In vivo Laser assotomia in C. elegans

L'obiettivo generale di questa procedura è tagliare con precisione i neuroni del CL mediante un laser in vivo. Questo risultato si ottiene assemblando il sistema di tassotomia e focalizzando, allineando e regolando con precisione la potenza del laser. Quando i vermi sono immobilizzati su un vetrino del microscopio, i loro neuroni possono essere tagliati con un controllo spaziale e temporale preciso.

L'estensione della rigenerazione dei neuroni recisi viene quindi misurata valutando la presenza di coni di crescita o tracciando la lunghezza dei neuriti. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il laser a femtosecondi, è che il laser a impulsi micro-puntuali è un sistema economico, facile da installare e mantenere, e facilmente adattabile a una vasta gamma di applicazioni, anche se di solito applichiamo questo metodo allo studio della rigenerazione dei neuroni motori GABAergici. Il sistema può inoltre essere utilizzato per ablare altri tipi cellulari, come muscoli cutanei o specifiche sinapsi neuronali.

Questo metodo richiede un sistema laser a micro punto. Il laser viene montato sul porto di fluorescenza in episcopia di un microscopio ottico e comprende un singolo elemento dicromatico abbinato al fluorocromo presente nelle cellule da tagliare, un generatore di impulsi e un pedale per il funzionamento del laser. Come minimo, il microscopio deve essere dotato di un obiettivo ad immersione in olio da 100 volte con apertura numerica 1,4 e di un obiettivo da 4 volte.

Disporre di un palchetto motorizzato con comando a joystick e montato su un tavolo antivibrante per l'illuminazione. Un'alimentazione luminosa con guida luminosa e un meccanismo a otturatore è collegata al laser micro punto. Il meccanismo a otturatore è utile per ridurre l'intensità dell'illuminazione in modo indipendente rispetto al laser.

Una telecamera collegata a un computer richiede una frequenza di acquisizione di almeno 16 hertz e deve funzionare correttamente con luce ridotta. Il computer richiede un software di acquisizione immagini, come Nikon Elements, per visualizzare i neuroni, controllare la telecamera e muovere lo stage motorizzato. Una volta assemblato completamente, l'utente può mettere a fuoco il microscopio con una mano, spostare lo stage con l'altra, attivare il laser tramite pedale e avere una visione chiara dell'immagine sullo schermo.

Tagliare i neuroni in un organismo delle dimensioni di un granello di sabbia può risultare impegnativo. Per ottenere questo risultato, il laser deve essere focalizzato con precisione in tutte e tre le dimensioni. Iniziare focalizzando il piano Z.

Inserire il filtro neutro ND 16 per attenuare il laser durante la messa a fuoco fine, inserendo sia il filtro ND 16 che i quattro filtri fluorescenti. Successivamente, impostare il laser a micro punto su un singolo impulso mediante l’interruttore di selezione, quindi spostare la ruota dei filtri sul filtro passa lungo appropriato. Posizionare ora un vetrino specchiato sul palchetto e mettere a fuoco i fori al suo interno utilizzando l’obiettivo 4x e la luce trasmessa.

Dopo aver messo a fuoco, aggiungere una goccia di olio di immersione sul vetrino e ripetere la messa a fuoco sui fori con l'obiettivo da 100 volte. Quindi utilizzare la leva di commutazione del percorso ottico per aprire l'otturatore della telecamera e aprire l'otturatore del laser. Se risulta difficile ottenere una messa a fuoco accurata, ridurre l'intensità della luce trasmessa in modo che i bordi del foro siano nitidi.

Per verificare il fuoco, utilizzare il pedale per sparare il laser. Se il piano Z è correttamente messo a fuoco, dovrebbe apparire un piccolo foro nello specchio. Ora mettere a fuoco il microscopio leggermente sopra il piano del vetrino specchiato e sparare nuovamente il laser.

Questo dovrebbe produrre un foro ancora più piccolo rispetto al primo impulso o non lasciare alcun segno. Gli stessi risultati dovrebbero essere osservati anche focalizzando al di sotto del vetrino riflettente. Tuttavia, se si forma un foro più grande, riconcentrare il laser utilizzando l'anello di messa a fuoco sulla testa di ablazione.

Infine, verificare che il foro sia ancora correttamente allineato con i reticoli nell'oculare. Con un uso costante, raramente è necessario regolare il fuoco nel piano Z. Per mettere a fuoco il laser nel piano XY, creare un altro foro nello specchio, quindi accedere al software in Nikon Elements.

Avviare la modalità di acquisizione in tempo reale nel menu acquisizione. Nella barra degli strumenti di misura, selezionare l'editor delle ROI, scegliere lo strumento a doppia croce e trascinare le linee incrociate per allinearle con il centro del nuovo foro. Fare clic su Salva ROI e quindi uscire dall'editor per riprendere l'acquisizione in tempo reale.

Per manipolare la piastra con il mouse, attivare l'impostazione XY del mouse. Ora il laser è focalizzato. Ripristinare i filtri neutri di densità alla posizione originale e impostare gli impulsi laser da uno a 10 per utilizzi futuri.

Preparare innanzitutto una soluzione di aros al 3% in soluzione M nine e versare circa cinque millilitri in un tubo da 50 millilitri. Porre il tubo in un bagno termico a 55-65 gradi Celsius e conservare il resto per un uso futuro. Utilizzare ora due vetrini ricoperti di etichettatura.

Attacca una coppia di vetrini puliti e una goccia di agarosio per creare un supporto su cui posizionare i vermi. Dopo 30 secondi, quando l'agarosio si sarà solidificato, pipettare da tre a cinque microlitri di microsfere di polistirene da 0,05 a 0,1 micrometri sul supporto entro 10 minuti e disporre rapidamente da cinque a dieci vermi transgenici sulle microsfere utilizzando un ago di platino, in modo che i neuroni marcati siano facilmente visibili. Per evitare di danneggiare i vermi, posizionare con cura un coprioggetto standard sui vermi.

Facendolo scorrere. La preparazione del vetrino è ora pronta per l'esecuzione delle analisi tassonomiche. Utilizzando l'oculare, localizzare i vermi con un ingrandimento di quattro volte, rifocalizzare con l'obiettivo a 100 volte, spegnere la luce trasmessa, accendere la fluorescenza e deviare il percorso ottico verso la telecamera.

Usare il mouse per centrare il neurone sul mirino. Ora attivare il laser con il pedale. La giusta potenza del laser reciderà il neurone in uno o due impulsi.

Un'eccessiva potenza del laser provocherà danni periferici o perforerà un foro nel verme; per regolare la potenza del laser, spostare la piastra attenuatrice. Se il laser diventa debole, è possibile regolare la posizione della piastra attenuatrice per mantenere il taglio. Tuttavia, ciò potrebbe indicare che la Kumar in quattro 40 nella cella D del laser deve essere sostituita quando l'operazione viene eseguita correttamente.

La tassotomia laser produce una piccola rottura nel neurone. In alcuni casi, può formarsi una piccola cicatrice intorno al sito della lesione. Praticamente da uno a tre neuroni vengono recisi per animale, ma non esiste un limite teorico.

Una volta terminato, recuperare i vermi rimuovendo il coprioggetto con un movimento diretto verso l'alto, avendo cura che i vermi rimangano sul tampone di agar rosa. Non far scivolare via il coprioggetto. Utilizzare pinzette a punta per tagliare il tampone intorno ai vermi.

Posizionare il tampone su una piastra NGM appena seminata contenente OP50 e liberare i vermi con 10 microlitri di M nine sterile. Tra otto e 48 ore dopo l'esecuzione della rigenerazione dell'exotomia, è possibile valutarla: reimpiantare i vermi sani su tre-cinque microlitri di microsfere di polistirene e visualizzare i loro neuroni nei neuroni recisi. Un moncone neuronale distale rispetto al sito di taglio rimarrà. Inizialmente, sia i monconi distali che prossimali si ritraggono dopo il taglio, ma ci si aspetta che la rigenerazione avvenga dal moncone prossimale.

La rigenerazione può essere valutata in base alla formazione di un cono di crescita. In alternativa, è possibile tracciare e confrontare la lunghezza dei neuriti, tipicamente tra il 60 e il 70% dei neuroni GABA forma coni di crescita entro 24 ore dalla sezione. Se il laser non taglia correttamente, è probabile che ciò sia dovuto a un fuori fuoco del laser o al fatto che il colorante nella cella del colorante necessita di essere sostituito.

Inoltre, se si osserva che i vermi si muovono, ciò è probabilmente dovuto al fatto che il tampone di agar è troppo umido. Riteniamo che sia necessario lasciare i tamponi per circa 30 secondi prima di posizionarvi i vermi, per evitare questo problema. In aggiunta, si può provare a utilizzare microsfere di dimensioni più piccole per immobilizzare i vermi.

Infine, se si osserva un aspetto a collana negli assoni, è probabile che ciò sia dovuto al fatto che il tampone di agarosio è troppo secco. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come configurare il sistema laser a micro punto. Montare i vermi per la tassotomia, tagliare singoli neuroni e valutare la successiva rigenerazione.