In vivo Laser assotomia in C. elegans

Un protocollo per ridurre i neuroni in

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di tagliare con precisione i neuroni della CL con un laser in vivo. Ciò si ottiene assemblando il sistema di tassonotomia e mettendo a fuoco, allineando e regolando con precisione la potenza del laser. Quando i vermi vengono immobilizzati su un vetrino da microscopio, i loro neuroni possono essere tagliati con un preciso controllo spaziale e temporale.

La misura in cui i neuroni recisi si rigenerano viene quindi misurata mediante il punteggio per i coni di crescita e/o tracciando le lunghezze dei neuriti. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il laser a femtosecondi, è che il laser a impulsi a micropunti è un sistema economico che è facile da configurare e mantenere ed è facilmente adattabile per un'ampia varietà di applicazioni, anche se in genere applichiamo questo metodo per studiare la rigenerazione dei motoneuroni GABA. Il sistema può essere utilizzato anche per ablare altri tipi di cellule, come la pelle, il muscolo o la sinapsi neuronale specifica.

Questo metodo richiede un sistema laser a micro punti. Il laser si monta sulla porta di epifluorescenza di un microscopio composto e include un singolo dicroico che corrisponde al fluoroforo nelle cellule da tagliare, un generatore di impulsi e un pedale per azionare il laser. Come minimo, il microscopio deve essere dotato di un obiettivo a olio 100 volte 1,4 NA e di un obiettivo quattro volte.

Avere un tavolino motorizzato con azionamento a joystick ed essere montato su un tavolo d'aria per l'illuminazione. Al laser a micro punti è collegata un'alimentazione luminosa con guida di luce e un meccanismo di scatto. Il meccanismo dell'otturatore è utile per ridurre l'intensità dell'illuminazione indipendentemente dal laser.

Una telecamera collegata a un computer richiede un frame rate di almeno 16 hertz e deve funzionare bene in condizioni di luce ridotta. Il computer richiede software di imaging come gli elementi Nikon per visualizzare i neuroni, guidare la fotocamera e manipolare il tavolino motorizzato. Una volta completamente assemblato, l'utente può mettere a fuoco il microscopio con una mano, spostare il tavolino con l'altra, attivare il laser con il pedale e avere una visione chiara dell'immagine sullo schermo.

Tagliare i neuroni in un organismo delle dimensioni di un granello di sabbia può essere difficile. Per fare ciò, il laser deve essere strettamente focalizzato in tutte e tre le dimensioni. Inizia mettendo a fuoco il piano Z.

Spingere il filtro a densità neutra ND 16 per attenuare il laser durante la messa a fuoco per una messa a fuoco più precisa, spingendo sia i quattro filtri fluorescenti ND 16 che ND. Quindi, impostare il laser a micro punti su un impulso con la rotazione dell'interruttore per selezionare, quindi spostare la ruota portafiltri sul filtro barriera a passaggio lungo appropriato. Ora posiziona una diapositiva a specchio sul palco e concentrati sui fori di spillo al suo interno utilizzando l'obiettivo quattro volte e la luce trasmessa.

Una volta messa a fuoco, aggiungere una goccia di olio da immersione al vetrino e rimettere a fuoco i fori di spillo con l'obiettivo 100 volte. Quindi utilizzare la leva di commutazione del percorso ottico per aprire l'otturatore della fotocamera e aprire l'otturatore laser. Se si ottiene una messa a fuoco precisa, è difficile ridurre l'intensità della luce trasmessa in modo che i bordi del foro stenopeico siano nitidi.

Per testare la messa a fuoco, utilizzare il pedale per sparare il laser. Se il piano Z è correttamente a fuoco, dovrebbe apparire un piccolo foro nello specchio. Ora focalizza il microscopio leggermente sopra il piano del vetrino specchiato e spara con il laser. Di nuovo.

Questo dovrebbe fare un buco ancora più piccolo del primo colpo o non lasciare alcun segno. Gli stessi risultati dovrebbero essere visti mentre si mette a fuoco sotto la diapositiva specchiata. Tuttavia, se viene prodotto un foro più grande, rifocalizzare il laser con l'anello di messa a fuoco sulla testina di ablazione.

Infine, verificare che il foro sia ancora correttamente allineato con il mirino nell'oculare. Con un uso costante, la messa a fuoco del piano Z raramente deve essere regolata. Per mettere a fuoco il laser nel piano XY, praticare un altro foro nello specchio, quindi accedere al software in Nikon elements.

Avviare la modalità di acquisizione dal vivo nel menu di acquisizione. Nella barra degli strumenti di misurazione, selezionare l'editor ROI, selezionare lo strumento a doppia croce e trascinare il mirino per allinearli al centro del nuovo foro. Fai clic su Salva ROI, quindi esci dall'editor per riprendere l'acquisizione in tempo reale.

Per manipolare il tavolino con il mouse, attivare l'impostazione XY del mouse. Ora il laser è focalizzato. Ripristinare i filtri a densità neutra nella posizione originale e impostare gli impulsi laser da uno a 10 per un uso futuro.

Per prima cosa, preparare una soluzione di aros fuso al 3% in una soluzione M nove e versare circa cinque millilitri in una provetta da 50 millilitri. Posizionare il tubo in un bagnomaria a 55-65 gradi Celsius e conservare il resto per un uso futuro. Ora usa due diapositive coperte dall'etichettatura.

Fissa con del nastro adesivo un paio di vetrini puliti e una goccia di agarosio per creare un tampone dove possono essere posizionati i vermi. Dopo 30 secondi, gli aro avranno congelato la pipetta da tre a cinque microlitri di perle di polistirene da 0,05 a 0,1 micrometri sul tampone entro 10 minuti e disporranno rapidamente da cinque a 10 vermi transgenici sulle perle con un plettro di platino, in modo che i loro neuroni marcati siano facilmente visibili. Per evitare di danneggiare le viti senza fine, applicare con cura un vetrino coprinte standard sulle viti senza fine.

Facendolo scorrere. Il vetrino a vite senza fine è ora preparato per l'esecuzione di tassonomie. Utilizzando l'oculare, individuare i vermi sotto la potenza quattro volte la rimessa a fuoco con l'obiettivo 100 volte, spegnere la luce trasmessa, attivare la fluorescenza e cambiare il percorso ottico verso la fotocamera.

Usa il mouse per centrare il neurone sul mirino. Ora spara il laser con il pedale. La giusta quantità di potenza laser reciderà il neurone in uno o due impulsi.

Troppa potenza del laser causerà danni periferici o farà esplodere un foro nel verme per regolare la potenza del laser, spostare la piastra dell'attenuatore. Se il laser si indebolisce, la posizione della piastra dell'attenuatore può essere regolata per continuare a tagliare. Tuttavia, questa è probabilmente un'indicazione che il Kumar in quattro 40 nella cella D del laser deve essere sostituito se eseguito correttamente.

La tassonotomia laser produce una piccola rottura nel neurone. In alcuni casi, può formarsi una piccola cicatrice intorno al sito della lesione. Praticamente vengono tagliati da uno a tre neuroni per animale, ma non c'è un limite teorico.

Al termine, recuperare i vermi rimuovendo il vetrino coprioggetto con un movimento diretto verso l'alto, facendo attenzione che i vermi rimangano sul cuscinetto di rose agro. Non sfilare il vetrino coprioggetto. Usa una pinza ad ago per ritagliare il cuscinetto attorno ai vermi.

Posizionare il tampone su una piastra NGM appena seminata contenente OP 50 e liberare i vermi con 10 microlitri di M nine sterile. Tra le otto e le 48 ore dopo l'ex otomia, è possibile valutare la rigenerazione per fare ciò, rimontare i vermi sani su tre o cinque microlitri di perle di polistirene e visualizzare i loro neuroni nei neuroni recisi. Rimarrà un moncone neuronale distale al sito di taglio Sia il moncone distale che quello prossimale inizialmente si ritraggono dopo essere stati tagliati, ma la rigenerazione è prevista dal moncone prossimale.

La rigenerazione può essere valutata per la formazione di un cono di crescita. In alternativa, la lunghezza dei neuriti può essere tracciata e confrontata in genere tra il 60 e il 70% dei neuroni GABA che formano pettini di crescita entro 24 ore dal taglio. Se il laser non taglia correttamente, è probabile che il laser sia fuori fuoco o che il colorante nella cella di colorante debba essere sostituito.

Inoltre, se scopri che i vermi si muovono, probabilmente è perché il cuscinetto agros è troppo umido. Scopriamo che i cuscinetti devono essere lasciati per circa 30 secondi prima che i vermi vengano posizionati su di essi per aggirare questo problema. Inoltre, puoi provare a utilizzare microsfere di dimensioni più piccole per immobilizzare i vermi.

Infine, se scopri che gli assoni hanno un aspetto perlinato, è probabile che il cuscinetto agros sia troppo secco. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come configurare il sistema laser a micro punti. Monta i vermi per la tassonotomia, taglia i singoli neuroni e valuta la successiva rigenerazione.