Caratterizzazione del isolata, ventilata e polmone mouse Instrumented perfusi con flusso pulsatile

Studiare le relazioni pulsatili del flusso di pressione polmonare. Questo protocollo spiega come isolare, ventilare e perfondere i polmoni di topo. La trachea viene esposta chirurgicamente per la ventilazione.

Quindi il cuore e i polmoni vengono isolati in modo che l'arteria polmonare e l'atrio sinistro possano essere incannulati. Il sistema polmonare viene quindi perfuso. Gli esperimenti vengono eseguiti alterando il flusso, l'intensità, la forma d'onda e/o la frequenza dell'arteria polmonare.

Le forme d'onda risultanti dell'arteria polmonare e della pressione atriale sinistra vengono registrate e dimostrano le relazioni pulsatili del flusso di pressione polmonare. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le preparazioni in vivo, è che cambia le relazioni di flusso di pressione. Le relazioni tra pressione pulsata e flusso possono essere ottenute in assenza di cambiamenti nello stato del volume, nel tono del sistema nervoso simpatico, nell'attività e negli effetti dell'anestesia.

Inoltre, la maggior parte delle preparazioni polmonari isolate misura solo relazioni di flusso di pressione costante, mentre la nostra tecnica consente di determinare le relazioni di flusso di pressione pulsatile. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fisiologia polmonare, ad esempio in che modo la malattia vascolare polmonare influisce sull'emodinamica polmonare pulsatile o in che modo l'irrigidimento della grande arteria polmonare influisce sul postcarico ventricolare destro? La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'esposizione del cuore e dei polmoni e il fissaggio della cannula nell'arteria polmonare sono difficili da imparare.

L'eccessiva pressione della strumentazione può causare edema nei polmoni e un posizionamento improprio della cannula può perforare l'arteria polmonare. Prima di iniziare l'esperimento, è necessario preparare il sistema IL one utilizzato per ventilare e perfondere il polmone isolato. Il tubo deve essere collegato ai trasduttori di pressione.

O pompa e flussometro solitari Lavare completamente il sistema con acqua distillata riscaldata a 37 gradi Celsius e rimuovere eventuali bolle nel tubo. Quindi adescare il tubo della pompa Endur tech con l'1% di PBS. Ora zero.

La pressione per ogni trasduttore P 75 chiudendo prima la valvola al sistema IL one e aprendo la valvola all'atmosfera. Quindi utilizzare l'amplificatore SIS a spina per azzerare automaticamente la pressione prima di preparare l'animale, umidificare la configurazione IO one immergendo il pezzo poroso in ceramica in acqua distillata. Dopo aver anestetizzato il topo, stabilizzare il topo per l'intervento chirurgico fissando le zampe anteriori al tabellone.

Ora spruzzare il petto con alcol al 95%. Usa una pinza dritta per afferrare la pelle del collo e taglia un'apertura di un centimetro con le forbici dritte. Una volta che l'interno del collo è esposto, tagliare il tessuto ghiandolare bianco nei muscoli superficiali mentre si cerca l'esofago e la trachea.

Isolare l'esofago e la trachea dal tessuto su entrambi i lati e posteriormente e legare una sutura libera attorno alla trachea. Per incannulare la trachea, taglia con cura una piccola V su un lato di essa con le piccole forbici. Ora porta il mouse al sistema IL one usando una pinza smussata.

Afferra la cannula tracheale e falla scorrere nella trachea. Fissare la cannula con una sutura. Iniziare la ventilazione con aria ambiente, spruzzare il torace con alcol e rimuovere la pelle usando una pinza e una forbice dritta.

Taglia la pelle verso l'alto lungo lo sterno. Sollevare la pelle su ciascun lato e tagliare lungo la linea delle costole inferiori. Ora afferra il processo xifoideo con una pinzetta e usa le forbici a punta di sfera per praticare un foro nel diaframma dove incontra la parte inferiore dello sterno.

Afferra il diaframma e taglialo via dalle costole. Usando le forbici con punta a sfera, afferra di nuovo il processo xifoideo e usa le forbici con punta a sfera per tagliare con cura lo sterno attraverso le costole senza danneggiare i polmoni, il cuore o i vasi sanguigni. Per esporre il cuore, afferra le costole sinistre e taglia le loro punte.

Ora iniettare lentamente il ventricolo destro con 0,1 millilitri di eparina Dopo l'iniezione, tagliare il resto delle costole. Usa la parte posteriore o l'estremità arrotondata della pinza per spingere delicatamente i polmoni lontano dalla costola mentre tagli le costole al microscopio. Rimuovere il tessuto ghiandolare nel grasso sopra il cuore.

Usa le pinzette per tirare via i fazzoletti e tagliarli. Con le forbici a molla per posizionare una sutura attorno all'aorta e all'arteria polmonare, tocca delicatamente il cuore con una pinzetta smussata. Dovrebbe esserci poca resistenza.

Ora lega una sutura sciolta con il doppio lancio. Quindi, taglia via il basso addome. Usa le forbici angolate per tagliare le costole e la colonna vertebrale.

Ciò causerà un flusso significativo di sangue. Usa un cotton fioc per arrestare il flusso. Una volta interrotto il flusso sanguigno, adescare il sistema IL con quattro millilitri di RPMI da una siringa riempita con 10 millilitri di RPMI.

È bene ricontrollare che il tubo non contenga bolle. Ora cannula il ventricolo destro tagliando una piccola tacca vicino all'apice e inserendo la cannula Punta verso il basso a destra per raggiungere l'arteria polmonare. La punta della sonda dovrebbe essere visibile attraverso la parete quasi trasparente dell'arteria polmonare.

Quindi stringere la sutura attorno alla cannula, all'aorta e all'arteria polmonare per incannulare il ventricolo sinistro. Praticare una tacca all'apice e inserire la cannula rivolta verso l'alto nell'atrio sinistro. Potrebbe essere necessaria una leggera pressione per trovare la valvola, ma una volta trovata, la cannula scivolerà attraverso e sarà sicura senza sutura.

Infondere manualmente l'RPMI dalla siringa da 10 millilitri a 0,3 millilitri al minuto fino a quando non si vede il flusso nel tubo di deflusso. Se non c'è flusso nel tubo di deflusso, riposizionare la cannula del ventricolo sinistro. Tuttavia, se non c'è flusso nei polmoni, interrompere l'esperimento perché è probabile che l'arteria polmonare abbia una perdita.

Ora che il cuore è completamente incannulato, collegare la siringa da 60 millilitri al sistema IL one. Utilizzando la pompa a flusso costante, infondere l'RPMI Perfuse otto alla velocità di un millilitro al minuto. Verificare la presenza di perdite durante la perfusione iniziale.

Perfondere gradualmente i polmoni per altri due minuti, durante i quali i polmoni diventeranno bianchi. Per studi di flusso pulsatile. Per prima cosa impostare la cilindrata del pistone della pompa solitaria ai livelli desiderati.

Quindi impostare la portata costante. Ora apri la valvola della pompa osli e inizia a registrare i dati subito prima di eseguire il profilo di flusso osli. Al termine, aprire il file di output dei dati e tracciare il flusso sperimentale in base ai flussi sperimentali della prova iniziale.

Regolare la cilindrata del pistone della pompa oscillatoria a ciascuna frequenza in modo che Q max sia quello desiderato. Mantenere la ventilazione a una pressione costante Durante la raccolta dei dati per le prove a flusso costante, chiudere la valvola della pompa solitaria e impostare la portata costante al livello desiderato. Avviare la registrazione dei dati e passare attraverso il protocollo di flusso stazionario.

Raccolta dei dati per almeno 10 secondi Ad ogni velocità di flusso tra le prove. Ripristinare la portata a 0,5 millilitri al minuto. Assicurarsi di mantenere la ventilazione a una pressione costante durante la raccolta dei dati.

Se si desidera effettuare prove di pressione atriale sinistra pari a zero, rimuovere il tubo di deflusso durante l'esecuzione delle prove. Prestare attenzione alla presenza di RPMI nel tubo delle vie aeree. Gli RPMI non devono raggiungere i trasduttori di pressione delle vie aeree, altrimenti verranno danneggiati.

Di seguito sono riportati i risultati della perfusione a flusso costante con flusso Q nella riga superiore e le pressioni risultanti dell'arteria polmonare e dell'atrio sinistro nella seconda fila in una varietà di condizioni. Nei primi due pannelli, la pressione atriale sinistra aumentava e diminuiva con Q perché il tubo di deflusso era in posizione, il primo pannello mostra la pressione dell'aria all'estremità, la pressione inspiratoria e il secondo mostra la pressione dell'aria all'estremità della pressione espiratoria. Successivamente, il tubo è stato rimosso in modo che la pressione atriale sinistra fosse costante e indipendente da Q.Quindi l'altezza del tubo di uscita è stata regolata manualmente in modo che la pressione atriale sinistra fosse più alta.

Ma indipendentemente da Q, il primo pannello mostra la pressione dell'aria alla fine, la pressione inspiratoria, e il secondo mostra la pressione dell'aria alla fine. Pressione espiratoria. Le relazioni costanti risultanti tra il flusso di pressione dell'arteria polmonare per ciascun caso possono essere ottenute tracciando la pressione rispetto al flusso.

Ecco i risultati della perfusione del flusso pulsatile con il flusso Q nel pannello superiore e le conseguenti pressioni dell'arteria polmonare, dell'atrio sinistro e dell'aria. Nel pannello inferiore. Da queste relazioni pulsatili del flusso di pressione polmonare, è possibile calcolare l'impedenza vascolare polmonare, che riflette il postcarico ventricolare destro totale.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20-30 minuti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante prendersi il tempo necessario e rilassarsi in modo che le mani siano ferme. Una volta che i polmoni sono adeguatamente perfusi, la parte dura è finita.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguite altre tecniche come l'istologia o i saggi biochimici sul tessuto polmonare per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali meccanismi molecolari sono responsabili dei cambiamenti osservati nelle relazioni di flusso di pressione pulsatile polmonare. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della fisiologia polmonare per esplorare il ruolo di geni e proteine specifici nello sviluppo e nella progressione della malattia vascolare polmonare utilizzando topi geneticamente modificati.