Misura della coesione aggregata da parte del tessuto superficiale Tensiometry

Questa procedura illustra come misurare la resistenza della coesione intracellulare in tessuti tridimensionali simili ad aggregati. Il primo passo consiste nel generare aggregati sferici simili a tessuti e trasferirli in una piastra di Petri riempita con mezzo di coltura tissutale. Successivamente, singoli aggregati vengono aspirati in una pipetta di pasta e caricati nella piastra di compressione inferiore della camera del tensiometro.

Successivamente, la piastra di compressione superiore viene collegata a un filo di nichel-cromo, che la connette alla bilancia elettronica e stabilisce un peso di riferimento zero denominato F zero. L'esperimento viene avviato sollevando la piastra di compressione inferiore fino a quando l'aggregato viene compresso tra le piastre di compressione inferiore e superiore, e termina quando gli aggregati raggiungono l'equilibrio di forma e forza, o FEQ. Gli ultimi passaggi della procedura consistono nell'acquisire immagini, misurare la geometria dell'aggregato e la forza di resistenza, e inserire tali misurazioni nell'equazione di Young-Laplace.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano variazioni nella coesione dei tessuti e come queste potrebbero influenzare la dispersione tumorale o il posizionamento spaziale tra diverse popolazioni cellulari, rispettivamente tramite saggi di diffusione degli aggregati o saggi di separazione cellulare. Pertanto, questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia tumorale, dello sviluppo embrionale e dell'ingegneria tissutale, come ad esempio: in che modo la coesione tumorale influenza l'invasione maligna e la stratificazione dei foglietti germinativi durante la gastrulazione?

O come possiamo effettivamente ingegnerizzare la coesione per generare strutture simili a organi funzionali in vitro? Le manipolazioni sperimentali che prevedono la coltura di cellule vive devono essere eseguite in condizioni asettiche all'interno di una cappa a flusso laminare dedicata. È necessario utilizzare soluzioni sterili e materiali sterili per il laboratorio durante tutta la procedura. Per iniziare questo esperimento, raccogliere le cellule aderenti al 90% di confluenza.

Prima, aspirare il terreno di coltura e risciacquare il letto cellulare due volte con PBS. Quindi, aspirare il PBS e pipettare due millilitri di tripsina 0,05% in soluzione di EDTA sul monolayer. Posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e incubare fino al distacco delle cellule.

Successivamente, rimuovere la piastra dall'incubatore e arrestare l'azione aggiungendo due millilitri di mezzo completo. Utilizzare la pipetta da cinque millilitri per risospendere la miscela fino a quando le cellule non sono completamente in sospensione. Trasferire quindi la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri.

Pipettare 40 microlitri di una soluzione di DNA a 10 milligrammi per millilitro nella sospensione cellulare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, vortexare brevemente la sospensione cellulare e quindi centrifugare a 200 ×g per cinque minuti. Una volta completata la centrifugazione, aspirare il sopranatante e scartarlo. Successivamente, risospendere il pellet in un millilitro di mezzo completo e ripetere la centrifugazione per lavare Reese.

Sospendere il pellet in un millilitro di mezzo completo, quindi eseguire un conteggio cellulare e, se necessario, aggiustare la concentrazione della sospensione cellulare a 1 × 10⁶ cellule per millilitro con mezzo completo, utilizzando una pipetta. Aggiungere tre millilitri di sospensione cellulare in un flacone rotondo da 10 millilitri e incubare in un bagnomaria agitato a 37 °C e 5% di anidride carbonica per quattro ore a 120 rotazioni al minuto, fino al recupero delle cellule dall'ionizzazione, indicato dall'adesione delle cellule tra loro a formare piccoli aggregati.

Successivamente, trasferire le cellule in un tubo conico in vetro e centrifugare a 200 ×g per quattro minuti per formare un sottile strato dopo la centrifugazione. Allentare il cappuccio del tubo per consentire lo scambio gassoso e quindi posizionare il tubo nell'incubatore per colture cellulari. Incubare per 24 ore, dopo le quali lo strato dovrebbe diventare coerente.

Dopo 24 ore, agitare delicatamente il tubo da centrifuga per staccare il foglietto. Quindi versare il contenuto del tubo di coltura in una piccola piastra sterile in vetro per colture cellulari. Utilizzare bisturi microchirurgici per tagliare il foglietto cellulare in frammenti di diverse dimensioni, quindi trasferire i frammenti in un matraccio rotondo da 10 millilitri contenente tre millilitri di mezzo di coltura tissutale.

Incubare i frammenti a 37 gradi Celsius nel bagnomaria agitato a 120 rotazioni al minuto sotto il 5% di anidride carbonica per due o tre giorni o fino a quando diventano sferici. La formazione di aggregati può essere eseguita anche mediante il metodo della goccia sospesa. Secondo il protocollo precedentemente pubblicato, il dispositivo TENSIOMETRO o TST per la superficie del tessuto è costituito dalla camera principale del tensiometro contenente la cella di compressione, un bagnomaria per mantenere la temperatura della camera, un microscopio stereoscopico dotato di una telecamera CCD, una bilancia elettronica per auto con alimentatore e un registratore grafico.

La cella di compressione del TST è composta da due camere, una camera esterna e una camera interna. La camera interna contiene la piastra superiore di compressione e la piastra inferiore rivestite in poli(2-idrossietil metacrilato). Innanzitutto, impostare la pompa di circolazione dell'acqua a 37 gradi Celsius e assicurarsi che i tubi siano collegati ai porti sulla camera esterna.

Quindi avvitare il gruppo inferiore, utilizzato per sollevare l'aggregato e avviare la compressione nella base della camera interna. Successivamente, preparare un tratto di filo di nichel-cromo raddrizzato con la fiamma appendendo prima un tratto di filo lungo 15 pollici a un supporto per beuta e fissando una graffetta piccola all'estremità. Quindi passare un becco Bunsen lungo il filo, muovendolo avanti e indietro finché il filo non diventa incandescente.

Utilizzare un paio di tronchesine per tagliare il filo dritto alla lunghezza appropriata. Quindi utilizzare due lame di rasoio per piegare il filo a circa un quarto di pollice dalla fine, formando un piccolo gancio. Infine, riempire la camera interna del TST con un mezzo di coltura tissutale indipendente dal biossido di carbonio, che è stato sottoposto a degasaggio mediante incubazione a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Utilizzare una pipetta EPA per rimuovere eventuali bolle d'aria formatesi sulla piastra di compressione inferiore. L'apparato TST è ora pronto per l'esperimento di compressione dell'aggregato. Utilizzare una pipetta APA per aspirare un aggregato cellulare di 200-300 micron dalla piastra di coltura.

Quindi espellere delicatamente l'aggregato sulla piastra di compressione inferiore nella camera interna dell'apparecchio TST. Posizionare l'aggregato il più vicino possibile al centro della piastra di compressione inferiore spostandolo con delicatezza mediante un tubo capillare dotato di un piccolo cappio di pelo. Collegare il filo di nichel-cromo all'assieme della piastra al braccio della bilancia dell'elettrobilancia registratrice Can Venton modello 2000.

Regolare la posizione della bilancia fino a quando le piastre di compressione superiore e inferiore sono parallele e direttamente allineate una sopra l'altra. Attendere che la piastra superiore si stabilizzi. Quindi azzerare il registratore grafico rispetto al peso di riferimento stabilito.

Utilizzare il microscopio stereoscopico dotato di telecamera CCD per acquisire un'immagine dell'aggregato non compresso. Successivamente, regolare l'altezza dell'apparato del nucleo interno per controllare il grado di compressione desiderato, quindi sollevare la piastra di compressione inferiore fino a quando l'aggregato viene compresso contro la piastra di compressione superiore. Utilizzare il microscopio stereoscopico dotato di telecamera CCD per monitorare la compressione e acquisire immagini dell'aggregato, come quella mostrata qui.

Registrare continuamente la variazione apparente del peso della piastra superiore di compressione su un registratore cartografico a striscia per tutta la durata della compressione, fino al raggiungimento della forma desiderata. L'equilibrio è indicato dal livellamento dell'uscita di tensione del bilanciamento della provetta. Utilizzare nuovamente il microscopio stereoscopico dotato di telecamera CCD per acquisire un'immagine dell'aggregato compresso.

Questa immagine verrà utilizzata per misurare la geometria dell'aggregato. Dopo aver acquisito l'immagine, abbassare la piastra di compressione per decomprimere l'aggregato e misurare la forza di compressione all'equilibrio. Leggere il tracciato del registratore grafico come la differenza tra la forza misurata subito prima della decompressione dell'aggregato e la linea di base zero stabilita. Ripetere il processo utilizzando un diverso grado di compressione per determinare l'equilibrio della forza questa volta.

Misurare la forza compressiva e la geometria all'equilibrio della forza e applicare queste misurazioni insieme alle misurazioni relative all'equilibrio di forma all'equazione di Young-Laplace per generare valori numerici della tensione superficiale apparente del tessuto. Secondo le istruzioni riportate nel protocollo scritto, questa tabella mostra le misurazioni della tensione superficiale del tessuto e la conferma della liquidità degli aggregati per aggregati di prostata di ratto, fibroblasti e cellule muscolari lisce. Gli aggregati di cellule fibroblastiche della prostata di ratto presentano una tensione superficiale di 22,8 ± 1,1 dine/cm.

Inoltre, i valori medi della tensione superficiale misurati dopo la prima compressione e dopo la seconda compressione erano statisticamente identici quando confrontati mediante un test T accoppiato. Abbiamo inoltre confrontato i rapporti tra sigma due e sigma uno e tra F due e F1 per assicurarci che questi aggregati non seguano la legge di Hooke, come accadrebbe se si comportassero come solidi elastici, come dimostrato nella tabella uno. Il rapporto tra sigma due e sigma uno effettivamente si avvicina a uno.

Inoltre, il rapporto tra F due e F1 era significativamente maggiore rispetto al rapporto tra sigma due e sigma uno, confermando ulteriormente che questi aggregati non obbediscono alla legge di Hooke e in realtà si comportano come liquidi. Al contrario, come evidente nella tabella uno, il rapporto tra sigma due e sigma uno delle cellule muscolari lisce della prostata del ratto è significativamente maggiore di uno e non differisce statisticamente dal rapporto tra F due e F1. Per dimostrare ulteriormente un comportamento simile a quello di un liquido, abbiamo esplorato la relazione tra tensione superficiale e volume dell'aggregato, come mostrato qui. Il volume è indipendente da sigma per le cellule RPF, come rappresentato dalla linea di regressione rossa, mentre sembra esserci una certa dipendenza di sigma dal volume per le cellule muscolari lisce della prostata del ratto, come rappresentato dalla linea di regressione blu.

Questi dati confermano ulteriormente che gli aggregati di fibroblasti prostatici del ratto si comportano in maniera simile a un liquido, mentre quelli delle cellule muscolari lisce prostatiche del ratto sembrano comportarsi più come solidi elastici. Pertanto, dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo embrionale, dell'invasione maligna e dell'ingegneria tissutale per esplorare il ruolo della coesione tissutale nella formazione di compartimenti e confini tra diversi tipi cellulari durante lo sviluppo degli strati germinativi embrionali, durante l'interazione tra cellule stromali tumorali e nel riarrangiamento delle cellule delle insule pancreatiche in diversi modelli animali, inclusi anfibi, teleostei, uccelli e modelli umani.