovrebbe essere completato entro 24 ore, e gli array aggiuntivi possono essere memorizzati in una scatola buia scivolare fino al momento dell'uso. </li></ol> 4. ampliPHOX: calibrazione, amplificazione del segnale, e di imaging <ol><li> Girare ampliPHOX lettore e verificare ampliVIEW software è pronto per fotoattivazione. </li><li> Determinare il momento ottimale fotoattivazione utilizzando chip di calibrazione. In aggiunta alla breve introduzione che segue, questa procedura è descritta dettagliatamente nel manuale d'uso ampliPHOX. I chip di calibrazione contiene una serie di diluizioni di una sequenza di controllo biotinilato che vengono utilizzati per ottimizzare la sensibilità del test, con l'obiettivo di massimizzare il numero di righe del chip di calibrazione che producono un segnale positivo, come determinato dal software. </li><li> Rimuovere ampliPHY da 4 ° C, permettono di riscaldare a temperatura ambiente, e vortice brevemente per mescolare. Pipettare 3 ml di ampliPHY enhancer nel flaconcino ampliPHY, e vortice a fondo per 10 secondi. </li><li> Uniformemente trasferimento 40 ml di soluzione ampliPHY nel microarray contenente il bene ampliTAG marcato array, assicurando che non siano presenti bolle. Chiudere la fiala ampliPHY tra ogni applicazione. Inserire il vetrino microarray nella baia fotoattivazione del lettore ampliPHOX. </li><li> Per l'array prima calibrazione, utilizzare il tempo fotoattivazione predefinito nella casella 'Time' sul pannello sinistro del software, e fare clic sul pulsante verde 'Start' per avviare il fotoattivazione. Una volta completato, rimuovere l'array e sciacquare con acqua purificata per rimuovere ampliPHY in eccesso. Chiara la formazione di polimeri in alcuni dei luoghi dovrebbe essere visibile. </li><li> Lasciare i punti polimero ad asciugare per 2 minuti, quindi distribuire due gocce di ampliRED sul array e colorazione permettono di procedere per 2 minuti. </li><li> Poi, rapidamente microarray risciacquare con acqua purificata e asciugare con un tessuto pulire. </li><li> Inserire microarray nella baia di imaging del lettore ampliPHOX, e clicca sul pulsante 'Image Capture Nuovo' nella scheda Imaging. Una volta ripreso, regolare il raccolto e salvare l'immagine. </li><li> Nella scheda di analisi, selezionare la maschera Chip di calibrazione e il pulsante 'Placement Auto' per avviare l'analisi. Il software produrrà automaticamente un 'resoconto sommario' che mostra i risultati quantificati. Sulla base di questi risultati, il tempo fotoattivazione è regolata da 10 secondi per la matrice di calibrazione secondo, e il procedimento viene ripetuto. </li><li> Una volta che il tempo fotoattivazione ottimale è stato determinato, gli array campione può essere elaborati utilizzando l'amplificazione del segnale e lo stesso protocollo di imaging utilizzata per la calibrazione array. </li><li> Una volta che l'immagine viene acquisita per gli array campione, una maschera per il layout matrice particolare, come la struttura del sistema influenza qui descritto può essere created.The ampliVIEW software è in grado di eseguire l'analisi automatizzata delle immagini e generare risultati dell'influenza sottotipizzazione per ogni campione. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Illustrazione schematica del metodo di rilevazione ampliPHOX colorimetrico. (A) DNA bersaglio biotinilato è ibridato da ogni punto della matrice, e (B) marcato con ampliTAG. (C) soluzione ampliPHY è poi aggiunto, e (D) esposti alla luce per formare macchie polimero visibile. (E) Gli spot polimero formato vengono successivamente tinto con un colorante non tossico per migliorare il contrasto. CONTENUTO "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. (A) influenza il layout microarray a bassa densità. Sequenze di 1-7 e 10-13 influenza bersaglio A, e le sequenze di 8, 9 bersaglio il virus dell'influenza B. (B) ampliPHOX e (C) immagini di fluorescenza di un romanzo H1N1 2009 ('influenza suina') del campione che mostra lo stesso modello di rilevazione sia metodi. <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Da sinistra a destra, immagini rappresentative ampliPHOX per l'influenza A H3N2, di origine umana H1N1, 2009 H1N1 (di origine suina), e un campione negativo. Tutti e 3 i sottotipi di mostrare visivamente i modelli distinti sulla matrice. Si noti che in senso negativo solo il controllo interno MS2 è visto, indicando la RT-PCR l'amplificazione non è stato inibito.

<ol><li>Kumar, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Widely+Used+Diagnostics+%22DNA-Microarray%22-A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Amer+J+Inf+Dis%22%5BJournal%5D)">The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review.</a> Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).</li>
<li>Miller, M. B., Tang, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Concepts+of+Microarrays+and+Potential+Applications+in+Clinical+Microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology.</a> Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).</li>
<li>Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+microarrays+in+the+clinic%3A+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">DNA microarrays in the clinic: infectious diseases.</a> BioEssays. 30, 673-682 (2008).</li>
<li>Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+for+pathogen+detection+using+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays.</a> Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).</li>
<li>Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+the+future+hold+for+clinical+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">What does the future hold for clinical microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).</li>
<li>Dawson, E. D., Rowlen, K. L. MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDawson%2C+ED+%22Influenza%3A+Molecular+Virology%22">Influenza: Molecular Virology</a>. Wang, Q., Tao, Y. J. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. (2010).</li>
<li>Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+hemagglutinin+subtyping+and+pathotyping+of+avian+influenza+viruses+by+a+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray.</a> J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).</li>
<li>Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluChip%3A+Experimental+evaluation+of+a+diagnostic+influenza+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray.</a> J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).</li>
<li>Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+influenza+viruses+with+resequencing+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Inf+Dis%22%5BJournal%5D)">Identifying influenza viruses with resequencing arrays.</a> Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).</li>
<li>Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+DNA+Flow-Thru+Chip%2C+a+three-dimensional+biochip%2C+for+typing+and+subtyping+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses.</a> J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).</li>
<li>Kuck, L. R., Taylor, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photopolymerization+as+an+innovative+detection+technique+for+low-density+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays.</a> Biotechniques. 45, 179-186 (2008).</li>
<li>Avens, H. J., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+fluorescent+polymerization-based+signal+amplification+for+sensitive+and+non-enzymatic+biodetection+in+antibody+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomat%22%5BJournal%5D)">Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays.</a> Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).</li>
<li>Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+detection+using+polymerization-based+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Antigen detection using polymerization-based amplification.</a> Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).</li>
</ol>

Tutti gli autori sono dipendenti di InDevR, Inc., una scopo di lucro. InDevR sta commercializzando la tecnologia ampliPHOX qui descritti.

La rilevazione ampliPHOX colorimetrico tecnologia qui presentata è una rapida, alternativa economica alla rilevazione unico colore a fluorescenza per applicazioni a bassa densità microarray. Mostrato schematicamente nella Figura 1, il principio di rilevazione si basa sull&#39;utilizzo di una etichetta fotoiniziatore (1B). In presenza di un monomero contenente soluzione (1C), l&#39;esposizione alla luce fa sì che il fotoiniziatore (ampliTAG) per innescare una reazione di polimerizzazione solo nelle regio...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente / attrezzature </th><th> Fabbricante </th><th> Catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Qiagen MinElute Virus Kit Spin </td><td> Qiagen </td><td> 57704 </td><td> singola 60 microlitri di eluizione </td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td> opzionale </td></tr><tr><td> ABI 9800 Veloce termociclatore </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4441166 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen OneStep RT-PCR kit </td><td> Qiagen </td><td> 210210 </td><td> Kit dNTP non utilizzato </td></tr><tr><td> 2x Buffer Spotting </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5007 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilato dNTP Mix </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5009 </td><td></td></tr><tr><td> Lambda esonucleasi </td><td> Epicentre Biotecnologie </td><td> LE032K </td><td> 2500 U, 10U/μl </td></tr><tr><td> FluChip fondo mix </td><td> InDevR </td><td> N / A </td><td> non sono ancora disponibili per la vendita </td></tr><tr><td> Shaker orbitale </td><td> Madell Tecnologia </td><td> ZD-9556-A </td><td></td></tr><tr><td> Lavare Bins </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-4002 </td><td></td></tr><tr><td> Lavare Rack </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-4003 </td><td></td></tr><tr><td> Ibridazione buffer 2x </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5004 </td><td></td></tr><tr><td> Calibrazione Chips </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5006 </td><td></td></tr><tr><td> Lavare Buffer dC </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5005 </td><td></td></tr><tr><td> ampliRED </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5004 </td><td></td></tr><tr><td> ampliTAG </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2x ampliTAG Buffer </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5002 </td><td></td></tr><tr><td> ampliPHY, ampliPHY enhancer </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5003 </td><td></td></tr></tbody></table>

ampliphox rilevazione colorimetrica su un dna microarray per l&#39;influenza

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarray sono emerse come un potente strumento per la rilevazione di agenti patogeni. 1-5 Per esempio, molti esempi della capacità di tipo e sottotipo di virus influenzale sono stati dimostrati. 6-11 L&#39;identificazione e la tipizzazione di influenza sul DNA microarray ha applicazioni sia in pubblico salute e la clinica per la diagnosi precoce, l&#39;intervento rapido, e riducendo al minimo l&#39;impatto di una pandemia influenzale. Fluorescenza tradizionale è attualmente il più utilizzato metodo di rilevamento microarray. Tuttavia, come la tecnologia dei microarray progredisce verso l&#39;uso clinico, 1 sostituzione di strumentazione costosa tecnologia di rilevamento a basso costo che presentano caratteristiche di prestazioni simili a fluorescenza renderà saggi microarray più attraente e conveniente. La rilevazione ampliPHOX colorimetrico di tecnologia destinata ad applicazioni di ricerca, ed ha un limite di rilevazione all&#39;interno di un ordine di grandezza dei tradizionali fluorescenza 11, con un vantaggio principale è un approssimativo costo dieci volte inferiore rispetto a strumento del microarray scanner confocale necessari per fluorescenza microarray rilevamento. Un altro vantaggio è la compattezza dello strumento che consente la portabilità e flessibilità, a differenza dei tradizionali strumenti di fluorescenza. Perché la tecnologia di polimerizzazione non è così intrinsecamente lineare come rivelazione a fluorescenza, tuttavia, è più adatto per le applicazioni di densità più bassa microarray, in cui è desiderato un sì / no risposta per la presenza di una certa sequenza, come per gli array di rilevazione degli agenti patogeni. Attualmente la densità del punto massimo compatibile con la rilevazione ampliPHOX è ~ 1800 punti / array. A causa delle limitazioni densità posto, microarrays ad alta densità non sono adatti per il rilevamento ampliPHOX. Qui, vi presentiamo la tecnologia di rilevamento colorimetrico ampliPHOX come metodo di amplificazione del segnale su un microarray a bassa densità sviluppato per la rilevazione e la caratterizzazione dei virus influenzali (FluChip). Anche se questo protocollo utilizza il FluChip (un DNA microarray) come una specifica applicazione di ampliPHOX rilevazione, ogni microarray incorporando obiettivo biotinilato possono essere etichettati e rilevati in modo analogo. Il design microarray e biotinilazione del bersaglio da catturare sono sotto la responsabilità dell&#39;utente. Una volta che il bersaglio biotinilato è stato catturato sulla matrice, il rilevamento ampliPHOX può essere eseguito da tagging primo array con un coniugato streptavidina-label (ampliTAG). Su esposizione alla luce di usare lo strumento ampliPHOX Reader, polimerizzazione di una soluzione di monomero (ampliPHY) si verifica solo nelle regioni contenenti ampliTAG marcato obiettivi. Il polimero formato può essere successivamente colorato con un non-tossico soluzione per migliorare il contrasto visivo, seguita da immagini e analisi utilizzando un semplice pacchetto di software (ampliVIEW). Il test FluChip intero da un-estratto campione risultato può essere eseguita in circa 6 ore, e le fasi di rilevamento ampliPHOX descritto sopra può essere completata in circa 30 min.

ampliPHOX tecnologia di rilevamento colorimetrico viene presentato come un&#39;alternativa economica a fluorescenza per microarray. Sulla base di fotopolimerizzazione, ampliPHOX produce spot polimero solido visibile ad occhio nudo in pochi minuti. I risultati sono poi ripreso e interpretato automaticamente con un pacchetto software semplice ma potente.

ampliPHOX rilevazione colorimetrica su un DNA microarray per l&#39;influenza

I microarray di DNA sono emersi come uno strumento potente per l'identificazione dei patogeni.1-5 Per esempio, vi sono numerosi casi che dimostrano la capacità di tipizzare e sottotipizzare il virus dell'influenza...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare un nuovo e rapido metodo di amplificazione del segnale per rilevare e caratterizzare sottotipi virali dell'influenza sul chip per l'influenza, una piattaforma di microarray a bassa densità. Questo viene ottenuto incorporando DTP biotinilati e utilizzando primer con un'estremità fosfato in posizione 5' per amplificare il segmento del gene della matrice e un segmento del gene non strutturale da estratti di RNA influenzale. Successivamente alla PCR, si effettua una digestione enzimatica e una frammentazione per generare un prodotto virale amplificato, monocatenario e biotinilato, che viene quindi ibridato all'array dopo l'ibridizzazione.Il rilevamento Fox utilizza la fotopolimerizzazione per far crescere ampie macchie polimeriche nei punti in cui avviene l'ibridazione, e i modelli differenziali di ibridazione vengono impiegati per rilevare i sottotipi virali dell'influenza. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il rilevamento fluorescente standard, è che è piuttosto economico e fornisce un risultato rapido visibile ad occhio nudo, con una sensibilità analitica simile a quella della fluore

ampliphox-colorimetric-detection-on-a-dna-microarray-for-influenza

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Il Virochip è un pan-virale microarray progettati per rilevare contemporaneamente tutti i virus conosciuti e nuovi virus sulla base di omologia di sequenza conservati. Qui mostriamo come eseguire un test Virochip per analizzare i campioni clinici per la presenza di virus noti e sconosciuti.

Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

Questo metodo descrive l'utilizzo di Infrared sistema colorante di imaging based per il rilevamento di H1N1 in bronchioalveolar lavaggio (BAL) fluido di topi infettati ad una sensibilità elevata. Questa metodologia può essere eseguita in uno 96 - o 384-bene piastra, richiede &lt;10 volume pl di materiale di prova e ha il potenziale per lo screening concomitante di agenti patogeni multipli.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

In questo video, dimostriamo il processo per rilevare gli isotipi di anticorpi in più campioni di siero umano utilizzando un vetrino microarray stampato con sottotipi antigenici di ceppi di virus dell'influenza.

Saggio su microarray di antigeni virali per rilevare gli isotipi di anticorpi nel siero contro l'antigene virale

Il video mostra un test per quantificare i virus influenzali A e B. Questo test utilizza l'amplificazione dell'endonucleasi con primer specifici per l'influenza e il rilevamento del bersaglio mediante sonde beacon molecolari.

Un test su base molecolare per la quantificazione dei virus dell'influenza A e B

Integrato chip microfluidica termoplastico è stato sviluppato per l'utilizzo come diagnostica molecolare. Il chip esegue l'estrazione di acido nucleico, la trascrittasi inversa e PCR. Metodi per la fabbricazione e l'esecuzione del chip sono descritti.

Chip Fabrication Microfluidic e metodo per rilevare l&#39;influenza

Un microarray amplificazione combina asimmetrica amplificazione PCR e ibridazione microarray in una sola camera, che semplifica significativamente workflow microarray per l'utente finale. La semplificazione del flusso di lavoro microarray è un primo passo necessario per la creazione di sistemi diagnostici basati su microarray, che possono essere utilizzati di routine in ambienti inferiore di risorse.

Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplificazione Microarray

Utilizzando una strategia di microarray di glicani stampati, è stato miniaturizzato un test convenzionale su piastra a 96 pozzetti per l'analisi dell'avidità e della specificità dell'emoagglutinina del virus dell'influenza A per i recettori contenenti acido sialico.

Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine

Descriviamo un test rapido, molecolare a base di Influenza A e B. Il saggio Influenza rileva ogni bersaglio entro 15 minuti utilizzando l'amplificazione isotermica con primer specifici per l'influenza seguita da rilevamento di target con sonde segnale molecolare. Il saggio e influenza A B è facile da usare e richiede minimi hands-on tempo per eseguire.

Rilevazione rapida molecolare e la differenziazione dei virus influenzali A e B

Corrente multiplexed diagnostica per rilevare virus dengue, chikungunya e Zika richiedono preparazione campioni complessi e costosi strumentazione e sono difficili da utilizzare in ambienti di risorse in esaurimento. Vi mostriamo una diagnostica che utilizza amplificazione isotermica con sonde displaceable strand mirate per rilevare e distinguere questi virus con alta sensibilità e specificità.

Amplificazione isotermica multiplex basato su piattaforma diagnostica per rilevare Zika, Chikungunya e Dengue 1

Presentiamo un protocollo per l'utilizzo di un microarray proteico costruito stampando antigeni influenzali su vetrini rivestiti di nitrocellulosa per sondare simultaneamente il siero per più isotipi anticorpi contro oltre 250 antigeni provenienti da diversi ceppi di virus, quindi consentendo la misurazione dell'ampiezza degli anticorpi del siero attraverso i sottotipi di virus.

Uso di un microarray antigeno influenzale per misurare l'ampiezza degli anticorpi del siero attraverso i sottotipi di virus

Presentato qui un protocollo per un approccio di imaging a fluorescenza, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), un metodo in grado di visualizzare simultaneamente fluorescenza singola cellula di proteine virali e acidi nucleici di diverso tipo e filamento. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di sistemi.

Imaging a fluorescenza multiplexata a singola cellula per visualizzare acidi nucleici e proteine virali e monitorare HIV, HTLV, HBV, HCV, virus Zika e infezione influenzale

Impara la tecnica ampliPHOX per la rilevazione colorimetrica dell'influenza su microarray DNA. Questo metodo rapido utilizza la fotopolimerizzazione per visualizzare i sottotipi virali in pochi minuti con sensibilità comparabile alla fluorescenza.

ampliPHOX rilevazione colorimetrica su un DNA microarray per l'influenza

Esplora altri video