ampliPHOX rilevazione colorimetrica su un DNA microarray per l'influenza

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare un nuovo e rapido metodo di amplificazione del segnale per rilevare e caratterizzare i sottotipi virali dell'influenza sulla piattaforma di microarray a bassa densità del chip influenzale. Ciò si ottiene incorporando DTP biotinilati e utilizzando primer con un'estremità a cinque fosfoli principali per amplificare il segmento genico della matrice e un segmento genico non strutturale da estratti di RNA dell'influenza. La PCR è seguita dalla digestione enzimatica e dalla frammentazione per generare un prodotto virale biotinilato e amplificato a singolo filamento corto, che viene poi ibridato nell'array dopo l'ibridazione.

Il rilevamento di Fox utilizza la fotopolimerizzazione per far crescere grandi macchie polimeriche dove si verifica l'ibridazione e i modelli di ibridazione differenziale vengono utilizzati per rilevare i sottotipi virali dell'influenza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il rilevamento della fluorescenza standard, è che è piuttosto economica e fornisce un risultato rapido visibile ad occhio nudo con una sensibilità analitica simile alla fluorescenza. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulla caratterizzazione dei virus influenzali utilizzando il chip antinfluenzale, perché è un metodo di rilevamento universale.

Ampl Fox può essere applicato anche a un'ampia varietà di altri sistemi, come altri microarray a bassa densità basati su DNA e proteine. In teoria, qualsiasi prodotto biotinilato dovrebbe essere in grado di essere rilevato utilizzando amox. A dimostrare la procedura saranno Amber Taylor, scienziata associata, e Kevin Moulton, assistente di ricerca qui a Endeavor, che sono stati entrambi centrali nello sviluppo dello strumento Fox e della chimica di rilevamento negli ultimi anni.

Estrarre l'RNA virale da 200 microlitri di isolato virale utilizzando un kit di estrazione dell'RNA virale e il protocollo del produttore. Eluire 60 microlitri di volume finale e conservare gli estratti a una temperatura di meno 70 gradi Celsius o inferiore per un uso successivo. Quindi preparare la miscela master R-T-P-C-R su ICE secondo il protocollo del produttore.

Utilizzando una miscela DNTP BIOTINILATA, aggiungere la miscela di primer per chip antinfluenzali, che contiene le concentrazioni indicate nella miscela master. Un primer di ogni set deve contenere un gruppo fosfolo a cinque prime per facilitare la digestione enzimatica. Il set di primer per l'influenza A produce un prodotto di 1032 coppie di basi e il set di primer per l'influenza B produce un prodotto di 811 coppie di basi.

Agitare brevemente e distribuire 18 microlitri di master mix in provette PCR a parete sottile. Quindi aggiungere due microlitri di modello di RNA a ciascuna provetta di reazione. Trasferire le provette per PCR in un termociclatore e utilizzare un profilo ciclico con una temperatura di inginocchiamento appropriata.

Il profilo ciclico utilizzato in questo test è mostrato qui. Preparare la miscela per la digestione enzimatica combinando 2,2 microlitri di tampone di reazione enzimatica, 0,8 microlitri di acqua priva di nucleasi e 1,0 microlitri di enzima esonucleasi lambda per reazione PCR. Rimuovere i campioni dal termociclatore e aggiungere quattro microlitri a ciascuna provetta PCR.

Restituire i campioni al termociclatore e programmare il termociclatore come mostrato a 37 gradi Celsius per 15 minuti, seguiti da 95 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, applicare pozzetti di ibridazione monouso attorno ai microarray da ibridare. Quindi lavare i vetrini in 110 millilitri di acqua purificata su uno shaker orbitale per cinque minuti.

Asciugare i vetrini toccando delicatamente un panno di carta sul bordo del pozzetto. Combinare 22 microlitri di due tamponi di ibridazione con ciascuno dei prodotti di DNA frammentati a singolo filamento mescolati brevemente e pipettare 40 microlitri nei pozzetti del microarray. Lasciare ibridare i vetrini per un'ora in una camera di umidità dopo l'ibridazione, rimuovere i vetrini dalla camera di umidità e sciacquare brevemente ogni vetrino con due millilitri di tampone di lavaggio D.Posizionare i vetrini in un rack per vetrini.

Quindi, aggiungere 110 millilitri di tamponi di lavaggio A e B ai contenitori separati utilizzando uno shaker orbitale. Lavare la griglia per vetrini nel buffer A a una velocità compresa tra 60 e 90 giri/min, la velocità utilizzata per tutti i lavaggi successivi per un minuto. Quindi rimuovere la griglia per vetrini dal tampone di lavaggio A e risciacquare brevemente con il tampone di lavaggio D.Trasferire la griglia per vetrini sul tampone di lavaggio B e lavare sull'agitatore orbitale per cinque minuti.

Dopo il lavaggio, asciugare delicatamente i vetrini su ogni vetrino con un panno di carta e posizionare i vetrini asciutti nella camera di umidità. In preparazione per le fasi di rilevamento metrico del colore della volpe, combinare 10 microlitri di ampiezza, 20, microlitri di due tamponi di ampiezza e 10 microlitri di acqua purificata per ogni array da elaborare, trasferire 40 microlitri di miscela di etichette su ciascun array e lasciare che la reazione di etichettatura proceda in una camera di umidità chiusa Per cinque minuti Durante l'ibridazione, preparare 110 millilitri di tampone di lavaggio C in un contenitore. Dopo l'etichettatura, sciacquare immediatamente ogni matrice con il tampone di lavaggio D.Posizionare ogni vetrino nel rack per vetrini e lavare e lavare il tampone C sull'agitatore orbitale per cinque minuti dopo il lavaggio del tampone, immergere brevemente il rack per vetrini tre volte in un contenitore di acqua purificata.

Per rimuovere i residui di sale, asciugare gli array come mostrato in precedenza. Conservare gli array in una scatola di vetrini scura fino all'attivazione della foto e all'imaging, che dovrebbero essere completati entro 24 ore. Quindi, accendere il lettore Amli Fox e assicurarsi che il software Amli View sia pronto per l'attivazione della foto prima del rilevamento del campione dell'array.

Innanzitutto, determinare il tempo di fotoattivazione ottimale per tutti i campioni seguendo una breve procedura di calibrazione. Una volta per ogni uso quotidiano, quindi riscaldare la soluzione Amplify a temperatura ambiente e agitare brevemente per miscelare la pipetta tre microlitri di potenziatore Amplify nella fiala di Amplify e agitare accuratamente. Per 10 secondi, applicare uniformemente 40 microlitri di soluzione Amplify su un solo vetrino alla volta, assicurandosi che non siano presenti bolle.

Inserisci il vetrino del microarray nell'alloggiamento di attivazione fotografica del lettore Amplify. Avviare l'attivazione della foto selezionando, avviare nel software PL view utilizzando il tempo di attivazione della foto determinato nel processo di calibrazione. Una volta completato, sciacquare il microarray con due millilitri di acqua purificata per rimuovere l'eccesso, amplificare la formazione di un polimero chiaro si è verificata su punti contenenti DNA bersaglio, ma è meglio visualizzata.

Dopo la colorazione, lasciare asciugare le macchie di polimero per due minuti. Quindi distribuire due gocce di ampio rosso sull'array e lasciare procedere la colorazione per due minuti Dopo la colorazione, sciacquare rapidamente il vetrino con acqua purificata e asciugarlo come mostrato in precedenza, inserire il vetrino nell'alloggiamento di imaging del lettore Amli Fox per raccogliere un'immagine utilizzando il software amli per elaborare i risultati. L'immagine a sinistra mostra il rilevamento di un esemplare del 2009 di Amli Fox.

Mentre l'immagine a destra utilizza la fluorescenza tradizionale generata da uno scanner a fluorescenza confocale per microarray, lo stesso modello di rilevamento generale può essere facilmente visto per entrambi i metodi. Tuttavia, il risultato della volpe Amli è visibile ad occhio nudo. Queste immagini mostrano che il chip dell'influenza deriva da un'origine umana, H tre N due origine umana, H uno N uno, origine suina, H uno N uno e una matrice di volpe negativa priva di influenza rilevabile.

Le sequenze due e tre delineate in blu producono un segnale per tutta l'influenza. A sottotipi mostrati, ma le sequenze delineate in rosso in basso a destra producono solo un segnale per l'origine suina, H uno N un esemplare. Il campione negativo mostra un segnale su una sequenza di controllo interna delineata in verde, che indica l'assenza di inibizione o fallimento della reazione R-T-P-C-R.

Una volta padroneggiato l'intero processo, dall'estrazione della fiala al rilevamento dell'amox e all'interpretazione del risultato finale, può essere eseguito in circa sei ore. La parte della procedura relativa al rilevamento Ampl Fox, inclusa la calibrazione dello strumento, può essere completata in circa 30 minuti dopo questa procedura. Altri metodi, come il sequenziamento parziale o completo del genoma, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande.

Questo test dell'influenza è inteso come screening iniziale, in particolare per i campioni che determinano un modello di ibridazione unico. Poiché il rilevamento è un test generale, speriamo che i ricercatori trovino nuove e interessanti applicazioni di microarray a bassa densità per le quali il rilevamento potrebbe aggiungere valore.