L'insulina per iniezione ed estrazione emolinfa per misurare la sensibilità all'insulina nei adulti Drosophila melanogaster

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare gli effetti dell'insulina iniettata sui livelli emolinfatici di glucosio in Drosophila melanogaster adulte. Questo viene ottenuto innanzitutto permettendo alle mosche digiune di ingerire una soluzione concentrata di glucosio. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'iniettare insulina nelle mosche alimentate con glucosio.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel raccogliere un campione di emo linfa non contaminato. L'ultimo passaggio della procedura è determinare la concentrazione di glucosio nell'emo linfa. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano come l'insulina esogena faciliti l'eliminazione del glucosio in Esof la Melan gaster mediante spettrometria.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il prelievo ematico mediante decapitazione di adulti, è che questa procedura minimizza il contenuto intestinale. Contaminazione del campione di emolinfa Raccogliere le mosche entro 24 ore dall'occlusione anestetizzandole con anidride carbonica umidificata. Separare le mosche femmine e collocarle in provette contenenti una dieta standard.

Lasciare invecchiare le mosche per 10 giorni. Dopo 10 giorni, trasferire le mosche in provette contenenti un tappo da cinque millilitri di aros al 2% e sottoporle a digiuno per 12-16 ore. Trasferire le mosche digiunate in provette contenenti carta da filtro imbevuta di glucosio al 10% per un'ora prima dell'iniezione di insulina; per preparare la soluzione di insulina da iniettare, sciogliere l'insulina bovina in soluzione salina tamponata al fosfato fino a una concentrazione finale di 0,01 milligrammi per millilitro.

Preparare anche una soluzione controllo contenente solo PBS. Aggiungere colorante alimentare blu sia alla soluzione di insulina che a quella di controllo fino a una concentrazione finale dello 0,5% e mantenere entrambe le soluzioni sul ghiaccio per tutta la durata della procedura. Arrotondare le punte degli aghi di vetro appena tirati premendoli attraverso un fazzoletto di carta Kim.

Per creare una punta robusta con un diametro del poro più grande, posizionare la punta arrotondata dell'ago rivolta verso l'alto in un microtubo contenente la soluzione di insulina o quella di controllo e lasciare che l'azione capillare riempia dall'interno gli aghi. Controllare ogni ago alla ricerca di bolle d'aria al microscopio stereoscopico e scartare quelli che non si sono riempiti uniformemente. Inserire gli aghi riempiti nel portaaghi del microiniettore manuale e posizionare il supporto mediante un micromanipolatore in modo che la punta dell'ago sia visibile attraverso il microscopio stereoscopico.

Applicare una pressione positiva sulla colonna di fluido all'interno dell'ago ruotando la manopola micrometrica collegata allo stantuffo della siringa microiniettrice. Toccare la punta dell'ago con un panno chimico per verificare che la pressione sia sufficiente al flusso del fluido. Una volta preparato l'ago per l'iniezione, fissare una tabella di calibrazione al suo fusto con del nastro trasparente e mettere a fuoco la punta dell'ago attraverso un microscopio stereoscopico con un ingrandimento di 20x.

Anestetizzare brevemente le mosche nutrite con glucosio con anidride carbonica umidificata e posizionarle su un cuscinetto di ghiaccio per mantenere l'anestesia al microscopio stereoscopico. Prendere una mosca con un paio di pinzette fini e tenerla vicino all'ago in modo che la punta sia adiacente alla regione anteriore del lato sinistro della mosca. Portare sia la punta dell'ago che il torace della mosca a fuoco.

Spostare delicatamente la mosca verso la punta dell'ago in modo che questa tocchi il centro della protuberanza della regione presunta sinistra della mosca. Continuare ad avanzare il torace della mosca sull'ago in modo che l'ago trafigga il centro della regione presunta. Applicare una pressione positiva avanzando lo stantuffo della siringa con la manopola del micromanipolatore del microiniettore fino a 0,1.

Sono stati iniettati microlitri di soluzione di insulina o di soluzione controllo nella mosca. L'iniezione conferirà un colore blu al lato sinistro della parte anteriore del torace. Lasciare le mosche iniettate a riprendersi in gruppi replicati in provette con agarosio al 2% per zero, 15 e 30 minuti prima dell'estrazione dell'emolinfa, quindi fissare un pezzo di nastro adesivo doppia faccia al tampone di anidride carbonica per il tempo necessario.

Anestetizzare il gruppo zero e disporre le mosche sul nastro con il lato dorsale rivolto verso il basso, in file ordinate e con le capsule cefaliche allineate. Una volta fissate le mosche al nastro, afferrare il probois di una mosca con pinzette fini e tirarlo delicatamente verso la regione ventrale e quindi posteriore, in modo da rendere visibile la parte anteriore della capsula cefalica. Mentre si mantiene il probois in posizione, perforare la capsula cefalica al di sopra della sutura lenale utilizzando un ago appuntito al tungsteno, avendo cura di non trapassare completamente il capo.

Dopo aver forato tutte le mosche, utilizzare un bastoncino di legno appuntito per esercitare una leggera pressione sull'addome della mosca. Questo provocherà la fuoriuscita di una piccola goccia di emolinfa nel punto di foratura del capo. Appoggiare l'estremità di un capillare microdose da un microlitro sulla goccia di emolinfa.

Determinare e registrare la quantità di emo linfa raccolta verificando la colonna di fluido all'interno del capillare graduato confrontandola con una tabella volumetrica, utilizzare uno spettrofotometro per rilevare l'assorbanza a 340 nanometri e determinare la concentrazione di glucosio; i drosophila trattati con la soluzione di insulina bovina hanno mostrato livelli ridotti di glucosio nell'emo linfa ai tempi di 15 e 30 minuti dopo l'iniezione rispetto ai drosophila iniettati con la soluzione di controllo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come iniettare piccoli volumi di soluzione in drosophila adulti, di come estrarre l'emo linfa da drosophila adulti e di come determinare la concentrazione di glucosio nell'emo linfa di drosophila adulti seguendo questa procedura.

Altri esperimenti, come la determinazione della concentrazione proteica e la determinazione della concentrazione di trigliceridi nell'emolinfa, possono essere condotti per rispondere a domande quali: come influisce l'insulina su aspetti correlati del metabolismo dei nutrienti in Drosophila adulte?