Name: Vivere Imaging calcio cella Combinato con il silenziamento del gene mediata siRNA Identifica Ca 2 + Canali di perdite nella membrana ER e nei relativi meccanismi regolatori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: Scopri l'imaging del calcio in cellule vive combinato con il silenziamento genico mediato da siRNA per identificare i canali di perdita di Ca²⁺ nel reticolo endoplasmatico e i meccanismi regolatori associati.

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SL è stato sostenuto da una borsa di studio dalla DFG (Scuola di Dottorato di Ricerca 845). Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della DFG (SFB 530/C1 &amp; PER 967) e da HOMFOR.

1. Preparazione delle soluzioni madre <ol><li> Preparare calcio senza Buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 0.5 mM EGTA, 10 mM glucosio in 10 mM HEPES-KOH, (pH 7,35)). </li><li> Solubilizzare FURA-2 AM in DMSO per ottenere una soluzione 1 mM magazzino. Mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è giallo chiaro omogeneo. Proteggere tazza dalla luce. Diluire il FURA-2:00 soluzione madre in 1 ml di Dulbecco modificato (DMEM) contenente 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina ad una concentrazione finale di 4 mM per il carico di cellule HeLa. </li><li> Preparare una soluzione puromicina 12,5 mM magazzino in acqua distillata (pH 7,0). Aliquote conservare a -20 ° C. Diluire la soluzione puromicina 12,5 mM magazzino nel calcio senza tampone ad una concentrazione finale di 500 mM puromicina. </li><li> Sciogliere thapsigargin in DMSO per ottenere un 1 Soluzione madre mM. </li><li> Solubilizzare 1 mg ophiobolin A in 20 microlitri cloroformio e, successivamente, mescolare con 25 microlitri di DMSO. La provetta rimane aperta fino al cloroformio è evaporato. Così il finale ophiobolin Una concentrazione è di 100 mm. Aliquote conservare a -20 ° C. Prima dell'uso, diluire soluzioni di riserva nel calcio senza tampone ad una concentrazione finale di 100 micron. Quindi, concentrazione finale di DMSO per l'imaging cellulare vivo non supera lo 0,1%. </li><li> Sciogliere trifluoperazina in DMSO ad una concentrazione di 10 mm e aliquote conservare a -20 ° C. Diluire le soluzioni stock in calcio senza tampone ad una concentrazione finale di 10 mM prima dell'uso. Così la concentrazione di DMSO finale per l'imaging cellulare dal vivo, come per ophiobolin A, non supera lo 0,1%. </li><li> Sciogliere il siRNA (SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA e siRNA di controllo) in acqua RNase libero di preparare una soluzione stock 20 mM. Mescolare con un vortice e osservare solubilizzazione ad occhio. Conservare aliquote di 50 microlitri a -20 ° C. </li></ol> 2. Silenziamento genico in cellule HeLa Per studiare il contributo di una certa proteina di ER Ca 2 + efflusso, il gene corrispondente deve essere efficacemente messo a tacere con due diversi siRNA (Fig. 1). Inoltre, l'effetto di silenziamento deve essere superato con l'espressione del gene corrispondente wild-type. Di solito si usa siRNA che sono diretti contro la codifica e non codificanti (UTR) regione, rispettivamente, del gene di interesse. Impiegando UTR-diretto siRNA fornisce un modo conveniente per complementazione. <ol><li> Semi di 5,2 x 10 5 cellule HeLa (ATCC no. CCL-2) in un piatto di cultura 6 cm con una scivolata 25 millimetri di copertura (pre-trattati con 200 ml di poli-L-lisina (1 mg / ml) per 1 h) in Dulbecco modificato (DMEM) contenente 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina e incubare a 37 ° C in ambiente umidificato con 5% di CO 2 (volume finale 3,9 ml). </li><li> Trasfezione delle cellule con siRNA SEC61A1, SEC61A1-UTR siRNA, o di un siRNA di controllo negativo utilizzando reagenti HiPerFect secondo le istruzioni del produttore (concentrazione finale di siRNA: 20 Nm). In breve, preparare siRNA fresco in un tubo da microcentrifuga prima della procedura di trasfezione reale: aggiungere 20 microlitri di reagente di trasfezione HiPerFect a 4 l di ogni siRNA (20 mM) che si dissolve in 80 ml di OptiMEM. Questo mix è leggermente agitazione orizzontale e incubate a temperatura ambiente per 10 min. Aggiungere il mix di siRNA (104 microlitri) goccia a goccia per la testa di serie 5,2 x 10 5 cellule HeLa (3,9 ml). </li><li> Dopo 24 ore, il cambiamento del mezzo (3,9 ml) e trasfezione le cellule per la seconda volta con la stessa miscela siRNA (104 microlitri). </li><li> Valutare silenziamento mediante analisi Western blot. Dovrebbe essere superiore all'80%. Lavare le cellule dal piatto di coltura cellulare in PBS (PBS) e raccoglierle in DMEM. Contare le cellule utilizzando Automated contatore di cellule contessa. Lisare le cellule in un tampone di lisi cellulare (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 mM MgCl 2, 0,5% NP40) integrato con un inibitore della proteasi cocktail (3 mg / ml pepstatina A, 3 g / leupeptina ml, 3 mg / ml antidolore, 3 g / Chymastatin ml) e mescolare con SDS-campione del buffer (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerolo, 5% β-mercaptoetanolo, 0.01% blu di bromofenolo ) per ottenere una concentrazione finale di 10.000 cellule / ml. Campioni di calore a 56 ° C per 15 minuti e, successivamente, aggiungere alcune perle vetro e vortex per 20 minuti al DNA frammento. Separare 20 l di ciascun campione da un Laemmli tipo SDS-PAGE (tipicamente 15% polyacrylamid per il gel di separazione). Trasferimento delle proteine ​​separate su una membrana PVDF da elettroblotting ("wet-blot") al costante 400 mA per 3 ore o durante la notte in buffer di trasferimento (100 mM Glicina, 12,5 mM Tris-HCl). Successivamente, blocco con il 5% (w / v) di latte magro secco in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente e poi esporre la macchia per l'anticorpo primario diretto contro il C-terminale della Sec61α da coniglio e un anti-β-actina- anticorpi di topo. Lavare la macchia in PBS-TritonX-100 (0,05%) e tWICE in PBS per 5 min, rispettivamente. Visualizza la anticorpi primari utilizzando ECL Plex di capra anti-IgG di coniglio-Cy5 o ECL Plex capra IgG anti-topo-Cy3-coniugato e il Typhoon-Trio sistema di imaging in combinazione con l'Immagine Quant TL software 7.0. Nel caso del gene SEC61A1, l'effetto di silenziamento massima è in genere visto 96 ore dopo la trasfezione prima. Un esperimento rappresentativo è mostrato in fig. 2. </li></ol> 3. Complementazione di cellule HeLa Al fine di salvare il fenotipo di SEC61A1 tacere, il cDNA SEC61A1 è stato inserito nel sito di clonazione multipla (MCS) di un pcDNA3-sito interno ingresso ribosomiale (IRES)-GFP-vettore che conteneva il citomegalovirus (CMV) promotore, la MCS, l'IRES, più la proteina fluoresecent verde (GFP) sequenza codificante. <ol><li> 48 ore dopo la trasfezione di siRNA primo cambio del mezzo (3,9 ml) per la seconda volta e trasformare le cellule sia con vettore vuoto o SEC61A1 plasmide di espressione utilizzando Fugene HD secondo il protocollo del produttore (rapporto finale del vettore per Fugene HD è di 4 mg vettore a 16 microlitri Fugene HD). In breve, preparare plasmidi fresco in un tubo da microcentrifuga prima della procedura di trasformazione: Aggiungere 16 microlitri di reagente Fugene trasformazione HD a 4 mg di ogni plasmide, che viene sciolto in 80 ml di OptiMEM. Delicatamente vortice questo mix e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Aggiungere il mix di plasmide (0,1 ml) goccia a goccia la testa di serie 5,2 x 10 5 cellule HeLa (3,9 ml). </li><li> Dopo 48 h di plasmide di espressione, piatti della cultura soggetti a microscopia a fluorescenza prima immagine del calcio e la raccolta. Se necessario sostituire DMEM da PBS per una migliore segnali di fluorescenza. Registrare immagini a fluorescenza su un microscopio a fluorescenza dotato di telecamera CCD raffreddata. L'efficienza della trasformazione può essere determinato dividendo il numero di cellule visualizzazione fluorescenza GFP dalle cellule contate in modalità campo chiaro e deve essere superiore a 80%. Un risultato tipico è mostrato in fig. 3. </li></ol> 4. Dal vivo delle cellule di imaging del calcio <ol><li> Prima della misura, trasferire la polizza di copertura rivestita con cellule HeLa transfettate in un apposito piatto 3,5 centimetri cultura. Caricare le cellule con 4 mM FURA-2 AM in 1 ml DMEM per 45 minuti a 25 ° C al buio 11,12. </li><li> Fissare a 25 vetrino mm nella camera di metallo iMic e lavare le cellule due volte e incubare in un calcio senza buffer (ogni volta 300 ul). </li><li> Iniziare a raccogliere dati su un microscopio iMic con policromi V alternativamente emozionante a 340 nm e 380 nm e la misurazione della fluorescenza emessa a 510 nm (Set di filtri: beamsplitter, 565 nm; emettitore, nm 605/70). Immagini campione contenente 20-50 cellule / fotogramma ogni 3 s. Record FURA-2 segnali come i rapporti F340/F380, dove F340 e F380 corrispondono allo sfondo-sottratto intensità di fluorescenza a 340 nm e 380, rispettivamente. </li><li> Dopo 1 min, il trattamento di cellule con puromicina (500 mM) di calcio senza buffer o con lo stesso buffer. In alternativa, il trattamento di cellule con un inibitore della molecola di piccole dimensioni (come 10 trifluoperazina mM o 100 mM ophibolin A) o con il calcio senza buffer. </li><li> Dopo le misurazioni raziometrico vengono effettuate per 2 o 10 minuti, aggiungere thapsigargin (1 mM) e continuare le misure. </li><li> Alla fine, cytoslic [Ca 2 +] è stimato in base a misure di rapporto con un metodo di taratura. 2 Analizzare i dati da Excel 2007 e Origin 6.1. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Finora abbiamo affrontato la questione se il silenziamento del gene SEC61A1 colpisce calcio (Ca 2 +) di dispersione dal pronto soccorso (Fig. 1). Il gene SEC61A1 è stato messo a tacere da due diversi siRNA in cellule HeLa per 96 ore. Mentre tacere la crescita delle cellule difficilmente colpiti e viabilità, trasporto delle proteine ​​nel ER di semi-permeabilizzate cellule è stata quasi completamente inibita. Inoltre, le cellule SEC61A1 tacere severamente colpite rispetto alla perdita di Ca 2 + dal pronto soccorso. L'effetto di silenziamento genico è stato invertito da espressione del gene SEC61A1. Così, Sec61 complessi che sono presenti nella membrana ER di tutte le cellule nucleate forma Ca + 2 canali di perdita che ci si può aspettare di giocare un ruolo cruciale nella omeostasi Ca 2 +. Tuttavia, la presenza di grandi pori pieni d'acqua con permeabilità agli ioni incontrollata, come formata da Sec61 complessi nella membrana ER, seriamente interferire con il rilascio regolato di Ca 2 + dal lume ER nel citosol, un meccanismo essenziale per intracellulare segnalazione. Abbiamo identificato un (CAM) calmodulina motivo vincolanti in citosolico N-terminale di Sec61α mammiferi che CaM legato ma non Ca 2 + senza apocalmodulin con affinità nanomolare e specificità di sequenza. A livello cellulare, due antagonisti CaM diverse stimolato Ca (Fig. 4 e 5). Quest'ultimo non è stata osservata quando Sec61 canali erano presenti quella contenuta mutazioni nel motivo QI di Sec61α. Così, Ca 2 +-CAM è coinvolta nel limitare la perdita di Ca 2 + dal pronto soccorso (fig. 6). <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagramma di flusso. Si veda il testo per i dettagli. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. L'analisi dei dati per far tacere l'efficienza. Silenziamento è stata valutata dalla Western-blot utilizzando anticorpi che erano diretti contro Sec61α e β-actina (controllo del carico). Gli anticorpi primari sono stati visualizzati mediante ECL anticorpi Plex secondaria e di imaging di fluorescenza. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. L'analisi dei dati per l'efficienza di trasfezione. Le immagini sono state registrate su un microscopio a fluorescenza dotato di telecamera CCD raffreddata. L'efficienza della trasformazione può essere determinato dividendo il numero di cellule visualizzazione fluorescenza GFP dalle cellule contate in modalità campo chiaro. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Le schermate Figura 4. Dalle immagini in diretta di calcio di cellule HeLa in presenza di controllo o SEC61A1-siRNA e la presenza o l'assenza del Cam-antagonista ophiobolin A. cellule HeLa sono state trattate con siRNA diretti contro SEC61A1 (B) o un siRNA di controllo negativo (A) per 96 h, come indicato. Queste cellule sono state caricate con l'indicatore di calcio FURA-2 AM e incubate in un buffer di Ca 2 + libero contenente 0,5 mM EGTA, poi buffer o ophiobolin A (Ophio A) in tampone è stato aggiunto e l'incubazione ripreso. Dopo 10 min, Ca 2 + rilascio è stato avviato applicando thapsigargin (TG) in assenza di esterni Ca 2 + e l'incubazione è stato continuato. Schermate dalle immagini di calcio continuo sono state prese nei tempi indicati. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. L'analisi dei dati per gli esperimenti dal vivo delle cellule di calcio di imaging. (A) Analisi cinetica e quantitativa di una serie di esperimenti come rappresentato nella fig. 4A. Cytoslic [Ca 2 +] è stato stimato dalle misure rapporto con un metodo di taratura 2. L'effetto di thapsigargin viene visualizzato come grafico a barre. (BD) Le cellule sono state trattate con siRNA di controllo o il indicate SEC61A1-siRNA per 48 ore e poi trasformato sia con controllo vettoriale (C), o SEC61A1 plasmide di espressione (C), o mutante SEC61A1 plasmide di espressione (D) come indicato. Dopo 48 ore, gli esperimenti di imaging del calcio sono stati effettuati come nelle figure 4 e 5A. L'analisi statistica delle variazioni del Ca 2 + citosolico concentrazione dopo l'aggiunta di thapsigargin in esperimenti come presentati in A sono mostrati. Valori di p &lt;0.001 sono stati definiti come significativi da spaiati t test e sono contrassegnati con tre asterischi (***), ns, non significativo. Il numero di cellule che sono state analizzate sono indicati. I valori medi sono dati, le barre di errore rappresentano gli errori standard dei mezzi (sem). Prendiamo atto che questi esempi sono stati adattati da rif. 13. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Questi dati indicano che il rilascio di catene nascenti dal complesso Sec61 porta infatti a rilasciare calcio dal ER e la formazione di un nanodomain calcio intorno alla bocca citosolica del complesso Sec61. Questo calcio è vincolato da calmodulina e calcio-calmodulina chiude il Sec61 complesso ".

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Nelle cellule dei mammiferi, il reticolo endoplasmatico (ER) svolge un ruolo chiave nella biogenesi delle proteine ​​come pure nella segnalazione di calcio. Qui, abbiamo descritto un sistema sperimentale che ci permette di affrontare direttamente il ruolo di un potenziale canale di Ca 2 + perdite e per la caratterizzazione dei meccanismi putativi normativo 13. Questo sistema sperimentale ci dà l&#39;opportunità uniche per i) valutare il contributo di diverse proteine ​​di membrana ER al passivo Ca 2 + efflusso dal pronto soccorso in vari tipi di cellule, ii) caratterizzare le proteine ​​e dei meccanismi che limitano il passivo Ca 2 + efflusso, e iii) studiare gli effetti delle mutazioni malattia legata a componenti rilevanti. Prendiamo atto che solo le cellule vitali dovrebbero essere analizzati e che la vitalità complessiva deve essere superiore a 80%. Pertanto, la vitalità cellulare è regolarmente valutato impiegando nucleare-ID blu / verde reagente vitalità cellulare secondo il protocollo del produttore. Inoltre, l&#39;analisi statistica delle variazioni di concentrazione citosolica Ca 2 + è obbligatoria. Pertanto, gli esperimenti devono essere effettuati per quattro diversi lotti di cellule e due coprioggetto con almeno 20 cellule devono essere analizzati per ogni condizione in un singolo esperimento. Prendiamo atto che i vari esperimenti devono essere effettuati allo stesso tempo dopo la semina sul coprioggetto.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> DMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 31966 </td></tr><tr><td> OptiMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 51985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td> Qiagen </td><td> 301707 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04709713 </td></tr><tr><td> Nucleare-ID Blu / Verde reagente vitalità cellulare </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ENZ-53004 </td></tr><tr><td> FURA, 02:00 </td><td> Invitrogen </td><td> F-1221 </td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma </td><td> P 7255 </td></tr><tr><td> Thapsigargin </td><td> Invitrogen </td><td> T-7459 </td></tr><tr><td> Un Ophiobolin </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ALX-270-109 </td></tr><tr><td> Trifluoperazina </td><td> Sigma </td><td> T 6062 </td></tr><tr><td> Contessa ® contatore di cellule automatizzato </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon-Trio sistema di imaging </td><td> GE Healthcare </td><td></td></tr><tr><td> TE2000-S microscopio con telecamera DS-5Mc </td><td> Nikon </td><td></td></tr><tr><td> microscopio iMic con policromi V </td><td> Fino Fotonica </td><td></td></tr></tbody></table>

vivere imaging calcio cella combinato con il silenziamento del gene mediata sirna identifica ca 2 + canali di perdite nella membrana er e nei relativi meccanismi regolatori

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Nelle cellule dei mammiferi, il reticolo endoplasmatico (ER) svolge un ruolo chiave nella biogenesi di proteine ​​e di calcio di segnalazione 1. Il eterotrimeriche Sec61 complesso nella membrana ER fornisce un percorso di soluzione acquosa di polipeptidi appena sintetizzati nel lume del ER. Recenti lavori di diversi laboratori hanno suggerito che questo complesso eterotrimerico può anche forma transitoria Ca 2 + perdite canali 2-8. L&#39;osservazione chiave di questo concetto era che il rilascio di polipeptidi nascenti dal ribosoma e Sec61 complessi puromicina porta a transitorio rilascio di Ca 2 + dal pronto soccorso. Inoltre, era stato osservato in vitro che al pronto soccorso del lume BiP proteina è coinvolta nella prevenzione della permeabilità agli ioni a livello del Sec61 complesso 9,10. Abbiamo stabilito un sistema sperimentale che ci permette di affrontare direttamente il ruolo del complesso Sec61 come potenziali canali Ca 2 + perdite e caratterizzare i meccanismi putativi regolamentazione 11-13. Questo sistema combina mediato silenziamento genico di siRNA e cellule vive Ca 2 + di imaging 13. Le cellule sono trattate con siRNA che sono diretti contro la codifica e la regione non tradotta (UTR), rispettivamente, del gene SEC61A1 o un siRNA di controllo negativo. Nell&#39;analisi di complementazione, le cellule sono co-transfettate con un IRES-GFP vettore che consente l&#39;siRNA resistente espressione del tipo selvatico SEC61A1 gene. Quindi le cellule vengono caricati con il raziometrico Ca 2 +-indicatore FURA-2 di monitorare simultaneamente cambiamenti del Ca 2 + citosolico concentrazione in un numero di cellule tramite un microscopio a fluorescenza. La misurazione continua del citosolico Ca 2 + permette anche la valutazione dell&#39;impatto dei vari agenti, come puromicina, piccole molecole inibitrici, e thapsigargin su Ca 2 + perdite. Questo sistema sperimentale ci dà l&#39;opportunità uniche per i) valutare il contributo di diverse proteine ​​di membrana ER al passivo Ca 2 + efflusso dal pronto soccorso in vari tipi di cellule, ii) caratterizzare le proteine ​​e dei meccanismi che limitano il passivo Ca 2 + efflusso, e iii) studiare gli effetti delle mutazioni malattia legata a componenti rilevanti.

Il reticolo endoplasmatico svolge un ruolo chiave nella biogenesi di proteine ​​e di omeostasi del calcio. Abbiamo stabilito un sistema sperimentale che ci permette di affrontare il ruolo di canali Ca2 + perdite e caratterizzare i meccanismi putativi regolamentazione. Questo sistema comporta silenziamento genico mediato siRNA e cellule vive Ca2 + imaging.

Vivere Imaging calcio cella Combinato con il silenziamento del gene mediata siRNA Identifica Ca 2 + Canali di perdite nella membrana ER e nei relativi meccanismi regolatori

Nelle cellule di mammifero, il reticolo endoplasmatico (ER) svolge un ruolo chiave sia nella biogenesi proteica che nella segnalazione del calcio1. Il complesso eterotrimerico Sec61...

Nelle cellule dei mammiferi, il reticolo endoplasmatico o RE svolge un ruolo importante nella biogenesi delle proteine e nella segnalazione del calcio. Il complesso eterotrimerico Sec61 presente nella membrana del RE fornisce un percorso acquoso per i polipeptidi appena sintetizzati verso il lume del RE. Dati recenti suggeriscono che Sec61 potrebbe anche formare canali di perdita transitori per il calcio, al fine di analizzare direttamente il ruolo del complesso Sec61 come potenziale canale di perdita del calcio.E per caratterizzarne i meccanismi regolatori ipotetici, le cellule vengono prima trattate con siRNA diretti contro il gene sex 61 A one. Nell'analisi di complementazione, le cellule vengono cotrasfettate con un vettore iris GFP che permette l'espressione resistente all'irna del gene di tipo selvatico sex 61 A one. Successivamente, le cellule vengono caricate con l'indicatore raziometrico del calcio RO two e le variazioni nella concentrazione citosolica di calcio vengono monitorate mediante microscopia a fluorescenza.Mentre vengono misurati i livelli di calcio, si effettuano cambiamenti della soluzione per valutare l'impatto di diversi agenti come antagonisti della calmodulina e fabi di argon sulla perdita di calcio. L'analisi quantitativa delle immagini ottenute rivela le variazioni nel flusso di calcio F indotte dall'abbattimento di sex 61 A uno. In questo video, verrà presentato un modello sul ruolo di sex 61 A uno nel flusso di calcio F a seguito della dimostrazione della procedura e della presentazione dei risultati.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come esperimenti con lipidi di pianeta o misurazioni su canale singolo, è che le proteine di membrana candidate possono essere analizzate nell'ambiente nativo e senza laboriose purificazioni e ricostituzioni funzionali tipicamente inefficienti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della segnalazione del calcio, ad esempio qual è il contributo di una specifica proteina della membrana del reticolo endoplasmatico al flusso di calcio dal reticolo endoplasmatico in diversi tipi cellulari e come viene regolato? A dimostrazione della procedura, interverranno Sway Long e NICO, due brillanti studenti laureati dei nostri laboratori. Iniziare la procedura preparando le soluzioni e i reagenti da utilizzare. Per prima cosa, preparare il buffer privo di calcio seguendo le istruzioni riportate nel protocollo scritto allegato.Successivamente, diluire una soluzione madre dell'indicatore del calcio. Diluire il fura 2 alle 2:00 del mattino in un millilitro di DMEM contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina, fino a una concentrazione finale di quattro micromolari. Diluire una soluzione madre di Apso Garin da un millimolare in un tampone senza calcio fino a una concentrazione finale di tre micromolari. Avere inoltre a disposizione oleina A a 200 micromolari e 20 micromolari per ridurre il rischio di studiare effetti fuori bersaglio di un particolare irna. Per silenziare ogni gene vengono utilizzati due diversi irna al fine di valutare possibili effetti collaterali della procedura di trasfezione.SiRNA di controllo negativo, composte da una sequenza casuale di nucleotidi, vengono trasfettate in parallelo con le siRNA sperimentali. È importante che l'effetto del silenziamento mediato da RNAi possa essere recuperato mediante l'espressione del DNA del tipo selvatico. Pertanto, le siRNA utilizzate per l'esperimento sono selezionate specificamente in modo che il plasmide di salvataggio non sia influenzato dalle siRNA. In questo esperimento, le siRNA sono dirette sia contro la regione codificante che contro la regione non codificante o regione non tradotta, abbreviata come UTR, del gene di interesse.Quando gli siRNA sono diretti contro il recupero dell'UTR, è possibile utilizzare plasmidi privi dell'UTR endogeno per eseguire la trasfezione in cellule HeLa. Preparare le cellule per la trasfezione posizionando un'ansa da 25 millimetri rivestita con polilisina in una piastra per colture cellulari da sei centimetri per ogni trasfezione; dopo un'ora, aggiungere 5,2 × 10⁵ cellule HeLa e DMEM integrato in ogni piastra. Per trasfettare le cellule, etichettare un tubo da microcentrifuga.Per ogni reazione di trasfezione, aggiungere a ciascun tubo quattro microlitri di S irna 20 micromolare disciolto in 80 microlitri di OptiMEM. SEC 61 A1, sex 61 A1 UTR e irna di controllo negativo vengono preparati in ciascun tubo. Aggiungere 20 microlitri di reagente di trasfezione Hyperfect, vortexare delicatamente, quindi incubare le reazioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Per trasfettare le cellule, aggiungere la miscela di irna (104 microlitri in totale) goccia a goccia sulle cellule Hela aderenti e agitare delicatamente la piastra per assicurare una distribuzione uniforme dei complessi di trasfezione.Incubare a 37 gradi Celsius in un ambiente umidificato con il 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo con 3,9 millilitri di mezzo fresco. Successivamente, per aumentare l'efficienza di trasfezione, eseguire una seconda trasfezione utilizzando la stessa miscela di irna; per valutare il silenziamento, effettuare un'analisi mediante western blot.L'effetto di silenziamento dovrebbe essere superiore all'80%, come mostrato qui per sex 61 A uno. L'effetto massimo di silenziamento è tipicamente osservabile 96 ore dopo la prima trasfezione, 48 ore dopo la prima trasfezione preparata per ripristinare il fenotipo risultante dal silenziamento di sex. 61, iniziare etichettando un nuovo tubo da microcentrifuga.Per ogni reazione, le cellule verranno ora trasfettate con un vettore vuoto oppure con un plasmide di espressione del tipo selvatico di sex 61 A. Il plasmide di espressione del tipo selvatico utilizzato in questo caso è stato ottenuto inserendo il cDNA di sex 61 A nel sito di clonaggio multiplo di un pcd.Un vettore GFP con tre elementi interni di entrata ribosomiale contenente il promotore del citomegalovirus, l'iris e la sequenza codificante per la proteina verde fluorescente. Preparare il reagente di trasfezione aggiungendo quattro microgrammi di ogni plasmide disciolti in 80 microlitri di Opti-MEM a ciascun tubo. Quindi aggiungere a questa miscela 16 microlitri di reagente di trasfezione FuGENE HD, vortexare delicatamente la soluzione e incubarla a temperatura ambiente per 10 minuti.Successivamente, dopo aver sostituito il mezzo, aggiungere la miscela di plasmidi in modo goccia a goccia alle cellule Heli, seminate a una densità di 5,2 volte 10 alla quinta, e agitare delicatamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme dei complessi di trasfezione. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per ulteriori 48 ore. Per determinare l'efficienza di trasfezione, valutare l'espressione di GFP mediante microscopia a fluorescenza.Dopo 48 ore, almeno l'80% delle cellule dovrebbe essere stato trasfettato. Prima dell'acquisizione delle immagini, utilizzare pinzette per trasferire i coverslip con le cellule HeLa trasfettate in una nuova piastra per colture cellulari da 3,5 centimetri e aggiungere un millilitro di DMEM con quattro micromolari.Se si è a 2:00 del mattino, incubare per 45 minuti a 25 gradi Celsius al buio. Per eseguire l'acquisizione delle immagini, trasferire il cover slip con il minor numero di cellule caricate in una camera di registrazione in metallo e fissarlo al suo posto avvitando insieme le due parti della camera. Utilizzando una pipetta, aggiungere e rimuovere 300 microlitri di tampone senza calcio sulle cellule per lavarle.Ripetere quindi montare la camera di registrazione su un microscopio I MIC con cinque crematore policromatico. Utilizzando un set di filtri per URA due, individuare un campo contenente almeno 20 cellule al fine di stimare la fluorescenza indipendente dal calcio di FU A due. La lunghezza d'onda di eccitazione utilizzata in questo passaggio è 360 nanometri.Una volta selezionato un campo adeguato, configurare il software di acquisizione immagini per eccitare a 340 nanometri e 380 nanometri e per misurare la fluorescenza emessa a 510 nanometri ogni tre secondi; impostare il tempo di esposizione in modo da ottenere intensità di fluorescenza intorno a 1000 unità arbitrarie per l'allestimento qui mostrato. Viene impostato un tempo di esposizione di cinque millisecondi. Inoltre, delimitare le regioni di interesse o ROI per una zona di fondo priva di cellule e fino a 20 contorni cellulari.Avviare l'acquisizione di immagini di cellule vive mentre l'esperimento è in corso; il sistema mostrerà le immagini raziometriche per due segnali, nonché i rapporti F340/F380 in tempo reale per ciascuna ROI marcata sotto forma di grafico a linee, dove F340 e F380 corrispondono all'intensità di fluorescenza all'interno delle ROI a 340 e 380 nanometri, rispettivamente. Dopo un minuto, aggiungere le soluzioni di prova alla camera di acquisizione per testare diversi parametri sperimentali. In questi esperimenti, l'antagonista della calmodulina, trifluoperazina e la bolina A, vengono testati dopo che le misurazioni raziometriche sono state effettuate per ulteriori 10 minuti.Per gli antagonisti modulari di CAL, aggiungere DSA gargan e proseguire le misurazioni. Registrare 400 coppie di immagini per ogni esperimento. Una volta raccolte le immagini, esaminarle e delimitare le aree di interesse (ROI) per almeno 20 cellule per ogni campo visivo.Successivamente, utilizzare l'opzione di analisi cinetica nel software per creare una sequenza di immagini di rapporto con sottrazione del fondo e un grafico che mostri la cinetica del rapporto calcio con sottrazione del fondo. Per ogni ROI, esportare infine i dati in Excel e Origin utilizzando un metodo di calibrazione consolidato. La concentrazione citosolica di calcio può essere calcolata a partire dalle misurazioni del rapporto per verificare se il gene sex 61 A influisce sulla perdita di calcio dal reticolo endoplasmatico.Il gene sex 61 A uno è stato silenziato mediante due RNA diversi nelle cellule helo per 96 ore. Il silenziamento è stato valutato mediante analisi Western blot di numeri simili di cellule in triplicato; come mostrato qui, si osserva un forte segnale 6 61 alpha nelle corsie da uno a tre e un segnale significativamente più debole nelle corsie da quattro a sei e da sette a nove, corrispondenti alle cellule in cui è stato silenziato il gene 6 61 A uno. Per quantificare i risultati, i segnali di sex 61 alpha sono stati normalizzati rispetto ai segnali di beta-actina: è stato ottenuto un silenziamento superiore all'80%. Tale risultato è stato utilizzato per verificare il ruolo della calmodulina nel flusso di calcio nel reticolo endoplasmatico.L'imaging URA due di cellule sessuali 61 A trattate con l'acido helo è stato eseguito in presenza o assenza dell'antagonista della calmodulina, Bollin A. Questo filmato mostra cellule di controllo trattate con Bollin A, 10 minuti dopo il trattamento con Bollin A. Il rilascio di calcio è stato avviato mediante applicazione di FSO Gargan, un inibitore circolare che ha rivelato il rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico in assenza di calcio esterno, come si può osservare qui.L'aggiunta di argon FSA ha provocato un aumento transitorio ma significativo della fluorescenza, indicativo di un flusso di calcio F dal reticolo endoplasmatico. Al contrario, il flusso di calcio F successivo all'aggiunta di garin FSO nelle cellule silenziose di sesso 61 A trattate con A ossea è molto meno pronunciato, come si può osservare qui. Questa differenza è chiaramente visibile in questo diagramma, che mostra il calcio citosolico stimato nel tempo in una serie di filmati; i risultati quantitativi mostrati qui confermano un aumento del flusso di calcio nelle cellule di controllo in risposta all'argon thic in presenza di bolin A, come evidenziato in questo istogramma.Lo stesso fenomeno è stato osservato per un secondo triazina antagonista di cam. Tuttavia, gli effetti degli antagonisti di cam non sono stati evidenziati quando il complesso sex 61 è stato eliminato dalle cellule mediante uno dei due sex. 61 Un parziale recupero di questo fenotipo può essere osservato quando cellule silenziose per sex 61 A sono state trasfettate con sex.61 un plasmide di espressione singola, come si può vedere qui. La risposta del calcio al calcio-modulina in seguito a agonisti della calmodulina viene parzialmente ripristinata con la trasfezione del plasmide di tipo selvatico insensibile all'irna. Questi risultati suggeriscono che la calmodulina è coinvolta nel limitare il flusso di calcio nel reticolo endoplasmatico a livello del complesso a sex 61 nelle cellule.Se così fosse, la trasfezione di sex, 61 A un gene con una doppia mutazione nel sito di legame della calmodulina non dovrebbe ripristinare il fenotipo indotto dall'irna. Effettivamente, quando le cellule sono state trasfettate utilizzando un plasmide di espressione di sex 61 A uno con una doppia mutazione nel motivo IQ, non si è verificato alcun ripristino del fenotipo considerato nel complesso. Questi dati indicano che il rilascio delle catene nascenti dal complesso sex 61 determina effettivamente il rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico e la formazione di un nano-dominio di calcio attorno all'apertura citosolica del complesso sex 61.Questo calcio viene legato da Cal Moulin e il complesso calcio-Cal Moulin chiude il complesso Sex 61. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come combinare il silenziamento genico mediato da asIRNA in cellule umane con l’imaging del calcio intracellulare seguendo questo protocollo. Altri metodi, come l’espressione di cDNA con mutazioni associate a malattie, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, come l’impatto potenziale di mutazioni legate a malattie in componenti cellulari rilevanti.E non dimenticare che lavorare con farmaci come il tap, ancora una volta, può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come l'uso di guanti, devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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